Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (AI079442 e AI091918) assegnati a SEFD

1. Preparazione di Selective Agar media (BHI / L + G) per inibire microbiota intestinale <ol><li> Pesare 26 g di Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g di LiCl e 5,0 g di glicina e posto in un pallone da 1 litro. Aggiungere 500 ml di acqua deionizzata. </li><li> Calore su un agitatore magnetico fino a quando le bolle di agar, mescolando continuamente. Prendete il pallone fuori dal fuoco, lasciare che le bolle si depositano brevemente, e poi riportare a bollore. </li><li> . Autoclave per 30 minuti a 121 ° C sotto 16-19 psi su un ciclo di liquido Nota: lasciare l&#39;ancoretta nel pallone. </li><li> Equilibrare i media a 55 ° C in un bagno d&#39;acqua o lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Non lasciare che la soluzione per ottenere più fredda di 55 ° C o cristalli formeranno nel agar. I cristalli non inibiscono L. crescita monocytogenes o influenzare le proprietà selettive dei media. Tuttavia, i cristalli saranno simili in apparenza a piccole colonie e renderà difficile la conta batterica CFU. </li><li> Mescolare delicatamente ilagar per 1 min con un agitatore magnetico. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Versare l&#39;agar in piastre di Petri (~ 25 ml / piastra). Nota: Questo supporto non supporta la crescita di tutti L. monocytogenes. Per esempio, L. monocytogenes EGDE cresce bene su questo terreno, con colonie visibili entro 36-48 ore, ma 10403s non cresce su questo supporto. </li></ol> 2. Preparazione dell&#39;inoculo <ol><li> Tagliare il pane bianco a fette (Kroger) in piccolo (2-3 mm) cubi utilizzando sterile forbici Ora bisturi sterile. Non utilizzare le croste. Memorizzare singoli pezzi in provette da microcentrifuga a -20 ° C fino al giorno dell&#39;infezione. </li><li> Usando un bisturi sterile, tagliare piccole (0,5-1 cm), pezzetti di burro salato (Kroger) e mettere ciascuno in una provetta sterile. Ogni tubo conterrà abbastanza burro per preparare 50-60 pezzi di pane. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Grow L. monocytogenes in brodo BHI agitazione a 30 &amp;deg; C finché la coltura raggiunga un OD 600 di ~ 0.8-1.0. Preparare 500 microlitri aliquote in provette da microcentrifuga, avendo cura di vortice del campione spesso così tutti i tubi contengono lo stesso numero di batteri. Conservare a -80 ° C. </li><li> A titolo le aliquote batteriche, scongelare una provetta in ghiaccio, quindi aggiungere 500 microlitri di 9.5 ml di brodo BHI. Incubare per 1.5 ore in piedi a 30 ° C. Diluizioni seriali piastra su BHI agar. Aspettatevi un titolo di ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml. Nota: Se aliquote omogenee sono preparati, possono aspettarsi ciascuno dei tubi di cedere questo titolo quando preparato in modo simile, con una variazione di 2-4 volte. </li><li> Per infettare i topi, preparare una aliquota di L. monocytogenes come descritto al punto 2.4. Circa 20 minuti prima che la L. cultura monocytogenes è pronto, scongelare i pezzi di pane a temperatura ambiente. Fondere una aliquota di burro a 55 ° C e pre-riscaldare un piccolo volume di PBS a 55 ° C. Preparare pezzi abbastanza pane modo che vi sia almeno una per topodi essere infetti e almeno un pezzo extra per la determinazione del titolo dell&#39;inoculo effettivo. </li><li> Sulla base del titolo predeterminata della aliquota batterica, calcolare il volume totale di L. cultura monocytogenes necessari per preparare il inoculi per il numero di pezzi di pane. I pellet batterico centrifugando a 14000 g per 10 minuti Aspirare tutto il brodo