Quindi, quando valutiamo nuovi anti-infettivi, dobbiamo affrontare due cose. Un lato sono i batteri. Se sono biofilm planctonici o informati, l'altro lato è la presenza di cellule ospiti, in particolare cellule ospiti epiteliali, che formano strette barriere biologiche.
Se queste barriere vengono esistete, come potrebbe essere la risposta monologica, e con questo nuovo modello, possiamo effettivamente monitorare entrambi i parametri contemporaneamente. Quando si trattano infezioni batteriche, dobbiamo renderci conto di quale organo è influenzato. Ad esempio, se è il polmone, possiamo approfittarne e somministrare localmente il farmaco come aerosol.
Tuttavia, se vogliamo avere un modello per studiare questo, abbiamo bisogno di un modello che consenta anche la posizione degli aerosol, come nel nostro modello. L'altro vantaggio è che si basa su cellule umane, in modo da poter evitare problemi dovuti a differenze tra animali e specie. Questo sistema potrebbe darti maggiori informazioni sul campo della ricerca sulle infezioni facendo luce sugli eventi molecolari e cellulari durante l'interazione di cellule ospiti e batteri.
Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, ricordarsi di controllare il supporto cellulare per la sterilità e la morfologia cellulare e di fare attenzione quando si maneggiano i supporti permeabili. Coltivare CFBE41 O meno cellule in un pallone T 75 con mezzo essenziale minimo contenente 10%FCS, 1%amminoacidi non essenziali e 600 milligrammi per litro di glucosio a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Aggiungere un mezzo fresco alle celle ogni due o tre giorni.
Dopo che le cellule hanno raggiunto il 70% di confluenza, lavarle con 10 millilitri di PBS e staccare con tre millilitri di EDTA di tripina a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere sette millilitri di MEM fresco e centrifugare le cellule a 300 volte G per quattro minuti. Dopo aver scartato il supernatante, a 10 millilitri di MEM, mentre si interrompono i grumi con una delicata pipettazione.
Contare le cellule con un contatore di celle automatizzato o una camera emocitometrica, quindi diluirle a una concentrazione di 200.000 celle per 500 microlitri per la semina in 12 piastre di pozzo con supporti permeabili. Aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare per pozzo al lato apicale del supporto permeabile. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco al lato laterale basale.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. Il terzo giorno dopo la semina, creare un'interfaccia liquido ad aria rimuovendo il mezzo dal lato laterale basale prima poi dal lato apicale. Aggiungere 500 microlitri di MEM fresco sul lato laterale basale e cambiare il mezzo ogni secondo giorno fino a quando le cellule formano un monostrato confluente.
Per valutare le proprietà della barriera epiteliale delle cellule, aggiungere 500 microlitri di mezzo cellulare al lato apicale e 1,5 millilitri sul lato laterale basale, quindi restituire la piastra all'incubatrice per un'ora. Misurare la resistenza elettrica del materiale di transito o TEER con elettrodo a bacchetta ann STX2 e un misuratore di volt epiteliale. Per coltivare le cellule THP1, coltivarle nel pallone T 75 utilizzando il mezzo RPMI 1640, integrato con il 10% di FCS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.
Dividi le cellule ogni secondo giorno seminando 2 milioni di cellule per millilitro in un nuovo pallone T75. Per differenziare le cellule THP1, centrifugare il contenuto del pallone a 300 volte G per quattro minuti, scartare il supernatante. Resuspend il pellet in mezzo fresco e mettere in un nuovo pallone T75.
Aggiungere 10 nanogrammi per millilitro PMA alle cellule e restituirle all'incubatrice. Per staccare il macrofago come cellule, lavarle una volta con PBS a 37 gradi Celsius e incubarle con tre millilitri di soluzione di distacco cellulare contenente EDTA millimolare 0,5 millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Verificare la presenza di distacco cellulare al microscopio invertito.
Quando le cellule si sono staccate, aggiungere sette millilitri di mezzo fresco e centrifugarli a 300 volte G per quattro minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, rimescolare le cellule del macrofago in tre millilitri di mezzo THP1 in un tubo conico da 15 millilitri, contare le cellule e incubarle per un massimo di un'ora prima di impostare la co-coltura. Per stabilire una co-coltura epiteliale di macrofagi, rimuovere il mezzo dalla camera inferiore dei monostrati CFBE41 O meno e invertire attentamente il supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro sterile, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule ricoperte attraverso i pori della membrana.
