Gli autori desiderano ringraziare S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, e A Zedan. Questo lavoro è stato finanziato da: il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti-Agricultural Research Service attuale sistema di finanziamento della ricerca dell&#39;informazione (progetto di ricerca non 5306-21220-004-00; L&#39;Advanced Light Source è supportato dal direttore, Office of Science, Ufficio di Basic. Scienze Energia, del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti nell&#39;ambito del contratto n ° DE-AC02-05CH11231). NIFA sistemazioni e colture ricerca iniziativa sovvenzione AJM.

Dettagli del protocollo descritti di seguito sono stati scritti appositamente per il lavoro presso l&#39;Advanced Light Source 8.3.2 linea di luce. , Potranno essere necessarie per il lavoro in altri impianti di sincrotrone. Messa in sicurezza e la formazione radiazione è necessario per l&#39;utilizzo di queste strutture. 1. Preparazione del campione per le piante vive <ol><li> Coltivare piante in vaso ~ cm 10 di diametro, e assicurarsi che il fusto principale (o la parte della pianta da sottoporre a scansione), è il più centrato possibile e orientato verticalmente nel piatto. Le dimensioni fisiche dello strumento HRCT hutch ai limiti avanzate sorgenti luminose piante vive a ~ 1 m di altezza. Come conseguenza, l&#39;imaging di piante vive è meglio eseguita su plantule / alberelli coltivate in piccoli vasi. Seconda dell&#39;esperimento, diversi tipi di terreno può essere utilizzato per controllare il contenuto di umidità del suolo (ad esempio in esperimenti siccità), e per alcune piante con germogli flessibili (ad esempio viti) di scatti può essere accuratamente tucked nel tubo acrilico descritto di seguito (vedi figure 1 e 2). </li><li> Montare le piante vive in vaso in una misura porta rigida pentola di alluminio. L&#39;altezza piastra superiore può essere regolata per accogliere una gamma di altezze vaso. La parte superiore della piastra è progettata per allinearsi con la parte superiore della superficie del suolo, e le piante sporge dal centro della piastra di due parti. Lo scopo della presina è garantire il fusto della pianta è tenuta saldamente in posizione per minimizzare la vibrazione o movimento del campione. Minimizzare il movimento del campione durante una scansione è essenziale. </li><li> Una volta montato nel supporto, misurare il potenziale dell&#39;acqua stelo o traspirazione fogliare utilizzando una camera di stile Scholander pressione o una clip-on porometro foglia, rispettivamente, per determinare lo stato fisiologico della pianta prima della scansione. </li><li> Posizionare un sottile cilindro acrilico murate della pianta e sulla parte superiore del contenitore impianto di alluminio e fissarlo con argilla mastice per stabilizzare lacampione (Figura 2). Qualsiasi vibrazione o movimento del fogliame superiore sarà trasmessa lungo lo stelo e causare il tessuto vegetale all&#39;interno dell&#39;area scansionata per spostare, in ultima analisi, con conseguente distorsione dell&#39;immagine. Il cilindro viene utilizzata per contenere fogliame impianto e prevenire le foglie delle piante da sfregamento contro altri pezzi di attrezzature nel hutch che si tradurrebbe in vibrazioni durante una scansione. Involucro di plastica addizionale, asciugamani di carta, e il nastro dovrebbe essere utilizzato per ridurre ulteriormente le vibrazioni e il movimento di parti di impianto (vedi problemi associati ai trasferimenti di esempio in figura 4). Per ridurre il suo assorbimento di raggi X (che può diminuire la qualità dell&#39;immagine in un determinato tempo di esposizione), il cilindro contenente dovrebbe avere pareti sottili possibile mantenendo rigidità sufficiente a svolgere la sua funzione. </li><li> Fissare il supporto personalizzato piatto per la fase di cuscinetto d&#39;aria e bloccarlo (vite) in posizione tra la sorgente di raggi X e il sensore di immagine della fotocamera e le attrezzature. Positisullo stelo più verticale possibile e centro sulla base magnetica mandrino per garantire il campione rimane nel campo visivo durante la rotazione. </li></ol> 2. Preparazione del campione per Fresh, tessuti vegetali Tagliato <ol><li> Materiale vegetale fresco, in genere fusti o piccioli, possono essere acquisiti dopo