Questo lavoro è stato supportato da NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL

I topi sono stati allevati e mantenuti secondo le procedure standard degli animali, e tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall&#39;Assicurazione per la Protezione degli Animali e dal Comitato Etico Comunitario per la Ricerca sugli Animali secondo il Ministero della Salute italiano e hanno rispettato la Guida NIH per la cura e l&#39;uso di Animali da laboratorio. 1. Lesioni muscolari e il blocco in vivo del flusso autofagico <ol><li> Lesioni muscolari. <ol><li> Per indurre lesioni muscolari scheletriche acute, iniettare 20 μL di 10 μM cardiotossina (CTX) direttamente nel muscolo anteriore (TA) di sinistra di tibiale anteriore di due mesi di vecchi C57BL / 6J che pesano circa 20 g. Utilizzare un numero uguale di maschi e femmine. Utilizzare l&#39;arto contralaterale non trattato come un controllo. NOTA: 10 μM CTX in soluzione di cloruro di sodio 0,9% deve essere filtrato (0,22 μm di filtro PVDF) e conservato a -20 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. </li><li> Utilizzando un iLa siringa di nsulin con un ago da 30 G, inietta CTX nel mezzo dell&#39;AT. Per indurre una lesione accurata nell&#39;AT, assicurarsi che l&#39;ago della siringa entri vicino al tendine distale, profondo da 5 mm, dal basso verso l&#39;alto del muscolo ( figura 1A ). </li></ol></li><li> Blocco del flusso autofagico in topi non feriti e feriti. <ol><li> Per valutare il flusso autofagico, 24 h Post-Injury (pi), somministrare 50 mg / kg di clorochina (CLQ) ogni 24 ore per 4 d mediante iniezione intraperitoneale (IP) ( Figura 1B ). <ol><li> Sciogliere CLQ (10 mg / mL) in PBS 1X e filtrarlo attraverso una membrana da 0,2 μm. Pesare ogni mouse e calcolare la quantità di CLQ da iniettare. NOTA: Preparare e utilizzare la soluzione CLQ nello stesso giorno. La riserva CLQ può essere conservata fino a un mese a -20 ° C. Poiché l&#39;autofagia è un processo metabolico, eseguire sempre il trattamento CLQ sempre allo stesso tempo ( cioè al mattino befoOre 10.00). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sezioni del tessuto muscolare <ol><li> Sacrificare il mouse. <ol><li> Eutanizzare i topi 5 giorni dopo l&#39;infortunio. </li><li> Effettuare l&#39;eutanasia da dislocazione cervicale o da CO 2 (da seguire da dislocazione cervicale per conferma). Poiché il processo di autofagia è legato alle abitudini di dormire / mangiare del mouse, sacrifica sempre i topi contemporaneamente, preferibilmente alla mattina ( vale a dire prima delle 10.00). </li></ol></li><li> Isolamento e inclusione della TA. <ol><li> Prima della dissezione, spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando forbici, fare una piccola incisione perpendicolare (3 mm di lunghezza) sulla pelle dorsale del mouse al livello dei fianchi. Tagliare la coda ei piedi per semplificare la rimozione della pelle. Tirare la pelle verso la coda e rimuoverla per esporre i muscoli sottostanti; Il muscolo TA è facile da localizzare, come mostrato nella Figura 2A </strong&gt;. </li><li> Con l&#39;aiuto di due pinze, afferrare i tendini distali. </li><li> Tagli i tendini distali; I tendini TA e extensor digitorium longus (EDL) vengono spesso tagliati congiuntamente e successivamente separati (vedi punto 2.2.6). </li><li> Usando le pinze, tenere il muscolo TA dal tendine e tirare con attenzione il muscolo verso l&#39;estremità prossimale (vicino al ginocchio, Figura 2B ). NOTA: A questo punto i muscoli EDL e TA sono facilmente riconoscibili, l&#39;TA è più grande e superficiale rispetto all&#39;EDL. </li><li> Separare l&#39;TA dal muscolo EDL tirando i due tendini distali nelle direzioni opposte ( figura 2C ). </li><li> Tagliare il tendine prossimale. </li><li> Usando le pinze, rimuovere la fascia sottile che copre il muscolo, senza danneggiare il tessuto. </li><li> Rimuovere l&#39;umidità eccessiva nel campione con l&#39;aiuto di un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il muscolo non sia né umido né eccessivamente asciutto, poiché l&#39;umidità eccessiva produrrà sigDanni nocivi al muscolo e compromettono la prossima colorazione. </li><li> Posizionare il composto ottimale di taglio (OCT) sul fondo di uno stampo e collocare il muscolo in esso, nell&#39;orientamento mostrato nella figura 2D . Aggiungere il 100% isopentane ad un bicchiere fino a raggiungere una profondità di circa 3-4 cm. Mettere il bicchiere in contatto con l&#39;azoto liquido in una scatola di polistirolo. </li><li> Non lasciare che l&#39;azoto liquido entri nel bicchiere, in quanto produrrà una schiuma bubbling, che può influenzare l&#39;inclusione e danneggiare le sezioni muscolari. </li><li> Osservare l&#39;isopentane