Questo lavoro è stato sostenuto dai scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. Microfabbricazione è stata effettuata con il supporto della struttura McGill Nanotools MicroFab alla McGill University e il Dipartimento di Elettronica presso la Carleton University.

Il sangue viene raccolto da individui sani, con l&#39;approvazione del comitato etico dell&#39;Università di Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication I microcanali sono fabbricati in base alle tecniche fotolitografiche standard di 18. <ol><li> Progettare la geometria microcanali con un design software Computer Aided (CAD) e stampare la configurazione su una trasparenza foto-maschera. Queste maschere sono fondamentali in quanto dettano il percorso della luce durante il processo di fabbricazione. In questo caso, le dimensioni microcanali sono 120 micron di spessore, 60 micron di profondità e 7 mm di lunghezza. </li><li> In una camera bianca, cappotto centrifuga una base epossidica negativo fotoresistenti su un wafer di silicio a 2.000 rpm per 30 secondi per ottenere la profondità desiderata microcanali (60 micron). </li><li> Esporre il wafer e la foto-maschera sotto una lampada UV a 650 mJ / cm 2 per 70 sec. Assicurare per esporre solo le aree trasparentifoto-maschera alla luce UV. L&#39;esposizione delle aree trasparenti consente per la polimerizzazione delle catene con conseguente indurimento della foto-resist. Immergere il pezzo di silicio in uno sviluppatore per rimuovere l&#39;eccesso di foto-resistere. </li><li> Una volta che lo stampo è fabbricato, mescolare un elastomero a base di silicio e un agente indurente in un rapporto di 10: 1 per creare una soluzione di poli-dimetil-silossano (PDMS). Mettere la soluzione PDMS in una camera a vuoto degassare. Versare nello stampo e scaldare a 60 ° C per 90 min per creare microcanali. Poi legare i singoli canali di un vetrino con ossigeno legame plasma per 90 sec. NOTA: il processo di PDMS degassamento è eseguita al fine di eliminare le bolle d&#39;aria generate dal processo di miscelazione. </li><li> Verificare che le dimensioni microcanali consentono per il test di successo. In questo protocollo, i microcanali hanno una sezione rettangolare di 120 x 60 micron. In confronto, un RBC media ha un diametro di 8 micron e spessore di 2 micron. Ilrefore, la larghezza microcanali è sufficiente osservare l&#39;aggregazione adeguato e determinare con precisione i profili di velocità. </li></ol> 2. Il sangue Preparazione <ol><li> Prelevare il sangue da donatori volontari sani, dopo l&#39;approvazione di un comitato etico. Trattare il sangue con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) presente nei tubi di raccolta (7,2 mg di EDTA in 4 ml di sangue). NOTA: L&#39;EDTA viene utilizzato per evitare la coagulazione del sangue. </li><li> Centrifugare i campioni di sangue tre volte per 10 min a 1400 xg (3.000 rpm) per separare i costituenti del sangue. Come risultato della centrifugazione, osservare tre strati distinti. NOTA: I tre strati sono lo strato RBC (situato nella parte inferiore del tubo), il buffy coat (comprensivi di globuli bianchi e piastrine situati sulla parte superiore dello strato RBC) e lo strato di plasma (si trova sulla parte superiore di tutte le altre costituenti). <ol><li> Dopo la prima centrifugazione, raccogliere il plasma di sangue con una pipetta di sangue. Evitare ogni contact con il buffy coat. </li><li> Raccogliere e smaltire il buffy coat in un contenitore con candeggina diluita al 10%. </li><li> Aggiungere 3 ml di PBS pH 7,4 a ciascuno dei tubi con il restante strato di RBC e garantire il corretto equilibrio della centrifuga. Mescolare delicatamente le provette e centrifugare di nuovo a 1.400 g (3.000 rpm) per 10 minuti. NOTA: Assicurarsi che la soluzione PBS non contiene magnesio o calcio in quanto potrebbero alterare l&#39;adesione cellulare. </li><li> Smaltire il PBS nei tubi dopo la seconda centrifugazione e rimuovere il residuo buffy coat, se presente. Ripetere i punti 2.2.3 e 2.2.4 per la terza centrifugazione a cedere globuli rossi puliti. </li></ol></li><li> Miscelare la quantità richiesta (0,05, 0,1 e 0,15 ml) dei globuli rossi pulite con plasma (0,95, 0,9 e 0,85 ml) in una provetta 1 ml per ottenere RBC-sospensioni con il corrispondente (5%, 10% e 15% ) ematocrito. Controllare ematocrito con una microcentrifuga. </li></ol> 3. Fluidi Preparazione <ol><li> Aggiungere 60 ml di soluzione di particelle traccianti fluorescenti (solido 1%, d particella = 0. 