Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della patogenesi batterica se i batteri ematici possono attraversare la barriera emato-encefalica per infettare il sistema nervoso centrale e il cervello. Con questa tecnica, i numeri batterici all'interno del sangue e del tessuto cerebrale degli animali infetti possono essere determinati escludendo il numero di batteri residenti all'interno dei vasi sanguigni del cervello. A dimostrare la procedura sarà Pallab Ghosh, un ricercatore del mio laboratorio.
A 72 ore dopo l'infezione, impostare un sistema di perfusione automatizzato su una portata di quattro millilitri di PBS integrata con 10 millimolare di EDTA al minuto. E mettere l'animale eutanasiato in posizione supina in una padella di dissezione. Conferma l'eutanasia per mancanza di risposta al paw pinch.
E bagnare l'addome con il 75% di etanolo. Usa le forbici per fare un'incisione della parete addominale appena sotto la gabbia toracica per esporre il diaframma e gli organi viscerali. E tagliare il diaframma per aprire la cavità toracica.
Tagliare la gabbia di strofinare bilateralmente per esporre il ventricolo sinistro e utilizzare le forcep per afferrare delicatamente il cuore. Inserire un ago a farfalla calibro 21 collegato al sistema di perfusione nel ventricolo sinistro e tagliare accuratamente l'atrio destro per raccogliere circa 200 microlitri di sangue in un tubo da due millilitri contenente EDTA da 10 millimolare per prevenire la coagulazione. Quindi perfondere l'animale per quattro minuti con da 15 a 20 millilitri di PBS più EDTA.
Dopo una completa perfusione, il cervello e il fegato appariranno sbiancati assicurando che i batteri rimanenti provengono dagli organi raccolti e non dal sangue circolante. Dopo la perfusione, trasferire accuratamente gli organi di interesse in singoli tubi conici sterili da 15 millilitri contenenti cinque millilitri di pbs sterile a quattro gradi Celsius per tubo. Per raccogliere il cervello dopo la decapitazione, utilizzare le forbici per tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana tra gli occhi, tenendo le punte premute contro il cranio per tagliare qualsiasi tessuto in eccesso se necessario.
Inserire delicatamente una punta delle forbici nel magnum del forame e tagliarla lateralmente nel cranio su entrambi i lati. Tagliare con cura il cranio tra gli occhi lungo la linea mediana nel cranio, facendo attenzione ad applicare la pressione laterale ed evitare perturbazioni del cervello. Usando le forcep, apri il cranio per esporre il cervello e posizionare una spatola tra la parte inferiore del cervello e la base del cranio per trasferire attentamente il cervello in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di quattro gradi Celsius PBS.
In un armadio per la biosicurezza, inserire la punta ed eseguire un omogeneizzatore tissutale per 10 secondi in 5% di candeggina sequenziale, acqua sterile, 75% etanolo e soluzioni di acqua sterile in tubi conici separati da 15 millilitri. Quando la punta è stata completamente sterilizzata, omogeneizzare il cervello infetto nel suo tubo. Quando non rimangono frammenti di tessuto visibili, rister sterilizzare la punta per impedire il riporto batterico al campione di organo successivo e omogeneizzare l'organo successivo.
Quando tutti gli organi sono stati omogeneizzati, preparare diluizioni seriali 10 volte di ogni organo omogeneato in PBS sterile e placcare le diluizioni sulle piastre di agar per infusione cervello-cuore. Quindi incubare le colture di diluizione omogenea a 37 gradi Celsius durante la notte e contare il numero di colonie su ogni piastra per determinare il numero totale di batteri per organo o millilitro di sangue. Il calcolo dei fardelli batterici negli organi del topo infetti da L.monocytogenes, come appena dimostrato, suggerisce che la post-infezione da perfusione non altera significativamente il carico batterico nel sangue o negli organi dei topi infetti esaminati in questo studio rappresentativo.
Seguendo questa procedura, gli organi infetti da Listeria monocytogenes possono essere ulteriormente elaborati per ulteriori analisi come l'elaborazione istopatologica per rispondere a ulteriori domande sull'infiltrazione di cellule infiammatorie negli organi del topo infetti rispetto agli animali di controllo non infetti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare la perturbazione del cervello e di mantenere un contatto minimo tra le forbici e il tessuto cerebrale.