e aspettare fino a raggiungere la temperatura corretta (tra -140 ° C e -150 ° C); Alla temperatura appropriata, uno strato bianco solido di isopentano congelato si cristallizzerà sul fondo del bicchiere. </li><li> Se l&#39;isopentane interamente blocca il solido, sciogliere e raffreddare a temperatura di congelamento prima di procedere al passo successivo. </li><li> Utilizzando pinze prechillate, abbassare delicatamente lo stampoL&#39;isopentano per circa 20-30 s. Posizionare il campione congelato in un contenitore con ghiaccio secco fino a trasferirlo in un congelatore da -80 ° C. NOTA: il protocollo può essere sospeso qui. </li></ol></li><li> Criosezioni del tessuto muscolare. <ol><li> Dopo almeno una notte a -80 ° C, eseguire la criocuzione. </li><li> Prendere il coltello criostato e la lastra antirollio dal congelatore -20 ° C e posizionarli sui rispettivi supporti nell&#39;armadio criostato. </li><li> Mettere una goccia di OCT sullo stub del campione e posizionarla sul campione congelato, in orientamento verticale NS, come mostrato nella Figura 2D . </li><li> Posizionare il tappo del campione sul mandrino. </li><li> Senza tirare la piastra anti-roll verso il basso sul coltello, fare alcuni tagli a 40 μm per sbarazzarsi di OCT che non include muscoli. Quando il muscolo diventa visibile, ridurre lo spessore della fetta a 7-8 μm. </li><li> Tirare verso il basso la piastra antirumbo fino a che non sia allineataIl bordo del coltello o un poco sopra di esso. </li><li> Tagliare le sezioni trasversali 7-8 μm di spessore e montare 3-4 fette per diapositiva istologica. NOTA: la temperatura di criostato suggerita è compresa tra -15 ° C e -23 ° C. Le sezioni trasversali dei campioni sono necessarie per la successiva analisi per individuare le cellule staminali muscolari nella posizione di nicchia satellitare. </li><li> Per massimizzare l&#39;aderenza della sezione, tenere le diapositive a temperatura ambiente per 10-15 minuti per evitare il loro distacco durante l&#39;incubazione degli anticorpi. NOTA: La fase di asciugatura dell&#39;aria potrebbe influenzare l&#39;immunostaining, fornendo risultati ambigui. Le diapositive possono essere immagazzinate per diversi mesi a -80 ° C. Il protocollo può essere interrotto qui. </li></ol></li><li> Controllo dei danni muscolari nelle criose dei muscoli TA mediante la colorazione di Hematoxylin Eosin (H &amp; E). <ol><li> Per valutare la qualità del muscolo ( cioè l&#39;efficacia del danno, dell&#39;isolamento muscolare e inclusoIone e criose), eseguire una colorazione H &amp; E. Per ogni punto temporale sperimentale, fissare una diapositiva con 4% PFA per 10 minuti. Dopo la fissazione, lavare bene le diapositive in vari cambiamenti di 1x PBS. NOTA: Attenzione. PFA è cancerogeno e deve essere manipolato con cura. </li><li> Prendete una diapositiva per ogni punto sperimentale e metteteli in un vaso di colorazione. </li><li> Riempire il vaso con 9 mg / l di ematoxilina fino a quando le sezioni sono coperte e incubare per 8 min. </li><li> Riciclare l&#39;ematossilina. </li><li> Lasciare il vaso sotto acqua corrente per 10 minuti per rimuovere l&#39;eccesso di ematossilina. NOTA: Assicurarsi di non scorrere l&#39;acqua direttamente sulle sezioni. </li><li> Lavare con acqua sterilizzata. </li><li> Incubare le sezioni con eosina 0,5% (w / v) in etanolo acidificato al 90% per 1 min. </li><li> Riciclare l&#39;eosina. </li><li> Lavare due volte con acqua sterile per 3 minuti / lavaggio. NOTA: eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio chimico. </li><li> Lavare le sezioni con il 70% di etanolo. </li><li> lavaggioLe sezioni con etanolo al 90%. </li><li> Lavare le sezioni con etanolo al 100%. </li><li> Incubare le sezioni con 0,879 g / mL o-xilene. NOTA: Attenzione. O-xilene è infiammabile e moderatamente tossico. Manipolarlo sotto cappuccio chimico, indossando equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto da laboratorio e una maschera. </li><li> Riciclare l&#39;o-xilene. </li><li> Mettere le diapositive su un pezzo di carta per asciugare. </li><li> Chiudere le diapositive utilizzando un supporto di montaggio a base di xilene a rapido indurimento. </li><li> Controllare la qualità delle sezioni con un microscopio ottico a 10x ingrandimento (vedere la figura 3 ) NOTA: il protocollo può essere sospeso qui. </li></ol></li></ol> 3. Immunostaining per LC3 e MyoD nelle sezioni muscolari del tessuto muscolare <ol><li> Fissazione delle sezioni del tessuto muscolare. <ol><li> Preparare una camera di incubazione bagnando un pezzo di carta e posizionandolo sul fondo di una scatola di plastica chiusa per mantenere unDi umidità all&#39;interno della camera. Separare le sezioni dei tessuti con 