86 micron, λ abs = 542 nm ed emissione λ = 612 nm) nelle provette da 1 ml RBC-sospensione. NOTA: Le particelle traccianti fluorescenti (tinti internamente particelle di polistirene) vengono utilizzati per misurare la velocità del flusso all&#39;interno del microcanale. Queste particelle fluorescenza quando esposto alla corrispondente lunghezza d&#39;onda del fascio laser (λ = 542 nm). </li><li> Preparare una soluzione di PBS pH 7,4 e aggiungere 60 ml della stessa soluzione particelle traccianti fluorescenti in 1 ml di soluzione PBS. </li></ol> 4. Aggregati Misure Taglia <ol><li> Per inserire i fluidi (RBC-sospensioni e PBS) nel microcanali, utilizzare due siringhe in vetro da 25 ml e 100 ml. Questo saràcontribuire a ridurre la conformità del sistema. Collegare i microcanali alle siringhe con tubi e connettori montaggio i fori di ingresso. Riempire le siringhe di vetro utilizzando la differenza di pressione esistente tra il contenitore del liquido e la siringa. Assicurarsi che nessun bolle sono presenti nel sistema. Come metodo alternativo, utilizzare un sistema di controllo pressione per guidare entrambi i fluidi in microcanali. </li><li> Posizionare il microcanali su una fase microscopio invertito collegato ad una telecamera ad alta velocità e sistema μPIV. Programma la pompa a siringa per le portate desiderate (ad esempio, Q = 2 microlitri / hr per sangue generare una portata di Q = 8 microlitri / hr per PBS). NOTA: viene utilizzato solo una pompa a siringa. Utilizzando due diverse siringhe di vetro, con due diversi diametri interni, è possibile variare la portata entrare ogni ramo della Y-microcanali. </li><li> Inserire entrambi i fluidi nel doppio Y-microcanali ciascuno da un ramo di ingresso diverso e in diverse portate come mostrato in <strong&gt; Figura 1. Al fine di testare diverse velocità di taglio, cambiare la portata della pompa. Questo mantiene lo stesso rapporto appropriato (in questo caso 4) fra i due rami 19 (figure 2 e 3). Attendere che il flusso per raggiungere lo stato stazionario prima di acquisire le misure: controllare visivamente le immagini della telecamera ad alta velocità per un flusso regolare. NOTA: Il rapporto è fondamentale per ottenere un profilo di velocità lineare all&#39;interno dello strato di anima. </li><li> Visualizzare i globuli rossi utilizzando la macchina fotografica ad alta velocità. Collegare la fotocamera a un computer per controllare, registrare e salvare le immagini del flusso del fluido. Una volta che i due flussi di fluido si stabilizzano, avviare la registrazione. <ol><li> Acquisire diverse immagini per ottenere migliori risultati di trattamento. Determinare un tempo di esposizione ottimale della telecamera per una chiara immagine degli aggregati. NOTA: Il tempo di esposizione della fotocamera per questo caso era di 0,5 msec. La scelta di intervallo di tempo tra ogni fotogramma si basa sulla velocità di quadro telecamera e la portata in tegli microcanali. Il tempo tra ogni fotogramma trattati in questa procedura è stata di 60 msec. Pertanto una fotocamera in grado di registrare 18 fotogrammi al secondo è sufficiente. NOTA: Evitare di sedimentazione del sangue nel tubo e la siringa, che potrebbe portare a errori di misurazione. </li></ol></li><li> Usando tecniche di elaborazione delle immagini (un programma MATLAB in questo caso) inteso a migliorare la qualità dell&#39;immagine, rilevare gli aggregati in ciascuna delle immagini basato su intensità di pixel (illustrato nella figura 4) come segue: <ol><li> Migliorare le immagini contrastano con il metodo istogramma pareggio per ottenere una migliore qualità dell&#39;immagine per ogni fotogramma. </li><li> Convertire le immagini in scala di grigi in immagini binarie. A questo scopo, impostare un valore di soglia, che varia da 0 a 1, che determina la conversione di ciascun pixel. Ogni pixel nell&#39;immagine di sotto del valore di soglia sarà rilevato come un pixel nero, mentre i pixel con valori superiori alla soglia vengono rilevati come pixel bianchi. </li><li> Riempire ilfori (se presente e necessario) corrispondenti alle lacune entro un aggregato per ottenere risultati migliori. </li><li> Rilevare le cellule determinando pixel vicini bianchi nell&#39;immagine binaria in modo che le cellule adiacenti sono associate come aggregati. </li><li> Etichettare i diversi aggregati rilevati e convertire l&#39;immagine binaria in immagine un rosso-verde-blu (RGB) per una migliore visualizzazione. Combinare i fotogrammi originali con ciascuna delle corrispondenti immagini elaborate per verificare l&#39;efficienza della tecnica di