la rimozione immediata da una pianta dal vivo. Se l&#39;intento dell&#39;esperimento è di visualizzare la totalità del xilema rete, dell&#39;acqua nei recipienti deve essere evacuato e sostituito con aria. Per fare questo, montare il campione in una camera di pressione stile Scholander e spingere l&#39;aria compressa o azoto attraverso il campione a bassa pressione (&lt;0,05 MPa) per circa 5 min. Specie si differenziano per il tempo necessario per evacuare la rete di vasi. Se l&#39;intento è quello di valutare il grado di formazione di embolia nel tessuto pianta fresca, quindi i campioni soggetti ad accisa dalla pianta fresca con una lama di rasoio e fare i tagli sotto l&#39;acqua. </li><li> Avvolgere il campione in uno strato di Parafilm per pressiccazione evento durante la scansione. </li><li> Montare il campione in un drill-mandrino fissato ad una piastra metallica che viene avvitato nella fase cuscinetto d&#39;aria. Centro e orientare il campione verticalmente come descritto sopra per garantire il campione rimane nel campo visivo. </li></ol> 3. Preparazione del campione per tessuti legnosi secchi <ol><li> Per la visualizzazione ottimale campione e contrasto dell&#39;immagine, è necessario disidratare lentamente l&#39;intero campione di tessuto legnoso. Tagliare i campioni di circa 6 cm di lunghezza. Selezionare i campioni che sono più diritta possibile nella regione di scansione mirata e hanno un diametro di ≤ 1 cm. </li><li> Posizionare il campione di tessuto legnoso in un forno di essiccazione a bassa temperatura per asciugare lentamente il campione senza causare l&#39;incrinatura o scissione del tessuto. Questo processo è probabilmente diverso da specie a specie e tessuti. Per fusti legnosi, 12 ore in un forno a 40 ° C è in genere sufficiente a fornire un eccellente contrasto senza causare significative chaNGES nella struttura fisica dello stelo (vedi problemi con la rapida essiccazione dimostrato nella Figura 3). </li><li> In alcune situazioni, è desiderabile avere un marcatore fiduciario all&#39;interno del campione in modo che la dissezione e la successiva visualizzazione con microscopia elettronica a scansione può essere orientato a punti specifici dell&#39;immagine HRCT. Per fare questo, apporre un metallo o di perle di vetro o filo verso l&#39;esterno dello stelo utilizzando Parafilm. Un altro metodo è quello di utilizzare una resina siliconica (ad es RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) che può essere iniettato in un condotto unico xilema (vedi esempi in Brodersen et al 2010). Una volta indurita, la resina siliconica è chiaramente visibile nel campione e facilmente distinti dagli altri vasi pieni d&#39;aria. Utilizzare questo indicatore per localizzare con precisione regioni specifiche del campione. </li><li> Montare il campione nel mandrino e centro come descritto sopra. </li></ol> 4. Preparazione del campione per la Leaf Tissue per due dimensionali (2D) radiogrammi <ol><li> Per visualizzare il contenuto dei vasi in foglie in near-real-time, le foglie possono essere acquisiti per produrre un radiogramma 2D, simile ad un dentale x-ray. Montare la foglia tra due fogli di plastica acrilica sottile, e fissare i bordi con le clip. Quindi fissare il campione montato su un sistema di post-porta e la posizione della basetta ottico vicino al sistema di imaging e la sorgente di raggi x. </li></ol> 5. La scansione del campione in 8.3.2 Hutch <ol><li> Decidere l&#39;ingrandimento che funziona meglio per la vostra applicazione. SLA beamline 8.3.2 è in grado di eseguire la scansione con obiettivi con ingrandimenti di 2x, 5x e 10x. Questi risultati nei formati immagine pixel di 4.5, 2.25 e 0.9 micron, rispettivamente. Determinati ingrandimenti, il campione deve essere di dimensioni adeguate, come il campo visivo diminuisce con ingrandimento maggiore. Vedi i dettagli per la scelta di fotocamera e l&#39;obiettivo ed i parametri di immagine risultanti in Tabella 1.