Questo protocollo è progettato per studiare il crosstalk delle cellule epiteliali e delle cellule immunitarie innate di prima linea, in particolare le cellule T innate, che è il nostro interesse. Le cellule primarie provenienti da fonti umane sono utilizzate in questa tecnica, consentendo l'indagine individuale del crosstalk fisiologico rilevante per ciò che sta accadendo negli esseri umani. Le cellule T innate sono state implicate nel miglioramento della sopravvivenza dei pazienti con infezione da influenza.
Sapere come vengono attivati potrebbe aiutare a sviluppare una terapia anti-influenzale e antivirale. Questo metodo è progettato per identificare i fattori che possono attivare le cellule T innate, che possono aiutare a sviluppare misure preventive contro l'infezione da virus respiratorio. Al giorno zero, infettare le cellule epiteliali nasali umane o HNEC.
In primo luogo, contare le cellule aggiungendo 150 microlitri di 1x tripsina EDTA alla camera apicale dell'inserto di membrana e 350 microlitri di 1x tripsina EDTA alla camera basale del pozzo rappresentativo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando le cellule si staccano dalla membrana. Lavare le cellule sulla membrana tubando su e giù e raccogliere la sospensione in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri.
Aggiungi 200 microlitri di DMEM per spegnere l'attività della tripsina. Quindi, conta le cellule tramite la colorazione blu trypan. Calcola la molteplicità richiesta di infezione, o MOI, del virus in base al conteggio delle cellule per pozzo.
Diluire lo stock di virus di conseguenza con RPMI completo sul ghiaccio. Per i restanti pozzetti per l'esperimento di infezione, aggiungere un DPBS 1x nelle camere apicali degli inserti di membrana. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti e rimuovere il DPBS 1x.
Cambiare il mezzo basale negli inserti a membrana per completare il mezzo RPMI trasferendo gli inserti su una nuova piastra con RPMI completo aggiunto ai pozzetti. Aggiungere l'inoculo virale preparato nella camera apicale dell'inserto di membrana. Incubare a 35 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per un'ora e rimuovere l'inoculo virale dalla camera apicale.
Cambiare il mezzo basale dell'inserto della membrana in mezzo RPMI fresco e incubare a 35 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per 24-72 ore. Seminare il numero richiesto di cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, in mezzo RPMI completo aggiungendo direttamente la sospensione PBMC nella camera basale di ciascun pozzetto di HNEC infetti dal giorno zero. Incubare a 37 gradi Celsius per 24-48 ore.
Per raccogliere il surnatante apicale, aggiungere 1x DBPS a ciascuna camera apicale e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, raccogliere il DPBS in tubi da 1,5 millilitri. Aliquotare il surnatante per il saggio della placca in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e congelare immediatamente sia il calcio che le aliquote a meno 80 gradi Celsius.
Per raccogliere HNEC in forma di RNA, trasferire l'inserto della membrana in un pozzo pulito. Aggiungere il tampone di lisi dell'RNA alla camera apicale e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Raccogliere il surnatante in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA per l'analisi molecolare.
Infine, raccogliere i PBMC raschiando delicatamente la superficie del pozzo con l'ampia base di una punta di pipetta sterile per rimuovere i PBMC attivati che possono essere aderenti alla superficie del pozzo. Raccogliere il mezzo basale contenente PBMC in un tubo di centrifuga da due millilitri. Lavare i pozzetti due volte con 300 microlitri di 1x DPBS e raccogliere il lavaggio nello stesso tubo da due millilitri.
Centrifugare il tubo da due millilitri e raccogliere il surnatante in un tubo fresco da due millilitri senza disturbare il pellet cellulare. Conservare il surnatante aspirato a meno 80 gradi Celsius per l'analisi delle citochine e delle chemochine. Risospesciare il pellet di cella rimanente in 200 microlitri da 1x DPBS.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le cellule T innate a seguito di infezione influenzale senza la necessità di cellule epiteliali e immunitarie dello stesso donatore. Un esempio della progressione prevista degli HNESPC man mano che crescono sullo strato di alimentazione 3T3 è mostrato qui. Questi sono stati utilizzati per la differenziazione nella coltura dell'interfaccia aria/liquido per ottenere HNEC multistrato con cellule funzionali, ciliate e caliciformi.
Utilizzando gli HNEC, l'attivazione innata delle cellule T può essere studiata utilizzando la citometria a flusso. Questi risultati mostrano il rilevamento di cellule T invarianti associate alla mucosa, o cellule MAIT, V delta uno, cellule T gamma delta e cellule T natural killer o NKT. Queste cellule sono state significativamente aumentate in co-coltura che coinvolge HNEC infettate dal virus dell'influenza.
Questa configurazione può quindi essere applicata ad altri ceppi di virus influenzali o popolazioni di cellule immunitarie innate per osservare la loro rispettiva attivazione in condizioni di co-coltura con cellule epiteliali infette. Il calcolo accurato del numero di cellule epiteliali nasali umane per garantire che venga utilizzata la giusta molteplicità di infezione è importante per livelli ottimali e tempi di attivazione. La diafonia tra cellule epiteliali e cellule immunitarie innate sta guadagnando sempre più attenzione, e questo può essere applicato ulteriormente a qualsiasi altro metodo che coinvolga l'immunologia respiratoria acuta o cronica.
