Questo lavoro è stato supportato dal Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) a RSA, Merit Award (RX002615) e Research Career Scientist Award (RX003134) a MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) ad AJF, EY028859 a MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevent Blindness e Foundation Fighting Blindness.

Tutte le procedure descritte sono state approvate dall'Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee e conformi alla guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH Publications, 8aedizione, aggiornata nel 2011).
NOTA: il sistema SD-OCT utilizzato per sviluppare il protocollo riportato di seguito è descritto nella tabella dei materiali. Sebbene alcune procedure siano specifiche di questo particolare sistema, l'approccio globale può essere adattato ad altri dispositivi OCT e modelli animali. Inoltre, nel nostro laboratorio, questi protocolli sono comunemente usati nei topi e nei ratti; tuttavia, l'approccio generale può essere adottato per diversi modelli animali e dispositivi SD-OCT a condizione che un individuo abbia l'obiettivo e le capacità corrette sul proprio dispositivo.
1. Impostare l'apparecchiatura per la tomografia a coerenza ottica
<ol><li>Aprire il software SD-OCT (Table of Materials).</li>
	<li>Definire chi sta assumendo l'OCT, lo studio e il braccio di trattamento (se pertinente). Assegna un nome a queste categorie in modo da aiutare i ricercatori a cercare le scansioni desiderate in seguito durante l'analisi dei dati.<ol><li>Nella scheda Paziente/Esame , fare clic su Test Examiner. Selezionare il nome dell'esaminatore. Utilizzare il pulsante Imposta esaminatori e medici per aggiungere nuovi esaminatori.</li>
		<li>Fare clic su Nome studio per definire lo studio . Fare clic sulla scheda Studio per aggiungere un nuovo studio o modificare i trattamenti in uno studio esistente. Fare clic a destra di Seleziona braccio di trattamento per selezionare un braccio di trattamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare clic sul pulsante Aggiungi paziente , utilizzato per aggiungere un nuovo punto temporale per un intero gruppo. Quando viene visualizzata la finestra, immettere il numero ID, Nome e Cognome. Seleziona Maschio o Femmina. Inserisci la data di nascita.</li>
	<li>Fai clic sul pulsante Aggiungi esame per aggiungere i singoli ratti. Per identificare i ratti, fai clic su un esame. Fai clic su Modifica esame. Immettere il numero ID nella casella Immetti note . Fare clic sul pulsante Salva modifiche .</li>
	<li>Collegare l'obiettivo corretto al dispositivo (Figura 1B), selezionare la configurazione corrispondente nel software e comporre la posizione del braccio di riferimento associata. NOTA: Il sistema SD-OCT descritto ha lenti personalizzate, modelli di scansione preimpostati e impostazioni del braccio di riferimento specifiche per la specie animale e la regione dell'occhio da visualizzare (retina o cornea, topo o ratto). Alcuni di questi dettagli sono specifici del sistema SD-OCT descritto (vedere la tabella dei materiali). Ad esempio, non tutti i dispositivi offrono la regolazione manuale della lunghezza del percorso del braccio di riferimento .</li>
	<li>Nella scheda Paziente/Esame , fare doppio clic sull'esame evidenziato per passare alla scheda Imaging e iniziare l'imaging o semplicemente fare clic sulla scheda Imaging . Se è presente una scansione predefinita, fare clic con il pulsante destro del mouse per eliminarla.</li>
	<li>Caricare un protocollo di scansione preimpostato facendo clic sul pulsante Seleziona un protocollo dall'elenco . In alternativa, aggiungere singole scansioni.</li>
	<li>Per i modelli di ratto di glaucoma e retinopatia diabetica e i modelli murini di degenerazione retinica, scegliere un preset composto da quattro immagini: 2 scansioni OD e 2 OS. Per la miopia del mouse, scegli un preset composto da 8 immagini: 4 OD e 4 scansioni OS. NOTA: L'imaging preimpostato verrà spiegato più dettagliatamente nella Sezione 3. Questo è qualcosa che ogni laboratorio fa per se stesso o con il produttore durante l'installazione in loco.</li>
</ol>2. Anestetizzare l'animale
<ol><li>Somministrare anestetico.<ol><li>Anestetizzare ratti con ketamina (60 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.</li>
		<li>Anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.</li>
		<li>Attendere che gli animali siano completamente anestetizzati e non rispondano al pizzico delle dita dei piedi.</li>
	</ol></li>
	<li>Somministrare gocce di dilatazione della pupilla (1% tropicamide). Attendere che le pupille si dilatino prima di immaginare. NOTA: la dilatazione delle pupille aumenta il campo visivo ma non è un requisito. Le gocce di anestetico locale (cornea) (0,5% di tetracaina) per intorpidire l'occhio dovrebbero essere utilizzate anche se qualcosa toccherà l'occhio (ad esempio, se si applicano lenti a contatto o si utilizza una guida). Una guida è un dispositivo che viene posizionato sopra la testa di scansione e aiuta i principianti ad allineare l'occhio e la testa di scansione.</li>
	<li>Dopo aver anestetizzato il roditore, posizionare il roditore in un sistema di allineamento dei roditori che può ruotare l'animale nello spazio 3-dimensionale (Figura 1A, 1C e 1D). Fornire supporto termico. NOTA: Attualmente, utilizziamo sistemi di allineamento dei roditori per topi e ratti progettati e venduti con il dispositivo SD-OCT.</li>
	<li>Applicare liquidi (ad esempio, salini o lacrime artificiali) per mantenere gli occhi lubrificati. Assicurarsi che l'occhio non si asciughi durante l'imaging in modo che le proprietà ottiche dell'occhio siano mantenute tra le scansioni (quando la cornea è bagnata, la retina può essere vista chiaramente).<ol><li>Assicurati di mantenere l'umidità nell'occhio opposto durante la scansione del primo occhio in modo che non si asciughi.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare una delicata pulizia per rimuovere la soluzione salina in eccesso poco prima dell'imaging, poiché troppo o troppo poco lubrificante sull'occhio influenzerà la qualità dell'immagine. NOTA: L'uso di gel lubrificante sterile non è raccomandato durante l'OCT poiché può interferire con l'imaging. Se necessario, dopo la procedura può essere utilizzato gel lubrificante sterile. Una lente a contatto può anche essere applicata per garantire un'adeguata umidità sull'occhio durante il test. Nella nostra esperienza, una lente a contatto non ha fornito un netto miglioramento della qualità dell'immagine, ma le lenti a contatto aiutano a ridurre il rischio di secchezza della cornea durante la sessione di imaging.</li>