</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000 (4008x2672) </td><td colspan="2"> PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter) </td></tr><tr><td> Lente </td><td> pixel (um) </td><td> campo visivo (mm) </td><td> pixel (um) </td><td> campo visivo (mm) </td></tr><tr><td> 10x </td><td> 0,9 </td><td> 3,6 </td><td> 0.65 (0.69) </td><td> 1.7 (1.7) </td></tr><tr><td> 5x (4x) </td><td> 1,8 </td><td> 7,2 </td><td> 1.3 (1.72) </td><td> 3.3 (4.4) </td></tr><tr><td> 2x </td><td> 4,5 </td><td> 18 </td><td> 3.25 (3.44) </td><td> 8.3 (8.8) </td></tr><tr><td> 1x </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6,5 (-) </td><td> 16,6 (-) </td></tr></tbody></table> Dettagli Tabella 1. Riguardanti disponibilemacchine fotografiche e lenti a SLA 8.3.2. <ol start="2"><li> Impostare l&#39;energia dei raggi X a 15 keV. Ciò è stato dimostrato di fornire un eccellente contrasto immagine maggior parte delle applicazioni di piante (vedi Brodersen et al. 2010, 2011, 2012A, b). Tempi di esposizione sono generalmente dipende dallo spessore e densità del campione (e quindi l&#39;ingrandimento utilizzato) comprese tra 100 e 1000 msec. Tempi di esposizione più lunghi (fino a pixel del rivelatore non sono saturi) comportano generalmente elevato rapporto segnale-rumore, ma a costo di maggiori tempi di scansione. </li><li> Scegliere un incremento angolare che è appropriato per l&#39;applicazione. I campioni vengono ruotate di 180 ° durante una scansione, e il numero di immagini scattate durante la rotazione può avere un impatto significativo sulla dimensione della lunghezza dataset, dell&#39;intervallo di scansione, e la qualità dell&#39;immagine finale, ma ci sono generalmente rendimenti decrescenti in qualità. Le scansioni tipiche sono effettuate a incrementi di 0,25 °, ottenendo 721 immagini per scansione. Diminuendo le incret a 0,125 ° risultati in immagini migliori per la visualizzazione dettagli fini, ma i rendimenti 1440 immagini e quindi una serie di dati molto più grande (per una regione tipica di interesse, questo significa ~ 10-30 GB di dati contro 5 GB). Tuttavia, il rapporto segnale-rumore è spesso migliorata e vale sia aumentato il tempo di scansione e la dimensione dei dati. Steli secchi che probabilmente non deformare / ridursi durante una scansione può essere sottoposto a intervalli più lunghi (incremento angolare più piccolo) senza danno. Quando le piante di imaging dal vivo, in cui i processi biologici (ad esempio embolia riparazione) si svolgono su scale temporali brevi, optando per gli intervalli di scansione più brevi è preferibile limitare i potenziali effetti dannosi dei raggi X su questo tessuto, anche se questo ha un potenziale perdita di qualità delle immagini. Brevi intervalli di scansione può essere realizzato utilizzando l&#39;impostazione continua Tomografia durante il quale il campione ruota continuamente mentre le immagini vengono catturate. </li><li> Per ogni scansione, &quot;campo chiaro&quot; e &quot;scuro&quot; sul campo le immagini devono essere corrected. Immagini in campo chiaro sono immagini senza il campione nel fascio. Questi sono spesso raccolti prima e dopo la scansione del campione traslare orizzontalmente il campione. Campi scuri sono raccolti chiudendo la x-ray-questo otturatore misurata la quantità di segnale della telecamera mostra senza raggi x. </li></ol> 6. Elaborazione dei dati <ol><li> Trasferire i &quot;grezzi&quot; 2D. Immagini TIF, che sono stati esportati dal computer di acquisizione di un file server, un computer di elaborazione dati. Se il computer dispone di memoria RAM sufficiente, i dati possono essere copiati in una cosiddetta &quot;Drive RAM&quot; (una parte della RAM viene visualizzata come un disco rigido del computer). In questo modo il software non ha bisogno di accedere ad un hard disk spinning, che è relativamente lento rispetto ad un disco a stato solido o memoria flash. Questo passo riduce significativamente la quantità di tempo richiesto per elaborare insiemi di dati. </li><li> Le immagini devono essere convertiti in una scala percentuale di trasmissione. 