BHI e risospendere i batteri in un piccolo volume di pre-riscaldato PBS (2 ml / pane pezzo). </li><li> Vortex il burro fuso, aggiungere ai batteri (con un volume totale pari a 3 ml / pane pezzo) e mescolare accuratamente. Nota: Non tentare di preparare più di 10-15 pezzi di pane in un momento o il burro si solidifichi. </li><li> Lavorando velocemente, pipetta 5 ml della sospensione batterica in un unico pezzo di pane in una provetta da microcentrifuga. La soluzione deve essere completamente assorbito dal pezzo di pane. </li><li> Per determinare il titolo effettivo dell&#39;inoculo, aggiungere 1 ml di PBS sterile a una delle piec panees. Vortex vigorosamente per 1 min. Preparare diluizioni seriali e piastra sia BHI e BHI / L + G agar. </li><li> Procedura alternativa per l&#39;alto titolo (&gt; 10 9 CFU) inoculi. Se il pellet batterico è troppo grande, può essere difficile per sospendere in un piccolo volume tale, e il materiale risultante è molto viscoso, come una pasta, e alcune delle inoculo può aderire alle pareti della provetta. In questo caso, è meglio inoculare il pane in un piatto di coltura 60 millimetri sterile, e per offrire l&#39;intera piastra (senza il coperchio) al mouse (vedere sotto). Qualsiasi inoculo eccesso che non viene assorbito dal pane può poi essere mangiato direttamente dal mouse. In generale, ci vuole più tempo per i topi da mangiare tutto il pane e leccare il piatto pulito rispetto al protocollo standard descritto di seguito, quindi questo è solo il metodo preferito quando si tratta di altissima inoculi titolo. </li></ol> 3. L&#39;infezione di topi <ol><li> Acquisto femmina BALB / c / da / J (stock # 0.010.026) e C57BL/6/J (magazzino# 000644) da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e utilizzare a 6-9 settimane di età. </li><li> Velocemente i topi un giorno (24 ore) prima dell&#39;infezione rimuovendo il cibo e mettendo i topi su (1 pollice) pavimentazione filo sollevata (# 3 mesh; Allentown) per prevenire coprofagia. Lasciare solo biancheria da letto abbastanza nella gabbia di assorbire l&#39;urina, ma non abbastanza per elevare feci capannone. Consentire l&#39;accesso illimitato all&#39;acqua. </li><li> Infettare i topi al momento della comparsa del ciclo di buio, lavorando in una cappa a flusso laminare equipaggiato con una lampadina rossa. Trasferire un singolo mouse per un (non letto) gabbia vuota. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il pezzo pane contaminato al fondo della gabbia vuota. In genere, il mouse prendere il pezzo di pane e consumarlo interamente all&#39;interno di 2-10 min. Se il topo non mangia il pane subito, restituire la gabbia a rack e lasciare il mouse indisturbato per 20-30 min. La maggior parte degli animali si mangia il pane in questo lasso di tempo, tuttavia, i topi possono essere lasciati indisturbati, senza accesso a otil suo cibo o acqua per un massimo di 2 ore. </li><li> Dopo l&#39;infezione, restituire il mouse per la sua gabbia originale e ricostituire il mouse chow. Continuare ad ospitare i topi a filo pavimento sopraelevato per la durata dell&#39;esperimento. </li></ol> 4. Monitorare il livello di batteri Capannone nelle feci <ol><li> Tubi etichette e pre-pesare microcentrifuga da utilizzare per la raccolta di feci. </li><li> Lavorare rapidamente dopo il recupero di una gabbia di topi, posizionare ogni mouse in un bicchiere da 500 ml di plastica. In genere i topi espellere 1-4 palline di feci entro 5 min. </li><li> Utilizzare una pinza sterile per trasferire le feci di provette. </li><li> Pesare ogni tubo e calcolare il peso delle feci sottraendo il peso del tubo vuoto. Pesi tipici