</ol>3. Imaging OCT dei roditori
<ol><li>Inizia con un occhio (OS o OD) e immagina l'occhio controlaterale dopo.<ol><li>Posizionare l'animale usando i due movimenti rotazionali del sistema di allineamento dei roditori, in modo tale che lo sguardo sia orizzontale e guardando verso il basso l'asse della lente OCT (Figura 1D).</li>
		<li>Utilizzare lo Strumento di personalizzazione di Office in modalità Esecuzione libera per orientare la retina per la raccolta dei dati. Utilizzare la modalità Aim (facendo clic sul pulsante Mira) inizialmente per una visualizzazione continua delle scansioni B orizzontali e verticali in tempo reale.</li>
		<li>Spostare la testina di scansione più vicino all'occhio fino a quando la retina è visibile (poiché le lenti della retina del topo e del ratto sono a fuoco fisso, spostare la lente verso l'occhio si concentra più in profondità nella retina). Quindi utilizzare il sistema di allineamento dei roditori per regolare la posizione dell'animale su / giù e ruotare / ruotare per posizionare la testa del nervo ottico al centro, rendere orizzontale la scansione orizzontale e verticale la scansione verticale (Figura 1A).</li>
		<li>Regolare la distanza di lavoro in modo che l'immagine retinica sia piatta e non curva.</li>
		<li>Regolate la posizione del braccio di riferimento per mantenere l'immagine vicino alla parte superiore della finestra di visualizzazione. Fai attenzione a non spingere troppo lontano o l'immagine dell'occhio si capovolgerà su se stessa.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging retinico<ol><li>Per i modelli di glaucoma, degenerazione retinica e retinopatia diabetica: definire una scansione del volume composta da 1000 x 100 x 1 (scansioni A x scansioni B x scansioni B ripetute) per la media. Nei ratti, eseguire una scansione del volume di 3 x 3 mm. Nei topi, eseguire una scansione del volume di 1,5 x 1,5 mm.</li>
		<li>Centrare il nervo ottico nell'accesso orizzontale e verticale in modo che la scansione del volume sia al centro. Prenditi del tempo per assicurarti che la testa del nervo ottico sia al centro della scansione e dritta lungo gli assi nasale-temporale e superiore-inferiore (Figura 2). Scansiona e ricentra per assicurarti che sia esattamente al centro, se necessario. Ripetere questa scansione se necessario fino a quando la testa del nervo ottico è centrata e allineata lungo entrambi gli assi. Fai clic sul pulsante Istantanea per scattare una foto. NOTA: alcuni dispositivi SD-OCT hanno la possibilità di manipolare otticamente la curvatura dell'occhio (ad esempio, l'immagine è appiattita) regolando la distanza dell'occhio dalla sorgente luminosa con il braccio di riferimento. Si consiglia di appiattire e centrare le immagini quando si effettuano misurazioni dirette dello spessore attraverso gli strati retinici per migliorare la precisione lungo la direzione antero-posteriore.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Salva per salvare l'immagine.</li>
		<li>Fai una scansione radiale centrata sulla testa del nervo ottico che è 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x ripetute B-scans). Utilizzare ripetute scansioni B per migliorare la chiarezza dell'immagine dell'occhio o della retina, che aiuterà a interpretare le regioni dell'occhio o gli strati della retina durante l'analisi dei dati. NOTA: Ancora una volta, nei ratti questa scansione radiale è di 3 mm, mentre nei topi la scansione radiale è di 1,5 mm.</li>
		<li>Salvare l'immagine.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.2.5 nell'occhio controlaterale.</li>
	</ol></li>
	<li>Misure di lunghezza assiale<ol><li>Per i progetti che coinvolgono l'imaging dell'intero occhio, come la miopia del topo, eseguire tre scansioni dell'intero occhio e una scansione della retina per ciascun occhio. Scegli un preset che consiste in una scansione radiale di 500 x 20 x 1 e comprende l'intero diametro dell'occhio. NOTA: questa impostazione fornisce un'immagine dell'intera lunghezza dell'occhio del mouse dalla cornea alla coroide.</li>
		<li>Centrare il centro dell'occhio e la retina nel campo visivo. Prendi tre scansioni radiali (scansioni dell'occhio intero): una scansione lineare B che è 1000 x 5 x 2 e due ulteriori scansioni lineari B di 1000 x 5 x 2 nella stessa posizione. Salvare le immagini.</li>
		<li>Successivamente, se lo si desidera, ingrandire ed eseguire una scansione del volume o rettangolare (scansione della retina) simile alla descrizione in 3.2 che consiste in scansioni 1000 x 20 A x scansioni B. Salvare la scansione del volume.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.3.3 nell'occhio controlaterale. NOTA: le misurazioni della lunghezza assiale sono possibili solo su occhi piccoli (mouse o più piccoli) poiché la finestra di imaging dei sistemi attuali non è abbastanza grande da catturare un occhio più grande.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fasi post-imaging
<ol><li>Archivia i dati salvati su un cloud, che è una buona pratica per la gestione dei dati e consente un facile accesso per analisi successive. Eseguire analisi dei dati con software personalizzato sviluppato in un programma di modellazione matematica (Table of Materials).</li>
	<li>Rimuovere il roditore dal sistema di allineamento dei roditori e somministrare un'iniezione intraperitoneale di atipamezolo (1 mg/kg per ratti e topi) per invertire gli effetti della xilazina, in modo che il roditore si svegli più rapidamente.</li>
	<li>Consentire ai roditori di recuperare su una piastra elettrica a fuoco basso. Dare ulteriori gocce saline se necessario. Riportare i roditori nella loro gabbia di casa quando hanno riacquistato la deambulazione completa.</li>