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS per 10 min. NOTA: viene utilizzato un foglio di carta bagnato per evitare l&#39;essiccazione del campione. Preparare PFA fresco o utilizzare PFA conservato a -20 ° C. Attenzione. PFA è tossico; La polvere deve essere manipolata con cura quando si effettua la soluzione di magazzino. Questa operazione deve essere eseguita in un cappuccio chimico, con equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto di laboratorio e una maschera. Inoltre, quando in soluzione, il PFA deve essere manipolato con attenzione. </li><li> Rimuovere il PFA e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3 volte. </li></ol></li><li> Permeabilizzazione delle sezioni del tessuto muscolare. <ol><li> Disegnare una barriera idrofobica attorno alle sezioni del tessuto utilizzando una penna opaca. NOTA: Questo passaggio definisce la superficie attorno alle sezioni del tessuto e minimizza il volume degli anticorpi descritti nei passaggi 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9. </li><li> Coprire le sezioni con 200 μl di freddo (-20 ° C)Metanolo e mettere la camera di incubazione orizzontalmente all&#39;interno di un congelatore a -20 ° C per 5 min. </li><li> Rimuovere la camera di incubazione dal congelatore, aspirare il metanolo e lavare le sezioni con X PBS per 5-7 minuti a RT; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> Blocco <ol><li> Preparare una soluzione di blocco fresco del 4% di albumina serica bovina (BSA) in PBS 1x. NOTA: la soluzione BSA può essere conservata per una settimana a 4 ° C. </li><li> Incubare le sezioni con soluzione di blocco per almeno 60 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione di blocco. </li><li> Preparare 100 μL di miscela anti-Fab diluendo 20 μg / mL anti-Fab in 1x PBS. Incubare le sezioni con un frammento F (ab) di IgM anti-mouse purificato affinità per 1 ora a RT. </li></ol></li><li> Incubazione primaria dell&#39;anticorpo. <ol><li> Preparare 100 μL di miscela anticorpale primaria per ciascuna diapositiva sciogliendo gli anticorpi LC3 e MyoD nel 4% di BSA in 1x PBS. Utilizzare 5 μg /Ml di anti-LC3 (anticorpo policlonale coniglio) e 10 mg / L di anti-MyoD (anticorpo monoclonale del mouse). Incubare la miscela anticorpale primaria a notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavaggi. <ol><li> Rimuovere il mix di anticorpi primario. </li><li> Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> Incubazione secondaria anticorpale. <ol><li> Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva. Sciogliere l&#39;anti-coniglio caprino 488 (5 μg / mL) e l&#39;anti-topo di capra 594 (5 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS. NOTA: Evitare un&#39;eccessiva esposizione alla luce per evitare lo sbiancamento fluorochrome. Eseguire le seguenti operazioni al buio. </li><li> Incubare le sezioni con il miscuglio secondario anticorpale per 45 minuti a RT. </li><li> Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> Incubazione primaria dell&#39;anticorpo. <ol><li> Diluire le laminiN-2 (α-2-chain) anticorpo monoclonale (0,33 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS utilizzando 100 μL di miscela per ogni diapositiva. Incubare le sezioni nel mix di anticorpi primario per 1-2 h a RT. </li></ol></li><li> Lavaggi. <ol><li> Rimuovere il mix di anticorpi primario. </li><li> Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> Incubazione secondaria anticorpale. <ol><li> Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva diluendo 647 (5 μg / mL) di capra anti-rat 64% in BSA in 1X PBS. Incubare le sezioni in miscela anticorpale secondaria per 45 minuti a RT. </li><li> Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). <ol><li> Aggiungere 200 μL di 300 nM DAPI soluzione in 1x PBS a ciascuna diapositiva. Incubare per 5 minuti a RT. Conservare la soluzione DAPI a 4 ° C nelbuio. </li><li> Lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x. </li></ol></li><li> Montaggio delle sezioni muscolari macchiate. <ol><li> Rimuovere l&#39;eccesso di soluzione di lavaggio dalle sezioni. </li><li> Posizionare 10 μL di glicerolo in 1x PBS (3: 1) sulle sezioni macchiate in mezzo alla diapositiva e aggiungere una copertura, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione microscopica confocale <ol><li> Acquisite le immagini usando un microscopio confocale a quattro laser integrato con un sistema di acquisizione di immagini e software analitico. NOTA: MyoD è coniugato con un colorante 594 che è un colorante rosso-fluorescente luminoso, con eccitazione ideale per il laser a 594 nm (eccitazione: 590 nm, emissione: 617 nm). LC3 è coniugato con un colorante 488 che è un colorante verde-fluorescente brillante, con eccitazione idealmente