per pellet fecali vanno da 10-30 mg. </li><li> Aggiungi PBS in ogni provetta (200 μl/30 feci mg) e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per schiacciare le palline fecali. </li><li> Vortex ogni provetta per 30 secondi, quindi preparare diluizioni seriali e piastra su BHI / L+ G agar. Contare il numero di colonie e calcolare CFU / mg di feci. </li></ol> 5. Lavorazione dei tessuti intestinali infetti <ol><li> Euthanize i topi, in modo asettico raccogliere lo stomaco e l&#39;intestino da ogni mouse come un unico tessuto e raccogliere in vuote 100 millimetri Petri. </li><li> Separare il piccolo intestino, cieco e del colon e del luogo in separati 60 millimetri piatti memorizzati sul ghiaccio. Il piccolo intestino possono essere ulteriormente divise per lunghezza in tre parti uguali approssimano il duodeno, digiuno e ileo per facilitare la rimozione del contenuto luminale. I terzi di tessuti possono poi essere elaborati sia insieme (per CFU per intero intestino tenue) o separatamente. Tessuti bagnati con ~ 0,5 ml di PBS sterile per mantenere flessibili e prevenire rotture durante la movimentazione. </li><li> Riempire una siringa da 10 ml con 8 ml di PBS sterile e inserire un ago da 25 g. Utilizzare pinze sterili per spremere il contenuto luminale in un bicchiere da rifiuti (o di una sterile tubo da 50 ml, se la raccolta dei batteri luminali). Influenzeh 4 ml di PBS attraverso una delle estremità del tessuto, utilizzare la pinza di spremere il contenuto, e poi capovolgere il tessuto sopra e ripetere dall&#39;altra parte. </li><li> Per quantificare il numero di Listeria nei contenuti luminale, centrifugare le vampate in pool per 20 minuti a 12.000 xg, sospendere il pellet in 0,5-1,0 ml di acqua sterile. </li><li> Per quantificare il numero complessivo di importo associato alle cellule Listeria, aprire ogni tessuto lavato tagliando longitudinalmente con lama di bisturi sterile, e poi fare diversi tagli laterali per affettare il tessuto in frammenti più piccoli. Nota: questo passaggio è essenziale per garantire che il tessuto intestinale non avvolgere la lama omogeneizzatore. Trasferire i pezzi intestinali per un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di acqua sterile. </li><li> Sterilizzare un omogeneizzatore tessuto (Fisher PowerGen 1000) posizionando la sonda in 70% di etanolo al 60% di potenza per 30 sec. Attendere etanolo asciugare all&#39;aria o processo in acqua sterile per 10 sec. Omogeneizzare ogni TISSUE per 1 min. Ripetere il trattamento con acqua sterile tra ciascun campione, e utilizzare il 70% di etanolo tra gruppi campione. </li><li> Preparare diluizioni seriali di ogni campione in acqua sterile e piatto su BHI / L + G agar. </li></ol> 6. Elaborazione di infetti linfonodi mesenterici <ol><li> Harvest linfonodi asetticamente, posto in una sterile 60 millimetri piatto sul ghiaccio e utilizzare pinza sterile per rimuovere tutto il grasso attaccato. Aspettatevi di trovare 3-6 nodi per mouse. </li><li> Preparare schermi di rete metallica, tagliando 1,5-2 pezzi pollice quadrato di acciaio inossidabile # 80 mesh. Fare un piccolo taglio in ogni angolo, e ripiegare i quattro lati, creando un letto rialzato. Immergere in etanolo al 95% e poi fiamma per sterilizzare, e posto in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 0,75 ml di acqua sterile. Dopo ogni uso, le schermate possono essere riciclati da una immersione in etanolo al 70% per 20 minuti, strofinare con una spazzola per rimuovere i tessuti incorporati, bollire per 20-30 minuti in NaOH 2N, e poi risciacquo con abbondante acqua. </li><li> Utilizzare lo stantuffoda una sterile siringa da 3 ml per schiacciare i nodi attraverso lo schermo di maglia. Assicurarsi di spingere verso il basso sullo schermo per il fondo del piatto in modo che rende contatto con l&#39;acqua nel piatto. </li><li> Passare 0,75 ml di acqua sterile attraverso lo schermo e poi pipetta su e giù diverse volte per sciacquare lo schermo. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta. </li><li> Vortex ogni campione vigorosamente per 30 sec per lisare le cellule. Preparare diluizioni seriali e piastra su entrambi BHI / L + G agar. </li></ol> 7. Elaborazione di Milze infetti, fegato, cistifellea e <ol><li> Afferrare milza con pinza sterile e liberare praticando due tagli, uno ad ogni estremità. In un tubo da 15 ml contenente 2,5 ml di acqua sterile. (Nota: i tubi con fondo tondo può essere più facile da usare con l&#39;omogeneizzatore.) </li><li> Individuare la cistifellea (un piccolo giallo sacco pieno di liquido attaccato al fegato) e tagliare accuratamente con le forbici sterili a staccarsi dal fegato senza scoppiare. Trasfer in una provetta contenente 1 ml di acqua sterile. </li><li> Asetticamente rimuovere il fegato, avendo cura di rimuovere tutti i lobi, e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 2,5 ml di acqua sterile. </li><li> Omogeneizzare milze e fegati come descritto sopra per 30 secondi sul potere 60%. Vesciche Forgall, usano forbici sterili per lacerare in provetta, e poi mescolare vigorosamente nel vortex per 30 sec. </li><li> Preparare diluizioni seriali e piastra ogni campione su entrambi BHI o BHI / L + G agar. </li></ol> 8. Lavorazione dei cervelli infetti <ol><li> Operando dal lato posteriore del mouse, tagliare la pelle e il tessuto sopra il collo, e attraverso entrambe le orecchie con un angolo di 45 °. Utilizzare una pinza sterile per staccare il lembo a forma di U di pelle tirando verso il naso ed esporre il cranio e delle ossa facciali. </li><li> Immobilizzare il cranio tenendo la cresta ossea tra gli occhi con una pinza, e usare le forbici per fare tagli poco profondi attraverso i bordi laterali del cranio. Essereattenzione a tagliare solo l&#39;osso e non il tessuto cerebrale. Quindi, tagliare la cresta ossea tra gli occhi. Utilizzare una pinza per tenere la parte superiore del cranio e tirare all&#39;indietro (verso il collo) per esporre il cervello. </li><li> Sollevare delicatamente il cervello dalla sua cavità utilizzando una pinza sterile e posto in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 1,5 ml di acqua sterile. </li><li> Omogeneizzare per 20 sec a potenza il 60% come sopra descritto. Preparare diluizioni seriali e piastra su entrambi BHI o BHI / L + G agar. </li></ol> 9. Procedura supplementare: Frazionamento di tessuti intestinali 9.1 Isolamento di batteri nella Frazione Muco <ol><li> Per ogni tessuto intestinale, preparare 3 provette contenenti 3 ml di 6 mm N-acetilcisteina (NAC; Sigma # A-9165). </li><li> Posizionare il arrossato e longitudinalmente tagliare i tessuti nel primo tubo per 1-2 minuti, rimestando vigorosamente ogni 20-30 sec. Utilizzando pinze sterili, prelevare il tessuto e premere delicatamente contro la parete della provetta per rimuovere l&#39;eccesso di sapone liquidid. </li><li> Ripetere il punto 9.1.2 altre due volte utilizzando i restanti tubi di NAC. Rimuovere il tessuto intestinale e mettere da parte per ulteriori elaborazioni. </li><li> Piscina la NAC lava (complessivamente 9 ml), e centrifugare per 20 minuti a 12.000 x g. </li><li> Risospendere il pellet in acqua sterile, vortex per 30 sec, preparare diluizioni seriali e piastra su BHI / L + G. </li></ol> 9.2 Isolamento di batteri nella