8.3.2 linea di luce ha un ba personalizzatonormalizzazione SFONDO plug-in che può essere scaricato e utilizzato con il software liberamente disponibili pacchetti o ImageJ Fiji ( <a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ). Si sottrae i conteggi scure delle immagini e normalizza le immagini di esempio da parte dei campi luminosi per produrre immagini che mostrano la trasmissione per cento. Caricare le immagini normalizzate nel pacchetto software Octopus ( <a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ) e &quot;ricostruire&quot; il set di dati 3D da 2D prime. TIF file utilizzando la procedura di trasformazione designati (Normalize immagini, rimozione Anello , la creazione di sinogramma, la ricostruzione del fascio parallela). Questo processo produce poi una serie di. TIF trasversale (sezione trasversale) immagini composte da &quot;voxel&quot; (elementi volumetrici pixel), ciascuno con un valori x, y, z di coordinate e l&#39;intensità che rappresentano la radiografia coefficiente lineare di assorbimento. </li></ol> 7. Visualizzazione <ol><li> Visualizze la pila di immagini in uno di una varietà di pacchetti software. Freeware (ad esempio Drishti, <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml</a> ) può essere utilizzato per visualizzare volumi o singoli o pile di immagini (ad esempio ImageJ o FIJI). Altri pacchetti software può essere utilizzato per la visualizzazione 3D. Il nostro gruppo di ricerca utilizza il pacchetto software Avizo ( <a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview</a> ), ma altri, come Amira ( <a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ) e VGStudioMax ( <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www. volumegraphics.com /</a> ) sono comunemente usati. </li><li> Caricare set di dati nella memoria di sistema e visualizzare il campione virtuale trasversale, longitudinale, o orientamenti fetta radiali. A causa delle caratteristiche 3D delle fette, set di dati virtuali attraverso il campe può essere ruotato in qualsiasi piano per allineare con le regioni di interesse, un miglioramento significativo rispetto alla tradizionale microscopia ottica di serie (vedi Film 1-3 per esempi dettagliati). </li><li> Per visualizzare il campione in base alle esigenze in 3D, &quot;segmento&quot; l&#39;esempio utilizzando il varietà di routine semi-automatici e manuali in Avizo per separare lumi dei vasi o altre strutture dal tessuto circostante. Segmentazione si riferisce a definire i confini tra gli oggetti di interesse, in modo da separare o segmentazione li in regioni distinte. Volumi di rendering in 3D viene eseguita dal software di visualizzazione. Un metodo per farlo è volume rendering diretto, dove si assume ogni punto in un volume di emettere e assorbire la luce, la quantità e il colore di emissione e di assorbimento può essere definita utilizzando un &quot;colormap&quot;, e la proiezione risultante in una data direzione è visualizzato sullo schermo. In alternativa, un wireframe o una superficie mesh 3D che rappresenta i limiti segmentati è costruito per mostrare un modello 3D di tha struttura di interesse. La rete 3D è composto da elementi poligonali, e il numero totale di elementi influenzerà sia la fedeltà di riproduzione struttura e la dimensione del file di dati associato (cioè più elementi conduce ad alta fedeltà, ma file di dimensioni maggiori). Una varietà di moduli di elaborazione delle immagini sono disponibili all&#39;interno del software di visualizzazione per il controllo delle uscite del volume di rendering, così come il controllo di luminosità, il contrasto, la trasparenza, la riduzione del rumore, ecc </li></ol> 8. Quantificazione <ol><li> Dopo la segmentazione è stato realizzato, è possibile quantificare le strutture bersaglio vegetali o modifiche funzionali in volume, lunghezza, larghezza, presenza o assenza di acqua, aria, ecc Per esempio, Brodersen et al (2010). Avizo software utilizzato per quantificare la variazione di volume di gocce d&#39;acqua all&#39;interno dei vasi vite ricarica. Le piante sono state scansione ogni 30 min oltre 4-8 ore a creare un tempo-lapse sequenza della nave rifornimento. Ogni scansione è stato ricostruito e caricati in Avizo, dove sono stati misurati singole goccioline nel corso del tempo come il loro volume è aumentato. </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Synchotron HRCT fornisce biologi vegetali con un potente, non distruttivo strumento per esplorare i meccanismi interiori della vascolarizzazione pianta in dettaglio incredibile. Questa tecnologia è stata utilizzata di recente per identificare precedentemente non descritta strutture anatomiche in modo differenziato xilema vite che alterano la connettività di rete xilema in varie specie di vite (Brodersen et al 2012b, in corso di stampa.) - Questa connettività potrebbe alterare drasticamente la capaci...