	<li>Chiudere il programma e disattivare lo Strumento di personalizzazione di Office.</li>
</ol>5. Post-elaborazione delle immagini OCT
<ol><li>Elaborare le immagini utilizzando un software personalizzato sviluppato in un programma di modellazione matematica per soddisfare specifiche esigenze dello Strumento di personalizzazione (ad esempio, misurare lo spessore delle aree di interesse contrassegnando manualmente le immagini).</li>
	<li>A seconda dello scopo dell'immagine (retina del topo, retina del ratto o miopia/lunghezza assiale), utilizzare uno dei tre diversi programmi:<ol><li>Per l'elaborazione della retina, selezionare le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office da caricare. Innanzitutto, definisci il centro della testa del nervo ottico con un semplice clic.</li>
		<li>Guarda come il programma genera linee verticali che definiscono le distanze su entrambi i lati della testa del nervo ottico. Si noti che nella retina di ratto, queste linee sono a 0,5 mm e 1,2 mm di distanza dal centro della testa del nervo ottico, per un totale di 4 linee verticali che rappresentano gli assi naso-temporale e inferiore-superiore dell'occhio a seconda della scansione radiale B attualmente analizzata. NOTA: Nella retina del topo, queste linee verticali si trovano a 0,25 mm e 0,5 mm dal centro della testa del nervo ottico.</li>
		<li>Delinea i seguenti livelli lungo ogni riga: Lo strato di fibre nervose retiniche (RNFL), lo strato plessiforme interno (IPL), lo strato nucleare interno (INL), lo strato plessiforme esterno (OPL), lo strato nucleare esterno (ONL), la membrana limitante esterna (ELM), i segmenti interni / segmenti esterni (IS / OS), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e lo spessore retinico totale. NOTA: La scansione radiale in genere non ha etichette nasali / temporali e superiori / inferiori quando viene aperta. Le scansioni possono essere create in modo tale da avere un orientamento n/t e s/I, e quelle scansioni in particolare vengono analizzate in seguito.</li>
		<li>Dopo che un'immagine è stata delineata e il programma chiuso, esportare queste misurazioni in un software di foglio di calcolo per l'analisi dei dati.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare questi valori di lunghezza e spessore del passaggio 5 per effettuare confronti tra gruppi, ad esempio determinando se esistono differenze regionali (n/t/s/i) o cambiamenti longitudinali.</li>
	<li>Per le misurazioni della retina, determinare innanzitutto se ci sono differenze nell'asse naso-temporale e inferiore-superiore alle distanze di 0,5 mm e 1,2 mm. NOTA: Se non si osservano differenze nei quadranti, le misurazioni di 0,5 mm e 1,2 mm possono essere mediate insieme. Questo è un approccio simile per le scansioni retiniche del topo solo a 0,25 mm e 0,5 mm.</li>
	<li>Per gli studi sulla miopia, utilizzare questo programma per valutare i parametri oculari lungo l'asse ottico dell'occhio. Aprire il programma di modellazione matematica. Innanzitutto, seleziona un'immagine da caricare.<ol><li>Dopo aver caricato l'immagine, contrassegnare manualmente ogni scansione (radiale e B). Contrassegnare i bordi anteriore e posteriore della cornea, della lente, della camera vitreale e della retina, in modo che il programma calcoli lo spessore corneale, lo spessore della lente, la profondità della camera anteriore e vitreale, lo spessore totale della retina, la lunghezza assiale totale.</li>
		<li>Dopo la marcatura, uscire dal programma che richiede un menu di salvataggio. Salva i valori delineati in un software per fogli di calcolo e calcola la media delle tre scansioni separate insieme.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast-Mediated+Traumatic+Brain+Injury+Exacerbates+Retinal+Damage+and+Amyloidosis+in+the+APPswePSENd19e+Mouse+Model+of+Alzheimer's+Disease.">Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease.</a> Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+image+processing+for+optical+coherence+tomographic+angiography+of+macular+diseases.">Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).</li><li>Muhlfriedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Subretinal+Injection+Technique+for+Gene+Therapy+Approaches.">Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).</li><li>Adekunle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Perforated+Subretinal+Prostheses+With+Retinal+Tissue.">Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 4 (4), 5 (2015).</li><li>Sajdak, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+the+tree+shrew+eye:+Wavefront+analysis+and+retinal+imaging+with+correlative+histology.">Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology.</a> Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).</li><li>Dominik Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+functional+and+structural+characterization+of+a+macular+lesion+in+a+rhesus+macaque.">Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque.</a> Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).</li><li>Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+angiography:+Technical+principles+and+clinical+applications+in+ophthalmology.">Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology.</a> Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).</li><li>Treister, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Subclinical+CNV+and+Choriocapillaris+Nonperfusion+in+Fellow+Eyes+of+Unilateral+Exudative+AMD+on+OCT+Angiography.">Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 7 (5), 19 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging ad alta risoluzione delle strutture oculari in vivo consente di valutare i cambiamenti retinici e oculari nel tempo. In questo protocollo, SD-OCT ha dimostrato di catturare le differenze nelle strutture oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.
L'aspetto più critico quando si esegue SD-OCT è ottenere un'immagine chiara della retina o di un'altra struttura oculare di interesse. È importante prendersi del tempo per assicurarsi ch...

La tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) è una modalità di imaging precisa e ad alta risoluzione che consente a medici e ricercatori di esaminare le strutture oculari in modo non invasivo. Questa tecnica di imaging si basa sull'interferometria per catturare immagini retiniche tridimensionali in vivo su scala micrometrica 1,2. È diventata una delle modalità di imaging più frequentemente utilizzate nella ricerca visiva e nella clinica a causa della facile individuazione e accuratezza di caratteristiche patologiche come difetti strutturali e / o assottigliamento degli strati retinici e del liquido sottoretinico3. Nella ricerca che utilizza modelli animali di disturbi visivi, SD-OCT ha fornito analisi essenziali non invasive delle relazioni tra struttura e funzione e delle loro origini istopatologiche4. Grazie alla sua risoluzione (fino a 2-3 micron, a seconda della profondità nell'occhio5), SD-OCT ha la capacità di rilevare anche piccoli cambiamenti nello spessore dello strato retinico. Questo tipo di analisi può fornire informazioni essenziali per la progressione della malattia e valutare l'efficacia dei metodi neuroprotettivi e dei trattamenti per i disturbi della vista.
SD-OCT è un'alternativa non invasiva all'esame istologico della struttura e i due hanno dimostrato di essere correlati6. Mentre SD-OCT non raggiunge la risoluzione cellulare, consente studi longitudinali negli animali. Ciò è vantaggioso perché la progressione della malattia può essere monitorata nei singoli animali nel tempo invece di dover eutanasia sugli animali in punti temporali specifici. Man mano che le tecniche di imaging continuano a migliorare, anche la tecnologia SD-OCT progredirà, fornendo una migliore qualità dell'immagine e la capacità di valutare i processi biologici come la funzione dei vasi sanguigni retinici in dettaglio. Fin dal suo avvento nel 1991, la tecnologia SD-OCT ha visto enormi progressi in termini di risoluzione, velocità e sensibilità7.
Il presente studio utilizza un sistema SD-OCT per quantificare i cambiamenti negli strati retinici nei modelli di roditori di degenerazione retinica, glaucoma e retinopatia diabetica. Il sistema SD-OCT utilizzato qui è un sistema OCT di dominio di Fourier che utilizza luce a bassa potenza nel vicino infrarosso per acquisire, elaborare e memorizzare immagini risolte in profondità in tempo reale. Il sistema SD-OCT ha esteso la capacità di imaging della profondità nella banda di lunghezza d'onda di 800 nm, fornendo una profondità di 8 mm e una risoluzione di 4 μm. Nel rilevamento del dominio di Fourier, il segnale di interferenza tra la luce diffusa dal tessuto e un percorso di riferimento è trasformato di Fourier per costruire scansioni assiali e/o profili di profondità assiale di intensità diffusa8. Per gli studi qui, il fascio OCT viene scansionato sulla struttura retinica desiderata mentre acquisisce in serie scansioni assiali. In genere, un modello di scansione acquisisce la griglia bidimensionale (B-Scans) come una raccolta di linee di scansione lineari unidimensionali (A-Scans), che corrispondono a immagini in sezione trasversale 2D utilizzando un modello di scansione raster. Per gli studi incentrati sulla miopia nei topi, questo sistema viene utilizzato anche per misurare le dimensioni delle strutture oculari (ad esempio, spessore della cornea, spessore del cristallino, profondità della camera vitreale e lunghezza assiale).
L'attuale sistema consente agli utenti di progettare i propri protocolli, creando scansioni che possono essere personalizzate e selezionate in base alle strutture oculari di interesse. Le scansioni principali presenti in questi protocolli definiti dall'utente rendono questa tecnica di imaging facile da usare. Per l'analisi delle immagini, abbiamo sviluppato una programmazione personalizzata in un programma di modellazione matematica. SD-OCT è un potente strumento per identificare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti patomorfologici nelle strutture oculari e monitorare la progressione della malattia correlata alla vista.