adatta alla linea laser 488 nm (eccitazione: 495 nm, emissione: 519 nm). Laminina è coniugata con un colorante 647 che èUn colorante fluorescente a grana lunga e luminosa, con eccitazione ideali per la linea laser a 647 nm (eccitazione: 650 nm, emissione: 668 nm). </li><li> Posizionare le diapositive nel vassoio del microscopio e utilizzare l&#39;ingrandimento 63X per rilevare i segnali nucleari. Attenersi a metodi di rigenerazione centrando i campi della rigenerazione attiva, basandosi sulla morfologia muscolare (vedere la figura 4 ). NOTA: Mentre in muscoli imperturbabili, la dimensione del miofibra è praticamente costante ( Figura 4A ), la rigenerazione muscolare mediata da lesioni può essere riconosciuta dalla comparsa di miofibri più piccoli, che sono le fibre appena formate dopo la rigenerazione. Inoltre, il muscolo in rigenerazione attiva è caratterizzato da un ampio infiltrato fatto di macrofagi, precursori fibro-adipogenici e cellule localizzate ai muscoli danneggiati per orchestrare la rigenerazione muscolare ( Figura 4B ). </li><li> Valutare la colorazione immunofluorescenza in regenAree focalizzandosi su MuSC che si trovano sotto la lamina basale delle miofibere. </li><li> Focus su MuSCs positivi per la colorazione MyoD e posizionati all&#39;interno di miopi contrassegnati dalla colorazione laminina (vedi figura 4B , frecce bianche). </li><li> Utilizzare almeno 3 topi / gruppo sperimentale e utilizzare il microscopio per acquisire immagini di ingrandimento 63X di almeno 7 campi per ogni gruppo sperimentale. </li><li> Una volta individuate le aree rigenerative, concentrarsi utilizzando la colorazione DAPI e quindi regolare gli altri singoli canali. <ol><li> Utilizzare le seguenti impostazioni del microscopio: Canale A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, guadagno 791; Canale A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, guadagno 659; Canale A647 Pinhole 1.4 Aerea, guadagno 719. </li></ol></li><li> Dopo aver regolato la messa a fuoco dei singoli canali, procedere per acquisire le immagini con una dimensione di fotogramma di 1.024 x 1.024 e un dimensione di pixel di 12.61 μs. </li><li> Conte la percentuale di cellule MyoD positive (controllo per tPosizione corretta sotto la lamina) che sono LC3-negativi e la percentuale di cellule MyoD-positive che visualizzano un segnale LC3. NOTA: la percentuale di cellule MyoD-positive che presentano la colorazione LC3 è la lettura di questo protocollo. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+autophagy:+a+new+metabolic+regulator.">Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator.</a> Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).</li><li>Sandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+skeletal+muscle.">Autophagy in skeletal muscle.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+defective+in+collagen+VI+muscular+dystrophies,+and+its+reactivation+rescues+myofiber+degeneration.">Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration.</a> Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).</li><li>Chrisam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+autophagy+by+spermidine+ameliorates+the+myopathic+defects+of+collagen+VI-null+mice.">Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice.</a> Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+rescues+muscular+dystrophy.">Autophagy induction rescues muscular dystrophy.</a> Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).</li><li>De Palma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+new+therapeutic+target+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy.</a> Cell Death Dis. 3, e418 (2012).</li><li>Hindi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+TRAF6+at+early+and+late+stages+of+muscle+pathology+in+the+mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).</li><li>Pauly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+activation+stimulates+autophagy+and+ameliorates+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse+diaphragm.">AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm.</a> Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).</li><li>Spitali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+Impaired+in+the+Tibialis+Anterior+of+Dystrophin+Null+Mice.">Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice.</a> PLoS Curr. 5, (2013).</li><li>Whitehead, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autophagy+as+a+potential+mechanism+for+the+improved+physiological+function+by+simvastatin+in+muscular+dystrophy.">Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy.</a> Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).</li><li>Whitehead, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare

<html> Questo protocollo descrive come monitorare l&#39;autofagia nelle cellule staminali muscolari scheletriche durante la rigenerazione muscolare compensatoria. Diversi anticorpi per la co-colorazione di LC3 e MyoD sono stati testati e quelli che lavorano nelle sezioni dei tessuti del mouse e creano risultati efficaci sono elencati qui (vedi tabella dei materiali ). La permeabilizzazione con metanolo (vedere la fase 3.2.2) è altamente raccomandata per una corretta colorazione. <p class="jove_conte...

La rigenerazione muscolare scheletrica è il risultato dell&#39;interazione tra cellule staminali adulte (Cellule Muscle Satellite, MuSCs) e altri tipi di cellule che sono coinvolti nel processo rigenerativo. L&#39;omeostasi muscolare e la funzionalità vengono mantenuti dai segnali combinati derivanti dalla nicchia muscolare e dai segnali sistemici 1 , 2 . Durante tutta la vita, sono stati segnalati cambiamenti nella funzionalità MuSC, nella nicchia muscolare e nei segnali sistemici, portando al declino delle capacità funzionali negli anziani 3 . Gli MuSC sono posizionati in una nicchia sotto la lamina basale e, dopo lesioni muscolari, vengono attivate per riparare i muscoli danneggiati 4 , 5 . Al fine di garantire una risposta produttiva rigenerativa, è fondamentale che i MuSC coordinino diversi processi necessari per l&#39;uscita dalla quiescenza, l&#39;autoconsapimento e la fase di espansione proliferativaDalla differenziazione myogenica 6 . Negli anziani e nelle malattie croniche muscolari, tutte queste funzioni sono compromesse, portando a alterate funzionalità muscolare 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Macroautophagy (qui di seguito chiamata autofagia) sta emergendo come un processo biologico essenziale essenziale per preservare l&#39;omeostasi dei tessuti 14 . Il processo autofagico racchiude meccanismi di traffico, in cui parti di citoplasma, organelli e proteine ​​vengono inglobate in vescicole che alla fine sono degradate attraverso il sentiero lisosomico, promuovendo la rimozione di molecole tossiche e il riciclaggio di macromolomolecole. Ciò fornisce composti ricchi di energia per supportare l&#39;adattamento cellulare e tessuto sotto stress o altre condizioni avverse 15 , 16 . Insieme all&#39;attività di sopravvivenza della cellula, l&#39;autofagia può anche funzionare come induttore di cellule-morte, a seconda del contesto dei tessuti cellulari ( ad es. Normale rispetto al tessuto tumorale) e del tipo di stress 17 , 18 . Recenti evidenze indicheranno che l&#39;autofagia è necessaria per mantenere la massa muscolare e l&#39;integrità miofibra 19 e 20 ed è stato riportato di essere alterato nelle distrofie muscolari differenti 21 , 22 , 23 , tra cui la distrofia muscolare Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suInoltre, una riduzione progressiva del processo autofagico è stata osservata negli anziani 31 , 32 , 33 , 34 , 35 dopo una perdita di massa muscolare (chiamata sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , e nella sopravvivenza di myofiber 38 . Un rapporto stretto tra l&#39;autofagia e il potenziale rigenerativo dei muscoli scheletrici è stato anticipato da uno studio del laboratorio di Wagers, che ha dimostrato che una restrizione calorica aumenta la disponibilità e l&#39;attività 39 di MuSC. Questo noÈ stato ulteriormente sostenuto dalla recente osservazione che l&#39;asse Foxo3-Notch attiva il processo autofagico durante l&#39;autocompensamento 40 e la transizione MuSC dalla quiescenza allo stato proliferante 41 . Questi dati sono d&#39;accordo con la progressiva riduzione dell&#39;autofagia basale da giovani a muSC vecchi e geriatriche, in associazione al declino numerico e funzionale delle mucsi durante l&#39;invecchiamento 42 . In un recente studio abbiamo dimostrato una stretta relazione tra l&#39;autofagia e la rigenerazione muscolare compensativa che distingue le prime fasi della progressione del DMD. Di conseguenza, abbiamo osservato un flusso autofagico ridotto nelle fasi successive della progressione della malattia, quando si compromette la rigenerazione muscolare e si verifica la deposizione di tessuti fibrotici. Intrigante, abbiamo mostrato che, in condizioni di rigenerazione, l&#39;autofagia è attivata in MuSCs e che la modulazione del processo autofagico impatta l&#39;attivazione di MuSC e fuNicità 30 . Complessivamente, questi dati evidenziano l&#39;urgenza di esplorare il processo autofagico in MuSC durante la rigenerazione muscolare in condizioni normali e patologiche e per tutta la durata della vita. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico in MuSCs in condizioni di rigenerazione muscolare eseguendo in immunoterapia in situ la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3), un marker di autophagy 43 e MyoD, un marker di Lineage miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il MuSC, che svolge un ruolo chiave nell&#39;orchestrare la rigenerazione muscolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:332px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:251px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:128px;">000664</td>
			<td style="width:196px;">WT mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cardiotoxin 1</td>
			<td>Latoxan</td>
			<td>L8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Millex-VV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td style="width:196px;">Syringe Filter Unit, 0.1 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">BD Micro-Fine + 0,5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:122px;">o-Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1040</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LC3B Antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>2775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:332px;">Monoclonal mouse anti-MyoD 
			(concentrated) clone 5.8A</td>
			<td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td>
			<td>M3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Laminin-2 (&#945;-2-chain) monoclonal antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>4H8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A21248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