elaborazione di immagini e di garantire che tutte le cellule sono presi in considerazione, come mostrato in Figura 5. Eseguire i punti 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 e 4.5.5 per tutti i fotogrammi acquisiti. </li><li> Calcolare l&#39;area di ogni aggregato rilevato nel frame in base al numero di pixel rilevati. Sulla base di ingrandimento obiettivo utilizzato, calcolare il fattore di conversione, utilizzando un reticolo di calibrazione, e convertire i risultati micron 2. Calcolare la media dei formati aggregati rilevati in ognitelaio e quindi la media dei risultati per tutti i frame per ottenere la dimensione media aggregata per ogni registrazione di RBC-sospensioni. </li><li> Calcolare l&#39;area di un RBC per determinare un numero rappresentativo stimato di globuli rossi all&#39;interno di ogni aggregato rilevato. Utilizzando questi risultati, calcolare la distribuzione della percentuale di globuli rossi all&#39;interno di ogni aggregato in funzione delle dimensioni di aggregazione (rappresentate dal numero stimato di cellule in ciascun aggregato), come mostrato in Figura 6. NOTA: Per misurare gli aggregati RBC, il software ImageJ potrebbe essere utilizzato (invece di MATLAB) per eseguire le stesse operazioni in ogni fotogramma. </li></ol></li></ol> 5. Fluido Velocità e Velocità di taglio Misure Determinare la velocità del fluido e quindi la velocità di taglio utilizzando un sistema μPIV. <ol><li> Una volta che i dati viene eseguita utilizzando la macchina fotografica ad alta velocità, passare alla fotocamera doppio pulsato utilizzato per il sistema μPIV. Utilizzare un software di imaging per un&#39;immagine acquisizione del flusso e l&#39;elaborazione delle immagini per la determinazione campo di velocità. </li><li> Prendere tutte le precauzioni necessarie, a seconda della classe del laser, prima di accendere il laser. Poi accendere il sistema, la fotocamera e il laser. </li><li> Calibrare la fotocamera in base alla ingrandimento dell&#39;obiettivo utilizzato. A questo scopo, utilizzare un microscala di 10 micron precisione al microscopio e impostare la dimensione di 1 pixel nell&#39;immagine. </li><li> Avviare il laser e visualizzare le particelle in entrambi i fluidi. Trova piano medio delle microchannel concentrandosi sulle particelle più veloci nel flusso (vale a dire, le particelle più veloci dovrebbero essere il più luminoso). </li><li> Impostare la dt (intervallo di tempo tra due fotogrammi consecutivi) per garantire il corretto spostamento della particella. Le particelle più veloci devono muoversi circa 5 a 10 pixel tra le due immagini. </li><li> Avviare la registrazione del flusso. Impostare il software per l&#39;acquisizione di 100 coppie di immagini, 5 msec a parte. Eseguire le operazioni 5.4, 5.5 e 5.6 per tutta la difdi- RBC-sospensioni e per diverse velocità di taglio. NOTA: Maggiori dettagli della metodologia sono riportati nello studio di Pitts e Fenech 20. </li><li> Elaborare le registrazioni acquisite utilizzando il metodo cross-correlazione con il software di imaging. NOTA: Questo consiste discretizzare la coppia di immagini in piccole finestre di dimensioni prefissate (basata sul flusso del fluido e l&#39;intervallo di tempo scelto dall&#39;utente) chiamato finestre di correlazione e seguendo lo spostamento delle particelle in ogni finestra. <ol><li> In primo luogo, verificare se le immagini acquisite richiedono pre-trattamento (compresa la sottrazione dello sfondo, &quot;base-clipping&quot; 21 o immagine sovrapposizione 22,23) per una migliore elaborazione dei dati. </li><li> Quindi scegliere la dimensione della finestra di correlazione e la forma, nonché della percentuale di immagini sovrapposte. Uno studio dettagliato è stato eseguito da Pitts et al. 24 per determinare i parametri ottimali e le tecniche un&#39;immagine pre-elaborazione per il sanguefluire in diverse configurazioni di canale. Esprimere i risultati come un campo di velocità media calcolata in base alle 100 coppie di immagini e l&#39;errore quadratico medio (RMS) di velocità. </li></ol></li><li> Estrarre un profilo di velocità all&#39;uscita del canale, dai dati elaborati come mostrato in figura 7. Per un migliore profilo, la media del campo di velocità nello spazio. NOTA: Le barre che compongono il profilo di velocità corrisponde alla dimensione della finestra di correlazione scelto rispetto alla larghezza del canale. L&#39;errore RMS di velocità è anche mostrato in figura 7, che rappresenta l&#39;errore nella stima della velocità sperimentale. </li><li> Spegnere