L'endocitosi della vescicola nella citoplasia provoca la formazione di vescicole intracellulari. La permeabilizzazione della vescicola attiva varie vie del segnale. L'inattivazione laser assistita da cromofori viene utilizzata per studiare le conseguenze della rottura della vescicola intracellulare.
Un controllo spaziale e temporale del danno subcellulare alle vescicole intracellulari può essere ottenuto regolando le condizioni erette e l'illuminazione della luce. Per iniziare, mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrata con 10% FBS. Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule.
Quindi risospendere le cellule in DMEM integrate con 10% FBS. Diluire 300 nanogrammi di plasmide Gal3-GFP in 25 microlitri di terreno sierico ridotto. Quindi aggiungere 0,6 microlitri di reagente P3000.
E mescolare delicatamente, seguito da vortice la soluzione. Diluire 0,45 microlitri di reagente Lipofectamine 3000 in 25 microlitri di mezzo sierico ridotto e mescolare delicatamente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver miscelato la miscela di DNA lipofectamina, 300.000 cellule HeLa sospese e 200 microlitri di DMEM con il 10% di FBS, seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un piatto di vetro da 35 millimetri. Per consentire l'attaccamento delle cellule, incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica per almeno quattro ore.
Diluire AlPcS2a in DMEM integrato con 10% FBS per ottenere una soluzione di AlPcS2a monomolare. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS2a a bagnomaria a 37 gradi Celsius e sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS2a. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore fornito con il 5% di anidride carbonica durante la notte.
Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare dopo aver sostituito il mezzo con terreno fresco. Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi. Per manipolare le singole cellule danneggiando i lisosomi, posizionare il piatto di coltura sul palcoscenico di un microscopio confocale.
Utilizzare i laser a 488 nanometri e 561 nanometri per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente. Cerchia una regione quadrata di cinque per cinque micrometri di interesse sulle vescicole etichettate AlPcS2a che sono selezionate per essere danneggiate. Quindi l'impulso illumina la regione di interesse con un laser a 633 nanometri da 0,21 milliwatt o 70 ripetizioni.
Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale. La colorazione lisosomiale con AlPcS2a nelle cellule HeLa è stata eseguita utilizzando marcatori disponibili in commercio ed è stata colorata positivamente con colorante fluorescente verde. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-Galectin3 sono stati colorati con AlPcS2a.
Seguita dalla focalizzazione dell'illuminazione con luce nel vicino infrarosso, i risultati indicano che l'inattivazione laser assistita da cromofori basata su AlPcS2a è stata in grado di controllare la rottura lisosomiale locale all'interno della regione di interesse, lasciando intatto il resto dei lisosomi. Questo passaggio è importante perché il tempo di incubazione determinerà gli endosomi o i lisosomi in piedi. Ad esempio, le persone possono determinare la dimensione di dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana.
Inoltre può utilizzare coloranti sensibili al pH come il destrano FITC per differenziare endosomi e lisosomi. Questa tecnica è utile per iniziare gli effetti a valle della rottura della membrana della vescicola intracellulare. E ci sono effetti a valle in varie situazioni.