<table><tbody><tr><td>1% tropicamide</td><td>Sandoz</td><td>Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59</td><td></td></tr><tr><td>0.5% tetracaine</td><td>Alcon</td><td>NDC 0065-0741-12</td><td></td></tr><tr><td>AIM-RAS G3 120 V</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-AIMRAS-G3-120</td><td>Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice</td></tr><tr><td>Celluvisc gel</td><td>REFRESH CELLUVISC</td><td>#4554; NDC-0023-4554-30</td><td></td></tr><tr><td>G3 18 mm Telecentric Lens</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-BORE-G3-18</td><td></td></tr><tr><td>G3 Mouse Lens</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-BORE-G3-M</td><td></td></tr><tr><td>G3 Rat Lens</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-BORE-G3-R</td><td></td></tr><tr><td>heating pad</td><td>Fabrication</td><td>11-1130</td><td></td></tr><tr><td>InVivoVue software</td><td>Leica Bioptigen</td><td></td><td>Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>mathematical modeling program</td></tr><tr><td>Mouse/Rat Kit</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-KIT-M/R</td><td>Mouse/rat rodent alignment system</td></tr><tr><td>saline</td><td>ADDIPAK</td><td>200-39</td><td></td></tr><tr><td>System Envisu R4300 VHR 120 V</td><td>Leica Bioptigen</td><td>90-R4300-V1-120</td><td>SD-OCT system</td></tr></tbody></table>

in vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography

La tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) è utile per visualizzare le strutture retiniche e oculari in vivo. Nella ricerca, SD-OCT è uno strumento prezioso per valutare e caratterizzare i cambiamenti in una varietà di modelli di malattie e lesioni retiniche e oculari. Nei modelli di degenerazione retinica indotta dalla luce, SD-OCT può essere utilizzato per tracciare l'assottigliamento dello strato di fotorecettore nel tempo. Nei modelli di glaucoma, SD-OCT può essere utilizzato per monitorare la diminuzione dello strato di fibre nervose retiniche e lo spessore totale della retina e per osservare la coppettazione del nervo ottico dopo aver indotto ipertensione oculare. Nei roditori diabetici, SD-OCT ha aiutato i ricercatori a osservare una diminuzione dello spessore retinico totale e una diminuzione dello spessore di specifici strati retinici, in particolare lo strato di fibre nervose retiniche con progressione della malattia. Nei modelli murini di miopia, SD-OCT può essere utilizzato per valutare i parametri assiali, come le variazioni della lunghezza assiale. I vantaggi di SD-OCT includono l'imaging in vivo delle strutture oculari, la capacità di tracciare quantitativamente i cambiamenti nelle dimensioni oculari nel tempo, la sua rapida velocità di scansione e alta risoluzione. Qui, descriviamo in dettaglio i metodi di SD-OCT e mostriamo esempi del suo utilizzo nel nostro laboratorio in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia. I metodi includono l'anestesia, l'imaging SD-OCT e l'elaborazione delle immagini per le misurazioni dello spessore.

SD-OCT è considerato di successo se si ottengono immagini di alta qualità in modo tale che le dimensioni oculari possano essere misurate in modo affidabile. Qui, una varietà di usi di SD-OCT sono illustrati utilizzando modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.
In un modello di degenerazione retinica indotta dalla luce (LIRD), l'esposizione alla luce intensa (10.000 lux) induce la degenerazione delle cellule fotorecettrici nella retina9</s...

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In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...

in-vivo-structural-assessments-ocular-disease-rodent-models-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.8K Views.  Atlanta Veterans Affairs Medical Center. Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Video: In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Neuroscienze

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Medicina

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Allineamento del fibrogramma OCT della retina del topo con immagini confocali

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autore in primo piano: Progressi nell'imaging retinico in vivo ed ex vivo per migliorare la diagnosi e il trattamento del glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images from which the retinal thickness can be calculated. Although OCT is widely used in clinical practice, its application in basic research is not as prevalent, especially in small animals such as mice. Because of the small size of their eyeballs, it is challenging to conduct fundus imaging examinations in mice. Therefore, a specialized retinal imaging system is required to accommodate OCT imaging on small animals. This article demonstrates a small-animal-specific system for OCT examination procedures and a detailed method for image analysis. The results of retinal OCT examination of very-low-density lipoprotein receptor (Vldlr) knockout mice and C57BL/6J mice are presented. The OCT images of C57BL/6J mice showed retinal layers, while those of Vldlr knockout mice showed subretinal neovascularization and retinal thinning. In summary, OCT examination could facilitate the noninvasive detection and measurement of retinopathy in mouse models.

Here, we describe an in vivo imaging technique using optical coherence tomography to facilitate the diagnosis and quantitative measurement of retinopathy in mice.

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1^gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia