Questo metodo biochimico consente la determinazione dello stato di palmitoilazione di qualsiasi proteina di membrana espressa nel cervello per la quale è disponibile un anticorpo adatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la purificazione dell'affinità e utilizza invece cambiamenti nella mobilità del gel per determinare il numero di modifiche di una proteina di interesse. Dopo aver sezionato il cervello, omogeneizzarlo immediatamente in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio.
Usando circa 12 colpi, centrifuga i lisati per 15 minuti a 1400 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo sul ghiaccio. Rimescolare il pellet in 10 millilitri di tampone di omogeneizzazione.
Omogeneizzarlo usando circa sei tratti. Centrifugare la sospensione a 710 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Combina i supernatanti e centrifugali a 40.000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare la frazione di membrana pelletata in un tampone di omogeneizzazione rompendo il pellet con una punta di pipetta e tubazione su e giù. Eseguire il test ABCA per quantificare i livelli proteici. Per eseguire il test APEGS, posizionare 470 microlitri di tampone A in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere circa 100-200 milligrammi di proteine.
Sonicare il tubo e quindi separare la proteina insolubile centrifugando il tubo a 25 gradi Celsius e un minimo di 13.000 volte G per 10 minuti. Trasferire la proteina solubalizzata in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. In primo luogo, interrompere i legami del disolfuro incubando la proteina solubalizzata in 25 microlitri di TCEP per 60 minuti a 55 gradi Celsius.
Quindi, bloccare le cisteine libere incubando la soluzione con 12,5 microlitri della soluzione stock di NEM per tre ore a temperatura ambiente. Quindi, iniziare il processo di precipitazione del metanolo cloroformio. Trasferire la soluzione proteica dal tubo da 1,5 millilitri a un tubo di polipropilene o vetro che può essere centrifugato in un rotore a secchio oscillante a velocità modesta.
Aggiungere brevemente due millilitri di metanolo e vortice. Aggiungere brevemente un millilitro di cloroformio e vortice. Quindi aggiungere di nuovo brevemente 1,5 millilitri di acqua deionizzata e vortice.
Se necessario, invertire il tubo per garantire una miscelazione accurata. Centrifugare i campioni a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 30 minuti in un rotore a secchio oscillante. Rimuovere e scartare con cura la fase superiore della soluzione in un tubo.
Aggiungere 1,5 millilitri di metanolo. Mescolare delicatamente ma accuratamente con una delicata inversione del tubo, facendo attenzione a non frammentare il pancake proteico opaco. Centrifugare il campione a 3000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti in un rotore a secchio oscillante.
Utilizzando una pipetta sierologica in vetro, rimuovere il più possibile la fase superiore della soluzione senza disturbare il pancake proteico. Risciacquare con cura il pellet con un millilitro di metanolo e lasciare asciugare all'aria per almeno 10 minuti. Con la precipitazione del metanolo cloroformio completa, iniziare la scissione dei collegamenti palmitoil tioestere rimescolando il precipitato proteico in 125 microlitri del tampone A.Trasferimento in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Sonicare brevemente il tubo e quindi centrifugarlo a 13.000 volte G o superiore e 25 gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere il materiale insolubile. Trasferire la proteina solubalizzata in nuovi tubi da 1,5 millilitri e aggiungere 375 microlitri di tampone H o tampone T.Dopo aver incubato i campioni per 60 minuti a temperatura ambiente, ripetere la precipitazione del metanolo cloroformio. Per aggiungere m-PEG alle cisteine non protette, iniziare riutilizzando il pellet in 100 microlitri di tampone A contenenti 10 mil o più TCEP.
Quindi trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di soluzione m-PEG 5K di serie e mescolare mediante pipettazione. Incubare a temperatura ambiente con rotazione end-over-end.
Dopo 60 minuti di incubazione, rimuovere m-PEG 5K non incorporato eseguendo nuovamente la precipitazione del metanolo cloroformio. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura la fase superiore come prima, evitando il pancake denso e flocculento.
Aggiungere un millilitro di metanolo e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante e risciacquare il pellet con un millilitro di metanolo.
Ancora una volta, centrifuga a più di 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver asciugato all'aria il pellet, riprenorlo in 50 microlitri di tampone A senza TCEP o qualsiasi agente riducente. Riservare 5 microlitri della soluzione per la quantificazione delle proteine BCA.
Dopo la quantificazione, aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 4x Laemmli. Caricare il campione in un gel di pagina SDS. Utilizzare protocolli standard di trasferimento e rilevamento della separazione per l'blotting occidentale.
Per studiare lo stato di palmitoilazione delle proteine SynDIG, le frazioni di membrana P2 provenienti da cervelli di topo omogeneizzati sono state sottoposte al test APEGS. La separazione e il sondaggio con gli anticorpi hanno dimostrato che SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 e Prrt2 sono palmitoilati nel cervello del topo. Lo scopo della precipitazione del metanolo cloroformio è quello di impedire a una sostanza chimica, come il NEM, di interferire con la fase successiva del protocollo.
Una corretta precipitazione del metanolo cloroformio rimuoverà le sostanze chimiche indesiderate riducendo al minimo la perdita di proteine. Questo metodo può essere applicato ai lysati cerebrali di topi di età diverse o provenienti da diverse regioni cerebrali per indagare le normative spazio-temporali della palmitoilazione.