L&#39;aumento delle evidenze indica l&#39;autofagia come un processo regolatorio cruciale per preservare l&#39;omeostasi dei tessuti. È noto che l&#39;autofagia è coinvolta nello sviluppo e nella rigenerazione muscolare dello scheletro, e il processo autofagico è stato descritto in molte patologie muscolari e nei disturbi muscolari legati all&#39;età. Un blocco recentemente descritto del processo autofagico che è correlato con l&#39;esaurimento funzionale delle cellule satellitari durante la riparazione muscolare supporta la nozione che l&#39;autofagia attiva è accoppiata con la rigenerazione muscolare produttiva. Questi dati scoprono il ruolo cruciale dell&#39;autofagia nell&#39;attivazione delle cellule satellite durante la rigenerazione muscolare sia nelle condizioni normali che patologiche, come le distrofie muscolari. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico nel vano adulto di cellule staminali muscolari (MuSC) durante le condizioni di rigenerazione muscolare. Questo protocollo descrive la metodologia di setup per eseguire in situ immunofluorescenza imaging di LC3, un aMarcatore di utopia, e MyoD, un marcatore di linee miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il compartimento MuSC, che svolge un ruolo centrale nell&#39;orchestrare la rigenerazione muscolare.

Questo protocollo descrive un metodo efficace in situ per rilevare l&#39;autofagia in MuSC durante la rigenerazione muscolare. CTX trattamenti in vivo : Utilizzare CTX per indurre danni muscolari nei muscoli TA e utilizzare i muscoli non protetti come controlli. Poiché l&#39;autofagia è altamente dinamico, bloccare il flusso autofagico eseguendo ini...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

L&#39;autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l&#39;attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

in-situ-immunofluorescent-staining-of-autophagy-in-muscle-stem-cells

Research

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Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K Views.  Italian National Research Council.  L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. 

Video: In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Biologia

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita<em&gt; Ex vivo</em&gt; E Muscolo tibiale anteriore<em&gt; In situ</em&gt; In Mouse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...