L&#39;acqua viene trasportata dalle radici alle foglie delle piante in un tessuto vascolare chiamato xilema - una rete di condotti interconnessi, fibre, e di vita, le cellule metabolicamente attive. Funzione di trasporto delle xilema impianto deve essere mantenuto per la fornitura di acqua e sostanze nutritive alle foglie per la fotosintesi, la crescita, e in ultima analisi, la sopravvivenza. Trasporto dell&#39;acqua in condotti xilematici può essere interrotta quando la rete xilema è compromessa da germi patogeni. In risposta a tali impianti infezioni spesso producono gel, gomme e tyloses come mezzo per isolare diffusione patogeno (ad es McElrone et al 2008, 2010). Stress idrico può anche limitare il trasporto dell&#39;acqua in xilema. Come piante perdono acqua durante la siccità prolungata, tensione cresce nei linfa xilema. L&#39;acqua in tensione è metastabile (cioè ad una certa soglia la tensione diventa grande abbastanza per cavitazione colonne d&#39;acqua contenuti in condotti xilematici). Dopo la cavitazione, una bolla di gas (embolia) può formare e riempire le condUIT, movimento dell&#39;acqua bloccando (Tyree e Sperry 1989), un fenomeno analogo a malattia da decompressione (vale a dire &quot;le curve&quot;) in palombari. Nonostante l&#39;importanza del trasporto xilematico acqua per la funzione ottimale delle piante, come dimostrato da un vasto corpo di letteratura storica e contemporanea su questo argomento (Tyree e Zimmermann, 2002. Holbrook et al, 2005), ci sono ancora aspetti di reti xilema che rimangono sfuggente . Diversi gruppi di ricerca hanno recentemente iniziato a utilizzare ad alta risoluzione x computerizzata a raggi micro-tomografia (HRCT) per valutare i dettagli più fini di anatomia in legno e tessuto vascolare (ad es Mayo et al, 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012A, b; Maeda e Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT è una tecnica non distruttiva utilizzata per visualizzare caratteristiche nell&#39;interno di corpi solidi e di ottenere informazioni digitali sulle loro proprietà strutturali 3-D. HRTCdifferisce dal medico convenzionale CAT-scansione nella sua capacità di risolvere dettagli piccoli come un micron, anche per oggetti ad alta densità. I recenti progressi nella tecnologia di sincrotrone HRCT hanno migliorato la risoluzione delle immagini e rapporto segnale-rumore in modo sufficiente che le reti dei vasi di piante e le connessioni intervessel possono essere visualizzati, assegnato coordinate 3D, ed esportati per le simulazioni del modello idraulico. Brodersen et al. (2011) ha recentemente avanzato questa tecnica combinando ricostruzioni 3D generati dal sincrotrone HRCT con un modello Fortran che estrae automaticamente i dati dalla rete xilema con una risoluzione molto più alta di quanto sia mai stato possibile con i tradizionali metodi anatomici (di serie cioè sezionamento con un microtomo e l&#39;acquisizione di immagini al microscopio ottico, ad esempio, Zimmermann 1971). Questo lavoro è stato utilizzato anche per ottimizzare i modelli idraulici del sistema xilema e identificato caratteristiche uniche di trasporto (flusso inverso cioè in qualche vessels durante i periodi di picco di traspirazione) (Lee et al., in revisione). Sincrotrone HRCT può ora essere utilizzato per visualizzare le funzionalità dello xilema, suscettibilità alla cavitazione, e la capacità di alcune piante di assicurare la riparazione condotti embolizzato. La mancata ristabilire il flusso in condotti embolizzato riduce la capacità idraulica, la fotosintesi limiti, e si traduce in morte della pianta in casi estremi (McDowell et al. 2008). Le piante possono far fronte a emboli, deviando l&#39;acqua intorno a blocchi tramite box di collegamento adiacenti condotti funzionali, e da una crescente xilema nuovo per sostituire perso capacità idraulica. Alcune piante hanno la capacità di riparare le fratture delle colonne d&#39;acqua, ma i dettagli di questo processo in xilema sotto tensione sono rimasti poco chiari per decenni. Brodersen et al. (2010) ha recentemente visualizzato e quantificato il processo di ricarica in viti in diretta tramite HRCT. Nave di successo ricarica era dipendente afflusso acqua da cellule viventi che circonda la xylem condotti, in cui le gocce d&#39;acqua individuali ampliato nel corso del tempo, i vasi pieni, e costretto la dissoluzione del gas intrappolato. La capacità di diverse piante per riparare vasi xilematici compromessi e dei meccanismi di controllo tali riparazioni sono attualmente in fase di studio. Descrizione del meccanismo SLA beamline 8.3.2 Il nostro lavoro fino ad oggi è stato condotto sul Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 alla Fonte Advanced Light a Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Campioni vegetali sono posti in un piombo rivestito hutch situato a 20 metri dalla sorgente di raggi X, generato da un magnete 6 curva Tesla superconduttore dipolo all&#39;interno Advanced Light Source operativo anello di accumulazione di elettroni con una energia critica di 11,5 KeV. Un schematico della stazione finale è mostrato in Figura 1. I raggi X inserire il hutch con un fascio di 40x ~ 4.6 mm e passare attraverso il campione che è montato su un palco rotante motorizzata. Iltrasmesso i raggi X incidono su un cristallo scintillatore (due materiali comunemente usati sono Luag CdWO o 4) che convertono i raggi X in luce visibile che viene trasmesso attraverso le lenti su un ccd per la raccolta di immagini. L&#39;, scintillatore telecamera e ottica sono contenuti in una scatola a tenuta di luce che è su rotaie che permettono il campione a distanza scintillatore essere ottimizzato per l&#39;imaging a contrasto di fase. Tutti i campioni sono montati sul stadio 10 cm di diametro rotante che a sua volta è montato su fasi di traslazione orizzontale e verticale per il posizionamento del campione. Un campione pianta vivente, con l&#39;apparato radicale montato su un supporto personalizzato impianto costruito pentola e il fogliame contenuto in un tubo acrilico, può essere visto in Figura 2. Tempi di esposizione tipiche possono variare dal 0,1-1 sec utilizzando 10-18 KeV, e durate di scansione varierà 5-40 min a seconda delle impostazioni ottimizzate per un particolare campione. Per i campioni alti (tipico delle reti xilematico delle piante), le scansioni di dati possono esserepiastrelle ripetendo la misurazione con il campione a diverse altezze, che è controllata automaticamente, consentendo seamless sezioni seriali lungo un&#39;altezza di campionamento massimo di circa 10 cm. Campione Larghezza massima quando l&#39;imaging a 4.5 micron risoluzione è ~ 1 cm per i campioni che sono quasi perfetti in orientamento verticale. Generazione ed elaborazione dei dati viene completata usando il protocollo di seguito elencati. A causa della differenza di x-ray attenuazione tra aria e acqua, contrasto immagine eccellente può essere ottenuto in piante senza l&#39;uso di soluzioni di contrasto tipici dei sistemi medicali CT. L&#39;aria piena di lume del vaso è facilmente distinguibile dal circostante pieno d&#39;acqua dei tessuti nelle piante idratati.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Material Name/Equipment </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature

Ad alta risoluzione x-tomografia computerizzata a raggi (HRCT) è una tecnica non distruttiva di diagnostica per immagini con sub-micron capacità di risoluzione che viene ora utilizzato per valutare la struttura e la funzione della rete di impianti xilema in tre dimensioni (3D) (ad esempio, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012A, b). HRCT immagini si basa sugli stessi principi della medicina sistemi CT, ma una ad alta intensità di sincrotrone a raggi X Fonte dei risultati a maggiore risoluzione spaziale ed è diminuito il tempo di acquisizione delle immagini. Qui, abbiamo dimostrato in dettaglio come sincrotrone a base di HRCT (eseguita presso l&#39;Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combinazione con il software Avizo (VSG Inc., Burlington, MA, USA) viene utilizzato per esplorare xilema stabilimento di asportato tessuto e piante viventi. Questo strumento di imaging consente agli utenti di andare al di là tradizionale statica, luce 2D o microscopio elettronico e di campioni di studio virtuali utilizzando sezioni seriali in qualsiasi piano. Un numero infinito di fette in ogni c orientamentoun essere effettuata sullo stesso campione, una caratteristica che è fisicamente impossibile utilizzando metodi di microscopia tradizionali. I risultati dimostrano che la HRCT può essere applicato sia erbacee e specie di piante legnose, e una serie di organi vegetali (foglie, cioè piccioli, steli, tronchi, radici). Le cifre qui presentate contribuire a dimostrare sia una serie di anatomia vascolare rappresentante dell&#39;impianto e il tipo di dettaglio estratto da set di dati HRCT, comprese le scansioni per Coast Redwood (Sequoia sempervirens), noce (Juglans spp.), Quercia (Quercus spp.), E acero ( Acer spp.) alberelli di girasole (Helianthus annuus), viti (Vitis spp.), e felci (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Campioni asportati ed essiccati di specie legnose sono più facili da eseguire la scansione e genere permette di ottenere le immagini migliori. Tuttavia, i recenti miglioramenti (ad esempio le scansioni più rapide e la stabilizzazione del campione) hanno reso possbile utilizzare questa tecnica di visualizzazione su tessuti verdi (es piccioli) e in piante viventi. In occasione alcuni restringimento di idrati tessuti vegetali verdi farà sì che le immagini di sfocatura e metodi per evitare questi problemi sono descritti. Questi progressi recenti con HRCT fornire promettenti nuove intuizioni funzione di piante vascolari.

Synchotron HRCT sono state attuate con successo su una vasta gamma di tessuti vegetali e delle specie che utilizzano 8.3.2 linea di luce (Figura 5), e hanno fornito nuove informazioni sulla struttura e la funzione di xilema stabilimento di una risoluzione senza precedenti in 3D. Le funzionalità di visualizzazione e l&#39;esplorazione forniti dalle ricostruzioni 3D (come illustrato nelle figure 6-8, e 1-3) Film consentire determinazione precisa della posizione e l&#39;orientamento delle...

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature | Biology | Video

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Alta risoluzione x-ray tomografia computerizzata (HRCT) è una tecnica non distruttiva imaging diagnostico che può essere utilizzata per studiare la struttura e la funzione della vascolarizzazione dell&#39;impianto in 3D. Dimostriamo come HRCT facilita l&#39;esplorazione di reti xilematici in una vasta gamma di tessuti e specie vegetali.

Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

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20.9K Views.  U.S. Department of Agriculture. Alta risoluzione x-ray tomografia computerizzata (HRCT) è una tecnica non distruttiva imaging diagnostico che può essere utilizzata per studiare la struttura e la funzione della vascolarizzazione dell'impianto in 3D. Dimostriamo come HRCT facilita l'esplorazione di reti xilematici in una vasta gamma di tessuti e specie vegetali.

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Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

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Biologia

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an International Space Station (ISS) mission. However, the underlying mechanisms of these spaceflight-induced changes are currently unknown. The purpose of the present study was to determine the impact of the spaceflight environment on ocular structures by evaluating the thickness of the mouse retina, the retinal pigment epithelium (RPE), the choroid and the sclera layer using micro-CT imaging. Ten-week-old C57BL/6 male mice were housed aboard the ISS for a 35-day mission and then returned to Earth alive for tissue analysis. For comparison, ground control (GC) mice on Earth were maintained in identical environmental conditions and hardware. Ocular tissue samples were collected for micro-CT analysis within 38(&#177;4) hours after splashdown. The images of the cross-section of the retina, the RPE, the choroid, and the sclera layer of the fixed eye was recorded in an axial and sagittal view using a micro-CT imaging acquisition method. The micro-CT analysis showed that the cross-section areas of the retina, RPE, and choroid layer thickness were changed in spaceflight samples compared to GC, with spaceflight samples showing significantly thinner cross-sections and layers compared to controls. The findings from this study indicate that micro-CT evaluation is a sensitive and reliable method to characterize ocular structure changes. These results are expected to improve the understanding of the impact of environmental stress on global ocular structures.

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

We present a protocol using high-resolution micro-computed tomography imaging to determine whether spaceflight induced damage on ocular structures. The protocol shows the micro-CT-derived measurement of ex vivo rodent ocular structures. We demonstrate the ability to assess ocular morphological changes following spaceflight using a non-destructive tridimensional technique to evaluate ocular damage.

Valutazione della struttura oculare globale dopo il volo spaziale utilizzando un metodo di imaging micro-calcolato (Micro-CT)

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiografia neutronica e tomografia computerizzata di sistemi biologici presso il reattore isotopico ad alto flusso dell'Oak Ridge National Laboratory

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches have rarely been used to study equine athletic injury. Degenerative osteoarthritis caused by mechanical stress can originate from chronic postural dysfunction, which, because the primary dysfunction is often distant from the site of tissue injury, is best identified through modeling whole-body biomechanics. To characterize whole-body equine kinematics, a realistic skeletal model of a horse was created from equine computed tomography (CT) data that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling. Equine CT data were reconstructed into individual three-dimensional (3D) data sets (i.e., bones) using 3D visualization software and assembled into a complete 3D skeletal model. The model was then rigged and animated using 3D animation and modeling software. The resulting 3D skeletal model can be used to characterize equine postures associated with degenerative tissue changes as well as to identify postures that reduce mechanical stress at the sites of tissue injury. In addition, when animated into 4D, the model can be used to demonstrate unhealthy and healthy skeletal movements and can be used to develop preventative and rehabilitative individualized therapies for horses with degenerative lamenesses. Although the model will soon be available for download, it is currently in a format that requires access to the 3D animation and modeling software, which has quite a learning curve for new users. This protocol will guide users in (1) developing such a model for any organism of interest and (2) using this specific equine model for their own research questions.

The purpose of this protocol is to describe the method of creation of a realistic, whole-body, skeletal model of a horse that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling to characterize whole-body mechanics.

Costruzione di un modello scheletrico equino realistico, a tutto corpo e tridimensionale utilizzando dati di tomografia computerizzata

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...