Questo protocollo migliora notevolmente il contrasto tra i tessuti della pianta parassita e l'ospite in campioni che verranno analizzati mediante microtomografia. La tecnica qui descritta accelera il processo di perfusione a contrasto attraverso il campione, consentendo l'analisi di specifici tessuti e strutture formate tra la pianta parassita e l'ospite. L'approccio del vuoto è molto semplice e non dovrebbe offrire difficoltà.
L'apparato di perfusione, d'altra parte, potrebbe essere un po 'difficile da configurare. Ma la pratica in anticipo potrebbe aiutare. Per piccoli campioni non legnosi, il metodo del vuoto può essere utilizzato per l'applicazione.
Mentre il metodo di profusione dovrebbe essere utilizzato per campioni più grandi e legnosi, compreso un segmento del fusto o della radice dell'ospite. Se si utilizza il metodo del vuoto, inserire il campione nel flaconcino contenente la soluzione contrastante. Quindi, posizionare il flaconcino in una camera a vuoto o in un essiccatore collegato a una pompa per vuoto.
Rimuovere il coperchio dal flaconcino e chiudere la camera a vuoto o l'essiccatore. Verificare che non vi siano crepe nella camera a vuoto o nell'essiccatore. Aprire la valvola di scarico della camera o dell'essiccatore per forzare l'uscita dell'aria.
Accendere la pompa e attendere che la pressione raggiunga circa 20 pollici di mercurio o 10 psi. Chiudere la camera o la valvola di scarico dell'essiccatore per evitare che l'aria rientri in entrata. Quindi spegnere rapidamente la pompa.
Lasciare il campione sotto vuoto per almeno due ore. Se si utilizza il metodo di profusione, selezionare il serbatoio di alimentazione in base alla dimensione del campione. Per piccoli campioni, una siringa da 50 millilitri senza ago può essere utilizzata come serbatoio.
Collegare un'estremità di un tubo di plastica trasparente al serbatoio di alimentazione. Quindi collegare l'altra estremità a una valvola a due o tre vie. Collegare un secondo tubo a un'uscita diversa nella valvola.
Fissare il serbatoio di alimentazione in una posizione elevata senza smontare l'apparecchio impostato nella fase precedente. Chiudere la valvola a tre o due vie per evitare che il liquido esca dal sistema di tubi e versare la soluzione di contrasto nel serbatoio di alimentazione. Assicurarsi che non vi siano grandi bolle d'aria nel sistema di tubi e chiudere nuovamente la valvola, lasciando l'apparecchio in posizione.
Per preparare il campione alla profusione della soluzione di contrasto, tenerlo immerso nel liquido e tagliare la punta dell'estremità prossimale del gambo o della radice dell'ospite. Aprire con attenzione la valvola per consentire alla soluzione di contrasto di fluire lentamente e riempire il tubo di plastica collegato al serbatoio mantenendo l'estremità aperta del sistema in una posizione leggermente elevata per evitare che la soluzione di contrasto si rovesci. Collegare l'estremità prossimale dello stelo ospite o della radice nel campione all'estremità aperta del sistema di tubi.
Lasciare che la soluzione perfonda il campione per almeno due ore o fino a quando la soluzione si accumula all'interno del contenitore. Chiudere la valvola e scollegare con attenzione il campione dall'apparecchio. Lavare il campione immergendolo in acqua per due minuti.
Mettere il campione in un tovagliolo di carta a temperatura ambiente per consentire all'acqua in eccesso di evaporare per due o cinque minuti senza consentire al campione di asciugarsi completamente. Avvolgere il campione in una pellicola di paraffina ed evitare di piegare la pellicola sopra il campione. La scansione micro-CT può essere sfruttata per comprendere meglio le complesse strutture delle piante parassite e la loro interazione con gli ospiti in modo tridimensionale non distruttivo.
I protocolli qui descritti funzionano per diversi sistemi micro-CT. Tuttavia, le impostazioni e i parametri dipendono dal sistema e dai campioni. Le immagini al microscopio a raggi X 3D erano efficaci quanto le sezioni anatomiche osservate al microscopio ottico per analizzare l'organizzazione e la topologia dei tessuti nell'interfaccia dell'ospite del parassita.
Sulla base della differenza di colore bianco brillante e grigio scuro dovuta all'assorbimento differenziale della soluzione di contrasto, è possibile osservare l'abbondanza di parenchima che circonda il nucleo vascolare dell'haustorium. Il nucleo vascolare è facilmente osservabile nelle sezioni trasversali poiché due filamenti vascolari sono separati dal parenchima. L'endoparassita Viscum minimo, crescendo all'interno di una pianta ospite succulenta, ha mostrato cellule di parenchima che immagazzinano carboidrati sotto forma di amido.
La differenza nell'assorbimento dello iodio ha permesso la rilevazione dell'intricata rete di filamenti corticali formati dall'endoparassita all'interno del corpo ospite. I risultati ottenuti per Cuscuta Americana e Struthantus marcianus aiutano a illustrare la convenienza dell'approccio microtomografico rispettivamente per campioni piccoli e più grandi. Il sezionamento seriale virtuale Sibelium fungiform ha mostrato che i vasi nella radice ospite si biforcano nel tubero parassita e che la continuità xilematica tra le due piante è formata dalla connessione vaso-vaso tramite piastre di perforazione.
La procedura qui descritta può essere combinata con altre tecniche, come la segmentazione virtuale, per fornire nuove informazioni sulla struttura tridimensionale della connessione tra piante parassite e i loro ospiti. Questa tecnica ha aperto la strada all'analisi di diversi aspetti della biologia delle piante parassite, tra cui lo sviluppo di endoparassiti e la funzionalità delle connessioni iperparassitarie.