cellula epiteliale (CE) Frazione <ol><li> Tagliare ogni tessuto in piccoli pezzi con le forbici sterili e posto in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di RPMI (Invitrogen # 21870) supplementato con 5% di FBS (RP-5), 5 mM EDTA, e 1 mM DTT. Incubare agitazione a 37 ° C per 20 min. </li><li> Trasferire i pezzi intestinali in una nuova provetta contenente 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubare agitazione a 37 ° C per 20 min. Salvare il supporto dal primo tubo e mettere da parte a 37 ° C. Ripetere questo processo una volta di più, per un totale di tre 20 min incubazioni in RP5/EDTA/DTT. In caso di procedere alla lamina propria isopasso lamento, trasferire i pezzi rimanenti intestinali in vuoto tubo da 50 ml. </li><li> Unire i tre lavaggi RP5/EDTA/DTT (volume totale di 15 ml) e centrifugare a bassa velocità (1.200 xg) per agglomerare le cellule. </li><li> Per quantificare i batteri extracellulari, raccogliere il surnatante e centrifugare per 20 minuti a 12000 x g. Risospendere il pellet in 0,5-1,0 ml di acqua sterile e diluizioni seriali piastra su BHI / L + G agar. </li><li> Per enumerare i batteri intracellulari, risospendere il pellet CE in 5 ml di RP-5 contenente 25 mg / ml di gentamicina. Incubare la sospensione singola cella per 30 min a 37 ° C più il 7% di CO 2 per uccidere qualsiasi residuo extracellulare L. monocytogenes. Lavare le cellule due volte in PBS, sospensione in 0,5 ml di acqua sterile, e vortex per 30 sec per la lisi delle cellule. Preparare diluizioni seriali in acqua e piastra su BHI / L + G. Nota: le cellule raccolte in questa fase saranno inoltre contenere cellule di placche di Peyer sottostante. Se lo si desidera, il Peyer visibile èCerotti possono essere rimossi dai tessuti intestinali prima del lavaggio e taglio longitudinale. </li></ol> 9.3 Isolamento di batteri nella lamina propria (LP) Frazione <ol><li> Risciacquare l&#39;eccesso DTT / EDTA dai pezzi intestinali aggiungendo 25 ml di PBS sterile al tubo. Agitare energicamente, trasferire in una nuova provetta e ripetere due volte. </li><li> Trasferire i pezzi intestinali in una provetta da 50 ml contenente 4 ml di soluzione di digestione costituito RP-5 supplementato con 1 mg / ml di collagenasi di tipo IV e 40 mcg / ml DNasi I. Incubare agitazione a 37 ° C per 40 min. </li><li> Trasferire i pezzi non digerito in una nuova provetta contenente 4 ml di soluzione di digestione e ripetere una o due volte finché i pezzi di tessuto sono completamente digeriti. Salvare ciascuna delle soluzioni di digestione, che contengono cellule LP liberate, a 37 ° C. </li><li> Centrifugare le soluzioni di digestione di un pool a bassa velocità (1.200 xg) per agglomerare le cellule. Elaborare il surnatante e il pellet cellulare separatamente come described sopra per enumerare i batteri extracellulari e intracellulari, rispettivamente. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Tutti gli esperimenti descritti qui sono stati eseguiti in conformità con l&#39;Ufficio per Laboratorio Animal Welfare (OLAW) con l&#39;approvazione del ICAUC presso l&#39;Università del Kentucky.

Topi inbred non sono uniformemente ricettivi a nutrire in ogni momento della giornata, e la loro volontà di mangiare il pane contaminato dipenderà sia dal tipo di ceppo e l&#39;età dei topi 17. Nella nostra esperienza, 6-9 settimane di età B6 topi sono ricettivi per l&#39;alimentazione in ogni momento della giornata, ma i topi BALB non sempre mangiare il pezzo di pane a meno che non viene offerto durante il loro ciclo di buio. Il ciclo di luce della stanza utilizzata per ospitare gli animali può essere a...