Posizionare 200.000 macrofagi THP1 in 200 microlitri di RPMI sul lato laterale basale dell'inserto invertito in ogni pozzo, chiudere le piastre di Petri e incubarle per due ore. Quindi riposizionare gli inserti nelle 12 micro piastre del pozzo e aggiungere 500 microlitri di mem medio al lato laterale basale dell'inserto permeabile. Inoculare 15 millilitri di lb integrati con 300 microgrammi per millilitro ampicillina con una singola colonia di P aeruginosa, PAO1GFP, incubare i batteri per 18 ore a 37 gradi Celsius, mentre tremano a 180 RPM.
Dopo l'incubazione, trasferire i batteri in un tubo conico da 50 millilitri e centrifughe a 3.850 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 10 millilitri di PBS sterile che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius. Misurare la densità ottica a 600 nanometri e regolare la concentrazione di batteri con il mezzo di coltura cellulare fino a una concentrazione finale di 200.000 unità di formazione di colonie per millilitro, che corrisponde a una molteplicità di infezione di un batterio per cellula epiteliale.
Aggiungere 100 microlitri di sospensione batterica al lato apicale del supporto permeabile e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora per consentire ai batteri di attaccarsi alle cellule, quindi rimuovere con cura il liquido apicale con una pipetta per ripristinare le condizioni ALI. Per gli esperimenti con il trattamento farmacologico, aggiungere 500 microlitri di una soluzione farmacologica diluita nel mezzo cellulare al lato apicale. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo cellulare al lato laterale basale.
Raccogliere 500 microlitri del mezzo laterale atipico e basale e raggrupparli per valutare la CFU dei batteri non attaccati. Per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati o internalizzati, aggiungere 500 microlitri di acqua fredda sterile deionizzata ad ogni compartimento del supporto permeabile e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Se si valuta la CFU da campioni congelati, scongelarli a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi utilizzare punte di pipetta per raschiare la superficie della membrana facendo attenzione a non mettere troppa pressione sui pozzi. Pipetta su e giù per rimuovere tutti i contenuti aderenti. Con la sospensione batterica da entrambe le frazioni, effettuare una diluizione seriale da uno a 10 con interpolazione PBS e placcare i batteri su piastre di agar lb.
Incubare le piastre di agar a 30 gradi Celsius per 16-72 ore, quindi contare le colonie e calcolare la CFU. La morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi sul lato laterale apicale e basilico dei supporti permeabili sono mostrati qui. Una maggiore misurazione teer e immunostaining per le proteine di giunzione stretta ZO1, ha dimostrato l'integrità della barriera epiteliale.
Per modellare un'infezione batterica, P aeruginosa è stata inoculata su cellule CFBE41 o meno. I macrofagi sono stati osservati sul lato apicico della co-coltura sei ore dopo l'infezione. Il TEER è sceso a 250 ohm per centimetro al quadrato, indicando una barriera epiteliale compromessa, che è stata suggerita anche dalla colorazione ZO1.
Qui viene mostrata la migrazione di macrofagi attraverso i pori filtranti permeabili e l'assorbimento batterico da parte delle cellule THP-1 sul lato apicali. Nelle monocolture THP-1, la migrazione dei macrofagi già un'ora dopo l'infezione. Nel frattempo la migrazione è stata vista dopo tre ore dopo l'infezione nella co-cultura.
Le co-colture infette trattate con tobramicina per sei o 20 ore sono state immagini con microscopia laser a scansione confocale. Senza trattamento, le cellule epiteliali o i macrofagi sono morti dopo 20 ore di infezione. Nonostante sia stato visto dopo sei ore di trattamento nelle immagini della microscopia, un test CFU ha dimostrato che i batteri non proliferano.
Tuttavia, i batteri hanno recuperato la loro capacità di proliferazione dopo il trattamento di 20 ore. Sono state inoltre misurate le teer delle monocolture e delle coculture. La co-coltura di cellule CFBE41 o meno con THP-1 non ha indotto alcun cambiamento nell'integrità della barriera epiteliale rispetto alla monocoltura.
Al momento dell'infezione, il valore TEER è diminuito. quando si esegue questa procedura, è fondamentale assicurarsi che le cellule siano seduti correttamente e che la membrana del filtro non sia interrotta. Pertanto i passaggi di semina cellulare devono essere eseguiti con attenzione.
Oltre a questo protocollo, la nebulizzazione degli antibiotici sugli inserti consentirebbe di vedere se la sopravvivenza dei batteri cambia rispetto alle condizioni sommerse.