il laser una volta vengono eseguite tutte le misure ed elaborazione ,. Chiudere tutte le componenti del sistema: software, macchine fotografiche, palcoscenico in movimento, computer e laser. </li><li> Per calcolare la velocità di taglio, prima di rilevare e stimare lo spessore sangue nei microcanali basate sulla registrazione telecamera ad alta velocità. A questo scopo, la media di tuttii fotogrammi nella registrazione specifica per ottenere una immagine di sfondo video. Delimitare il livello del sangue (come mostrato in figura 8 per i RBC sospensioni fluide a 10 microlitri / hr quando sospeso al 5%, 10% e 15% di ematocrito). Ottenere il valore di velocità per il corrispondente spessore dello strato di anima e calcolare la velocità di taglio dividendo il valore velocity lo spessore dello strato di anima. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando il presente metodo, è possibile analizzare qualitativamente e quantitativamente la RBC aggrega in diverse condizioni di flusso e ematocriti. Per le prove di successo e rilevamento aggregato, è cruciale per determinare il rapporto di trasmissione appropriato tra i due fluidi all&#39;ingresso microcanali. Questo rapporto è molto importante per ottenere uno spessore strato sangue ottimale in cui il profilo di velocità è quasi lineare 19. Un altro fattore chiave per i...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Globuli rossi (RBC) svolgono un ruolo cruciale nel determinare il comportamento reologico del sangue. Sono quasi singolarmente responsabili per le particolari proprietà di sangue in vitro e in vivo. In condizioni fisiologiche, RBC occupano il 40% al 45% del volume del sangue. In microcircolazione, globuli rossi solo occupano fino al 20% del volume di sangue a causa di diametri dei vasi più piccoli e il plasma effetto 1 scrematura. Questo fenomeno di riduzione plasma in microcircolazione è noto come effetto Fahraeus. A bassi tassi di taglio, eritrociti sono in grado di colmare e formare uno dimensionale o strutture tridimensionali denominate &quot;rouleaux&quot; o inerti, contribuendo così al comportamento non newtoniano di sangue. Tuttavia, il meccanismo di aggregazione RBC non è completamente noto. Due teorie esistono per modellare l&#39;aggregazione dei GR: il ponte della teoria cellule causa la reticolazione delle macromolecole 2 e la forza attracteoria zione causata dalla deplezione delle molecole a causa del gradiente osmotico 3. Tipicamente, per sangue umano, aggregati si formano a basse velocità di taglio 4 che vanno da 1 a 10 sec -1. Sopra questa gamma, globuli rossi tendono a disaggregare e il flusso separatamente all&#39;interno del vaso. La comprensione delle condizioni di formazione aggregati è di grande importanza per il campo hemorheology in termini di definizione comportamento reologico del sangue. Questi aggregati sono spesso visti a livello macrocircolo (&gt; 300 micron di diametro) 5. A questa scala, il sangue è considerato come un fluido Newtoniano e una miscela omogenea. Tuttavia, questi aggregati sono raramente nel livello capillare (4-10 micron di diametro) e sono solitamente un&#39;indicazione di condizioni patologiche come il diabete 6 e obesità. Altre condizioni patologiche che potrebbero cambiare l&#39;aggregazione RBC includono malattie infiammatorie o infettive,malattie cardiovascolari come l&#39;ipertensione o aterosclerosi, malattie genetiche e le malattie croniche 7. Pertanto, la comprensione del meccanismo di aggregazione RBC e analizzare queste entità (definendo una relazione tra la dimensione di tali aggregati e le condizioni di flusso) potrebbe portare alla comprensione del comportamento microrheological di sangue e quindi in relazione con applicazioni cliniche. Aggregati RBC possono essere alterate da diversi fattori come il ematocrito (volume di globuli rossi nel sangue), la velocità di taglio, il diametro del vaso, la membrana rigidità RBC e la sospensione tessitura media 8-10. Pertanto, condizioni controllate sono necessari per analizzare efficacemente gli aggregati RBC. Diversi metodi sono in grado di analizzare la formazione di aggregati fornendo misurazioni aggregazione statiche (indice di aggregazione) che offre informazioni utili sul comportamento del sangue. Questi metodi includono, tra l&#39;altro, il tasso di sedimentazione degli eritrocitiMetodo 11, il metodo di trasmissione della luce 12, il metodo di riflessione della luce 13 e il metodo a bassa viscosità di taglio 14. Pochi studi hanno cercato di studiare l&#39;aggregazione RBC e determinare il grado di aggregazione in condizioni di flusso controllato 15-17. Tuttavia, questi studi indirettamente indagare RBC formati aggregati determinando il rapporto dello spazio occupato in un sistema di taglio misurata basato su immagini microscopiche sanguigni che forniscono informazioni sul grado di aggregazione e la viscosità locale. Abbiamo quindi presentiamo una nuova procedura per quantificare direttamente RBC aggrega in microcircolo, in modo dinamico, con tassi di taglio controllate e costanti. RBC-sospensioni sono trascinati, in un doppio Y-microchannel (come illustrato in figura 1), con una soluzione di tampone fosfato (PBS) creando così un flusso di taglio nello strato di anima. All&#39;interno di questo sangue strato un costante karitétasso r può essere ottenuto. Gli RBC-sospensioni sono testati a diverso ematocrito (H) livelli (5%, 10% e 15%) e in differenti velocità di taglio (2-11 sec -1). La velocità sanguigna e la frequenza di taglio sono determinati utilizzando un sistema di micro Particle Image Velocimetry (μPIV) mentre il flusso viene visualizzato per mezzo di una telecamera ad alta velocità. I risultati ottenuti vengono poi elaborati con un codice MATLAB sulla base delle intensità di immagine al fine di rilevare i globuli rossi e determinare le dimensioni aggregate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Il sangue, come BIOFLUID non newtoniano, rappresenta il fulcro di numerosi studi nel campo hemorheology. Componenti del sangue sono i globuli rossi, globuli bianchi e piastrine sospese in plasma sanguigno. Per l&#39;abbondanza dei globuli rossi (40% al 45% del volume del sangue), il loro comportamento determina il comportamento reologico del sangue soprattutto nel microcircolo. Alla velocità di taglio molto basse, globuli rossi sono visti da montare e entità forma chiamata aggregati, che provoca il comportamento non newtoniano di sangue. È importante comprendere le condizioni di formazione aggregati di comprendere la reologia del sangue nel microcircolo. Il protocollo qui descritto in dettaglio la procedura sperimentale per determinare quantitativamente gli aggregati RBC in microcircolo sotto gradiente di velocità costante, sulla base di elaborazione delle immagini. A questo scopo, RBC-sospensioni sono testati e analizzati in 120 x 60 micron poly-dimetil-silossano (PDMS) microcanali. RBC-sospensioni sono entpiovuto utilizzando un secondo fluido al fine di ottenere un profilo di velocità lineare all&#39;interno del livello del sangue e realizzare una vasta gamma di shear rate costante così. Il gradiente di velocità viene determinato utilizzando un sistema di micro Particle Image Velocimetry (μPIV), mentre gli aggregati RBC sono visualizzate con una fotocamera ad alta velocità. I video catturati degli aggregati RBC vengono analizzati utilizzando tecniche di elaborazione dell&#39;immagine per determinare le dimensioni aggregati basati sulle immagini intensità.

Un esempio di flusso a due fluidi nel doppio Y-microcanali è mostrato in Figura 2 per globuli rossi umani in sospensione al 5%, 10% e 15% di ematocrito e scorre a 10 microlitri / hr. La figura 3 mostra la differenza di dimensioni aggregazione quando il flusso nel canale si riduce da 10 microlitri / hr a 5 microlitri / hr per un ematocrito del 10%. Questo dà una nozione qualitativa delle dimensioni degli aggregati al variare l&#39;ematocrito e velocità di taglio. Figura 5</str...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Il protocollo descritto dettagli una procedura sperimentale per quantificare globuli rossi (RBC) aggregati con un gradiente di velocità controllata e costante, basato su tecniche di elaborazione delle immagini. L&#39;obiettivo di questo protocollo è di mettere in relazione le dimensioni aggregate RBC al corrispondente gradiente di velocità in un ambiente controllato microfluidica.

Ambiente controllato Microfluidic per Dynamic Indagine Globulo rosso Aggregazione

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Views.  University of Ottawa.  Il protocollo descritto dettagli una procedura sperimentale per quantificare globuli rossi (RBC) aggregati con un gradiente di velocità controllata e costante, basato su tecniche di elaborazione delle immagini. L'obiettivo di questo protocollo è di mettere in relazione le dimensioni aggregate RBC al corrispondente gradiente di velocità in un ambiente controllato microfluidica. 

Video: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine ​​Ultrasensitive da sangue intero

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...