Listeria monocytogenes sono facoltativi batteri patogeni intracellulari che causano le infezioni di origine alimentare nell&#39;uomo. I batteri sono resistenti a molti dei processi utilizzati per proteggere il nostro approvvigionamento alimentare, quali l&#39;essiccazione, la salatura, o 1,2 refrigerazione e le infezioni sono in genere legati a trattati, &quot;ready-to-eat&quot; cibi non riscaldati prima del consumo . In diverse epidemie precedenti, la fonte di L. cibo monocytogenes-contaminato è stato identificato, e il gruppo ristretto di individui esposti è stata monitorata attentamente 3-6. In questi esempi, la malattia clinica in individui altrimenti sani varia da un lieve, autolimitante gastroenterite per infezioni intestinali e sistemiche più gravi che ha richiesto ospedalizzazione. L. infezioni monocytogenes in individui immunocompromessi, inclusi sia i neonati e gli anziani, sono stati associati con un alto tasso di mortalità (25-30%), anche con il trattamento antibiotico <sup&gt; 7,8. Poco si sa circa la dose infettiva di L. monocytogenes, oi fattori dell&#39;ospite che governano suscettibilità alle infezioni dopo trasmissione orale, soprattutto a causa della mancanza di un piccolo modello animale che ricapitola questa ampia gamma di risultati infezione. Il modello più diffuso di listeriosi è per via endovenosa (IV) inoculazione di topi. Il modello IV è altamente riproducibile, ed è stato estremamente utile per studiare le risposte delle cellule sia naïve e memory T durante l&#39;infezione 9,10. L&#39;inconveniente del modello iv è che bypassa completamente la fase di infezione intestinale. Dopo la trasmissione di origine alimentare, la mucosa intestinale fornisce una barriera che rallenta presumibilmente e limita il numero di batteri che possono continuamente diffondere ai tessuti periferici. In contrasto, l&#39;intero inoculo può essere trovata nella milza e nel fegato in pochi minuti di somministrazione endovenosa, e questo grande bolo di microrganismi può sopraffare immunitaria innata defenses in questi tessuti. Infezione orale di topi con sonda gastrica è meno comunemente usato, perché grandi dosi (10 9 -10 11 CFU) sono in genere tenuti a raggiungere la colonizzazione intestinale 10. Inoltre, intragastrica (ig) inoculazione con un ago di alimentazione non genera un periodo riproducibile di infezione gastrointestinale prima diffusione sistemica. Alcuni laboratori hanno segnalato che L. monocytogenes raggiungono la milza e il fegato entro 4-12 ore dopo l&#39;infezione (HPI), mentre altri non hanno mostrato alcuna diffusione sistemica fino a 48 HPI 11-15. Questa variazione da laboratorio a laboratorio può essere una conseguenza della natura invasiva ig inoculazione, che può provocare traumi minori alla mucosa dell&#39;esofago, e promuovere la circolazione sanguigna invasione diretta dei batteri. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo modello murino di orale L. infezione monocytogenes che imita da vicino tutte le fasi della malattia umana 16. L&#39;infezione si verifica quando i topi ingerire pezzi di contamminato cibo, un processo che è non-traumatica, e non richiede competenze specialistiche da investigatori laboratorio. Per un periodo discreto di tempo (36-48 ore), L. monocytogenes riproducibile colonizzano solo il tratto gastrointestinale, permettendo così studiare i meccanismi utilizzati dai patogeni Listeria di traslocare attraverso la mucosa intestinale e diffondere ai tessuti periferici. Importante, il modello può essere utilizzato per studiare differenze ospitante innata resistenza alle infezioni. In un precedente studio, abbiamo dimostrato che BALB / c / da / J topi sono stati molto sensibili al cibo listeriosi Borne, con la replica esponenziale di L. monocytogenes che si verificano nello stomaco, milza, fegato e cistifellea 16. In contrasto, C57BL / 6 topi erano resistenti alle infezioni di origine alimentare, con solo colonizzazione transitoria di L. monocytogenes verificano in ciascuno di questi tessuti. Una caratteristica supplementare del modello di origine alimentare che imita da vicino la malattia umana è che la diffusione naturaleal cervello verificato durante le ultime fasi di infezione (5-7 dpi).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes sono facoltativi batteri patogeni intracellulari che causano le infezioni di origine alimentare nell&#39;uomo. Molto poco si sa circa la fase gastrointestinale di listeriosi a causa della mancanza di un piccolo modello animale che mima da vicino la malattia umana. Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la trasmissione orale di L. monocytogenes. Utilizzando questo modello, i topi nutriti L. monocytogenes-contaminato pane hanno una discreta fase di infezione gastrointestinale, seguito da vari gradi di diffusione sistemica sensibili (BALB / c / da / J) o resistenti (C57BL / 6) ceppi di topi. Durante le ultime fasi di infezione, si osserva la diffusione della cistifellea e del cervello. Il modello di origine alimentare listeriosi è altamente riproducibile, non richiede competenze specialistiche, e può essere utilizzato con un&#39;ampia varietà di isolati batterici e ceppi di topi di laboratorio. Come tale, è il modello ideale per studiare entrambe le strategie utilizzate virulenza di L. monocytogenes </em&gt; promuovere colonizzazione intestinale, così come la risposta dell&#39;ospite invasiva alimenti sopportato infezione batterica.

L. monocytogenes le colonie saranno visibili su piastre di BHI / L + G, dopo 36-48 ore di incubazione a 37 ° C. Le colonie hanno una, a forma di cupola aspetto bianco cremoso liscia (Figura 1A). Crescita sarà inibito per la maggioranza della flora batterica intestinale, ma è comune vedere alcune colonie che non sono L. monocytogenes, in particolare quando placcatura tenue o del colon senza diluizione significativa (Figura 1B). Colonie sospette possono essere conferm...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Questo documento descrive un nuovo metodo per l&#39;infezione orale di topi usando<em&gt; Listeria monocytogenes</emAlimentare&gt;-contaminato. Il protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;uso con altri alimenti patogeni batterici origine.

Trasmissione orale di<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Nei topi tramite ingestione di alimenti contaminati

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K Views.  University of Kentucky. Questo documento descrive un nuovo metodo per l'infezione orale di topi usando Listeria monocytogenes-contaminato. Il protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con altri alimenti patogeni batterici origine.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Purificazione da nella cellula Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofagi

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. Meningococcus is a transient colonizer of human nasopharynx of approximately 10% of healthy subject. In particular circumstances, it acquires an invasive ability to penetrate the mucosal barrier and invades the bloodstream causing septicaemia. In the latest case, fulminating sepsis could arise even without the consequent development of meningitis. Conversely, bacteria could poorly multiply in the bloodstream, cross the blood brain barrier, reach the central nervous system, leading to fulminant meningitis. The murine models of bacterial meningitis represent a useful tool to investigate the host-pathogen interactions and to analyze the pathogenetic mechanisms responsible for this lethal disease. Although, several experimental model systems have been evaluated over the last decades, none of these were able to reproduce the characteristic pathological events of meningococcal disease. In this experimental protocol, we describe a detailed procedure for the induction of meningococcal meningitis in a mouse model based on the intracisternal inoculation of bacteria. The peculiar signs of human meningitis were recorded in the murine host through the assessment of clinical parameters (e.g., temperature, body weight), evaluation of survival rate, microbiological analysis and histological examination of brain injury. When using intracisternal (i.cist.) inoculum, meningococci complete delivery directly into cisterna magna, leading to a very efficient meningococcal replication in the brain tissue. A 1,000-fold increase of viable count of bacteria is observed in about 18 h. Moreover, meningococci are also found in the spleen, and liver of infected mice, suggesting that the liver may represent a target organ for meningococcal replication.

Here, we describe a method to induce meningococcal meningitis through an intracisternal route of infection in adult mice. We present a step by step protocol of meningococcal infection from the preparation of inoculum to the intracisternal infection; then record the animal survival and evaluate the bacterial loads in murine tissues.