Finanziamento è stato fornito dalla University of Utah. Vorremmo ringraziare il Dott. J. Xu (UC Merced) e il Dr. Reddy BJN (UC Irvine) per le discussioni utili.

1. Installazione di 980 nm Lunghezza d&#39;onda singola trappola ottica <ol><li> Intrappolamento ottico a 980 nm di lunghezza d&#39;onda è spesso ottimale sono facilmente disponibili con potenza di uscita alto come 300 mW esperimenti di biofisica e diodi laser poco costoso. È preferibile per un laser a diodi ad essere Pigtailed con polarizzazione-preserving fibra monomodale con un diametro del campo modalità noto. La fibra deve essere sufficientemente lungo per agire come filtro modalità e tipicamente è terminato sia con FC / PC o connettore FC / APC. Di questi, FC / APC è preferibile per minimizzare riflessione posteriore di instabilità di feedback chiari e potenziali. </li><li> Fissare il 980 nm diodo laser in un supporto che permette di potere e di controllo della temperatura. E &#39;meglio per risolvere il mount di un tavolo ottico direttamente a massimizzare passiva affondamento di calore e quindi ridurre al minimo il pericolo di fallimento diodo a causa di un malfunzionamento del regolatore di temperatura. </li><li> Montare il connettore in fibra PC / APC per le ottiche collimanti fascio. Èfondamentale per assicurare che il fascio collimato è minimo di divergenza così porte in fibra regolabili sono più utili. Assicurarsi che la porta a fibre ottiche scelto corrisponde al diametro del campo modalità della fibra codino diodo. Se il fascio deve essere rastered utilizzando deflettori acusto-ottica (AOD) o deflettori elettro-ottici (EOD) allora la vita di fascio laser collimato deve essere leggermente inferiore alla dimensione dell&#39;apertura deflettore. </li><li> Fissare l&#39;adattatore di collimazione al tavolo ottico ad una distanza sufficiente dal microscopio per consentire la trave di routing, l&#39;espansione e il posizionamento di altri componenti desiderati. Regolare la porta in fibra di assicurare coerenza vita trave su distanze paragonabili al percorso complessivo del fascio al microscopio. </li><li> Installare specchi indicate in Figura 1. Rimuovere l&#39;obiettivo dal microscopio e utilizzare gli specchi per indirizzare il fascio attraverso l&#39;apertura nella fase di montaggio obiettivo. Se preferito, il posizionamento degli specchi dicroici DM1 e DM3 può essere omesso finosuccessivamente. DM2 e DM3 sono entrambi shortpass e trasmissione della luce visibile, mentre riflettendo vicino IR e sopra. </li><li> È utile temporaneamente montare un puntatore laser rosso al posto dell&#39;obiettivo, allineato sull&#39;asse ottico del microscopio. Un adattatore meccanico personalizzato è necessario per assicurare la centratura del puntatore laser. Raggio visibile dal puntatore laser può quindi essere instradato indietro al centro dell&#39;apertura della porta fibra e può quindi essere utilizzato per installare le lenti (vedi sotto). </li><li> Installare il 980 nm beam expander (L8 e L9) a debita distanza dal porto di fibra per consentire futuro inserimento dei componenti dello sterzo (AOD o EOD), se necessario 1. Il raggio estesa deve leggermente riempire troppo il diaframma focale posteriore dell&#39;obiettivo. (Qui, obiettivi con lunghezze focali di 125 mm e 60 mm sono in una disposizione kepleriano di raddoppiare circa la vita del fascio). Utilizzare visibile fascio laser pointer (vedi sezione 1.6) per garantire il posizionamento della lente corretta e l&#39;allineamento approssimativo. </li><li> Install le lenti dello sterzo 980 nm (L2 e L3) in una disposizione telescopio come indicato (qui entrambi hanno 60 mm di focale) 1. L3 è montato in un piano coniugato al piano di back-focale dell&#39;obiettivo. Monte L3 su un palco di posizionamento di precisione XYZ per consentire orientamento del fascio. E &#39;utile per la fase di XYZ disporre di indicatori digitali per le sue micrometri, permettendo il posizionamento ripetibile e riposizionamento della trappola. La &quot;gamma di viaggi 0.5 è in genere sufficiente, tuttavia più viaggi per il posizionamento L3 lungo l&#39;asse ottico può essere utile. Usa puntatore laser visibile (vedi sezione 1.6) per garantire il posizionamento della lente corretta e l&#39;allineamento approssimativo. </li></ol> 2. Installazione del rivelatore del laser <ol><li> Installare il specchio dicroico DM3 sopra del condensatore, come mostrato in Figura 1. Un supporto personalizzato è in genere necessaria. Fissare il fotodiodo quad (QPD) o un rivelatore sensibile alla posizione (PSD) 8 al lato del gruppo condensatore e ensure che la 980 nm raggio laser riflesso da DM3 sta colpendo è all&#39;incirca sul centro. Quando si utilizza QPD, assicurarsi che sia montato su un piccolo palco XY per consentire un corretto centraggio del sensore sul raggio laser. </li><li> Installare L1 (tipicamente una lente 30 mm) tra DM3 e il sensore. Posizione L1 in modo da concentrare il fascio di una sola macchia sul sensore. </li><li> Installare il filtro notch poco prima di L1 per bloccare il fascio di 1.064 nm, nonché degli eventuali randagi riflessi di luce visibile dal illuminatore microscopio e illuminazione ambientale. </li></ol> 3. Installazione di 1.064 nm Holographic Trappola <ol><li> La parte olografica del setup è costruito intorno a un pacchetto hardware / software disponibile in commercio Gli specchi olografici usati in questo pacchetto sono tarati ad una potenza massima di incidente di 5 o 10 W / cm 2. Monomodali TEM00 travi di questa gamma di potenza possono essere facilmente acquistati da un laser DPSS a 1.064 nm di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Montare il laser 1064 nm su un elevatopiattaforma che corrisponda approssimativamente l&#39;altezza del percorso del fascio per la linea 980 (vedere sezione 1). </li><li> Se non direttamente controllabile, potenza del laser può essere regolata manualmente mediante l&#39;installazione di una piastra semi onda (HWP) e un polarizzatore (PBS) a destra dopo diaframma uscita laser. È utile per montare il polarizzatore in una fase rotante per poter abbinare requisito specchio olografico per la polarizzazione del fascio. </li><li> Installare il 1.064 nm beam expander (L6 e L7). La vita di fascio laser deve essere ampliato in base alle dimensioni diagonale dello specchio olografico. Per grandi rapporti di espansione (sopra 10X) può essere una preoccupazione di mantenere la dimensione dell&#39;espansore piccola. Così può essere desiderabile utilizzare lenti con insolitamente piccola lunghezza focale (qui: 16 mm e 175 mm). </li><li> Installare gli altri mirror, come indicato di dirigere il fascio di 1.064 nm attraverso l&#39;obiettivo. <ol><li> Sicuro DM1 dicroico (45 ° angolo di incidenza) in un supporto cinematico e posizionare il gruppo nel percorso del raggio 980 nm in modo che permette di undiminished trasmissione di tale trave. </li><li> Attiva luce puntatore laser. Lo specchio DM1 dovrebbe riflettere sufficiente quantità di luce visibile per posizionare correttamente il modulatore spaziale di luce (SLM) nel percorso di questa trave. L&#39;SLM deve anche essere inclinate in modo che i raggi laser in entrata e in uscita sono il più vicino possibile incidenza normale. Tuttavia l&#39;angolo di incidenza, deve essere sufficientemente grande da garantire che il raggio laser non è troncato da monta lente e altri componenti ottici. Un angolo di 5 ° deve essere facilmente raggiungibile ed è sufficientemente piccolo. La distanza tra DM1 alla SLM deve essere accuratamente misurata in modo che l&#39;inserimento di lenti L4 e L5 (vedi 3.6) può coniugare piano di riflessione SLM e il piano focale posteriore dell&#39;obiettivo. </li><li> Installare uno specchio per dirigere la luce da 1.064 nm beam expander al SLM. Assicurarsi che la luce puntatore laser colpisce l&#39;espansore apertura del fascio sul centro. </li></ol></li><li> Installare lenti L4 e L5 (qui: lenti con 125 millimetri e 200 mm rispettivamente). Questa coppia telescopio coniuga il piano di riflessione SLM al piano focale posteriore dell&#39;obiettivo e riduce anche il punto vita trave a solo leggermente riempire eccessivamente l&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo. Abbiamo scelto obiettivi con lunghezze focali lunghe per lo spazio della SLM lontano da DM1. Questo cancella non solo spazio per la seconda linea di laser, ma tende anche a rendere più facile l&#39;allineamento. </li><li> Rimuovere il puntatore laser. Lasciare l&#39;adattatore di montaggio per servire come apertura allineamento grossolano. </li></ol> 4. Sistema di installazione e allineamento Note <ol><li> Lente L3 e SLM devono essere posizionati in modo da essere otticamente coniugata al piano focale posteriore dell&#39;obiettivo. Il punto focale comune di L4 e L5 è otticamente coniugata al piano campione se i fasci ottici di cattura sono iniettati nello spazio infinito del microscopio. </li><li> cantare scheda visore IR allineare il fascio 980 nm per andare lungo l&#39;asse centrale del diaframma nell&#39;adattatore puntatore laser. </li><li> Utilizzare carta di IR to Assicurarsi che il fascio 1.064 nm colpisce lo stesso punto come il raggio 980 nm su DM1, L2 e L3 e che il fascio 1.064 nm va lungo l&#39;asse centro dell&#39;apertura nell&#39;adattatore puntatore laser. </li><li> Sostituire l&#39;adattatore di montaggio puntatore laser con un obiettivo. Obiettivo olio o acqua ad alta apertura numerica è tipica. </li><li> Allineare la trappola nm 980, come descritto in 9 per &quot;camminare&quot; il raggio laser fino a quando una figura di interferenza radiale simmetrico è visto sulla fotocamera. </li><li> Con l&#39;olografico specchio off (cioè agisce come uno specchio passivo) utilizzare SLM e DM1 a &quot;camminare&quot; il undiffracted 1.064 fascio nm per allineare la trappola nm 1.064. </li><li> Il SLM produce un significativo fascio undiffracted che si traduce in un forte trappola laser inamovibile nel campo di vista. Questo è utile per allineamento ma può essere indesiderabile per esperimenti. Bloccare questa trappola si può inserire un oggetto opaco piccola nel percorso della luce undiffracted nella posizione coniugato al piano del campione (ad es the punto focale comune di L4 e L5). La dimensione di questa macchia bloccante centrale deve essere in qualche modo più grande del diametro del disco di Airy per la luce concentrata (un bloccante con 100-300 micron di diametro per il sistema descritto). </li><li> egolare 1.064 nm polarizzazione del fascio utilizzando il polarizzatore per abbinare l&#39;orientamento SLM. Ruotare la piastra semionda per impostare la potenza del fascio di uscita come desiderato. </li><li> Se lo si desidera, inserire EOD fascio elementi sterzanti AOD o nella linea di laser a 980 nm. Garantire la corretta coniugazione di questi elementi al piano di back-focale dell&#39;obiettivo e riallineare la trappola. E &#39;utile per montare gli organi di sterzo su un palcoscenico goniometrica. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo costruito uno strumento che combina due trappole ottiche di tipo diverso (Figura 1) per fornire strutture trapping separate per manipolazione di oggetti e misura. La trappola ottica &quot;convenzionale&quot; è costruito intorno a un laser a diodo 980 nm. Questo fascio viene espanso, guidato e poi iniettato nel nostro microscopio invertito (&quot;luce rossa&quot; trave in Figura 1). La trappola ottica olografica è costruito intorno a un nm DPSS laser a 1.064. Il fascio viene es...

Intrappolamento ottico è una delle tecniche chiave in biofisica 6. Un avanzamento cruciale intrappolamento ottico è stato lo sviluppo di trappole olografici che consentono la creazione di modelli di intrappolamento tridimensionali anziché trappole point convenzionali 7. Queste trappole olografiche possiedono il vantaggio di versatilità nel posizionamento di oggetti rifrazione. Tuttavia trappole convenzionali possono essere facilmente allineate per essere più simmetrica rispetto commercialmente disponibili kit olografiche. Permettono anche per un veloce monitoraggio preciso degli oggetti intrappolati. Qui si descrive un sistema (Figura 1) che combina i due approcci di cattura in un apparecchio e permette all&#39;utente di sfruttare i vantaggi di entrambi come appropriato. Le considerazioni generali di costruzione di trappole ottiche (sulla base di fasci laser singole o multiple) sono discussi in dettaglio altrove 8-10. Qui, delineare le considerazioni specifiche per il nostro setup e fornire i dettagli della nostra procedura di allineamento. Per esempio, i sistemi con due fasci intrappolamento ottico sono state descritte in precedenza (es. rif. 11), tipicamente utilizzando un raggio laser per intrappolare un oggetto di rifrazione e utilizzando l&#39;altro (fascio potenza volutamente basso) per la lettura disaccoppiato della posizione dell&#39;oggetto intrappolato . Qui tuttavia, entrambi i fasci laser devono essere ad alta potenza (300 mW o superiore) perché entrambi sono da utilizzare per la cattura. Per misurazioni di sistemi biologici, i laser utilizzati per intrappolare dovrebbero rientrare in modo ottimale all&#39;interno di una specifica finestra NIR di lunghezza d&#39;onda per ridurre al minimo la degradazione proteica indotta luce 1. Qui abbiamo scelto di usare 980 nm diodo e 1064 nm laser DPSS a causa del loro basso costo, alta disponibilità e facilità di funzionamento. Abbiamo anche scelto di utilizzare un modulatore spaziale di luce (SLM) per creare e manipolare più trappole contemporaneamente in tempo reale 4,5. Questi dispositivi sono disponibili in commerciotuttavia la loro integrazione in un setup completo rappresenta una sfida unica. Qui si descrive un approccio pratico che affronta queste potenziali difficoltà e fornisce uno strumento estremamente versatile. Forniamo un esempio esplicito per il setup specifico descritto che può essere utilizzato come guida per i disegni modificati.

<table><tbody><tr><td>Optical table</td><td>Newport corporation</td><td>ST-UT2-56-8</td><td>Irvine, CA</td></tr><tr><td>Microscope, Inverted, Eclipse Ti</td><td>Nikon USA</td><td>MEA53220</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)</td><td>Nikon USA</td><td>MRD01901</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>Oil condenser Lens 1.4 NA</td><td>Nikon USA</td><td>MEL41410</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor technology USA</td><td>Ixon DU897</td><td>South Windsor, CT</td></tr><tr><td>1/3&quot; CCD IEEE1394 camera</td><td>NET USA Inc</td><td>Foculus FO124SC</td><td>Highland IN</td></tr><tr><td>Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength</td><td>Klastech Laser Technologies</td><td>Senza-1064-1000</td><td>Dortmund; Germany</td></tr><tr><td>laser diode, TEM00, SLM, 980 nm</td><td>Axcel Photonics</td><td>BF-979-0300-P5A</td><td>Marlborough, MA</td></tr><tr><td>laser diode mount</td><td>ILX Lightwave</td><td>LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984</td><td>Bozeman, MT</td></tr><tr><td>adjustable fiber ports</td><td>Thorlabs</td><td>PAF-X-11-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>holographic system</td><td>Arryx</td><td>HOTKIT-ADV-1064</td><td>Chicago, IL</td></tr><tr><td>holographic mirror</td><td>Boulder Non-linear Systems</td><td>this is a part of HOTKIT-ADV-1064</td><td>Lafayette, CO</td></tr><tr><td>Calcite polarizer</td><td>Thorlabs</td><td>GL10-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>half-wave plate</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1064</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Polarizer rotation mount</td><td>Thorlabs</td><td>PRM1</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>half-wave plate rotation mount</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>dichroic mirrors (DM2 &amp;amp; DM3); 45 &amp;deg; AOI</td><td>Chroma Technology</td><td>t750spxrxt</td><td>Bellows Falls, VT</td></tr><tr><td>dichroic mirror (DM1); 45 &amp;deg; AOI</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP1000R</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>custom mechanical adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>notch filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310-25</td><td>Rochester, NY</td></tr><tr><td>Acousto-Optic deflector (2-axis)</td><td>intraAction</td><td>DTD-584CA28</td><td>Bellwood, IL</td></tr><tr><td>goniometric stage</td><td>New Focus</td><td>9081</td><td>Santa Clara, CA</td></tr><tr><td>60 mm steering lenses</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>16 mm aspherical expander lens</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-016-C</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>175 mm expander lens</td><td>Thorlabs</td><td>LA1229-C</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Spot blocker (cabron-steel sphere)</td><td>Bal-Tec</td><td>0.0100&quot; diameter</td><td>Los Angeles, CA</td></tr><tr><td>Microspheres (Carboxyl-polystyrene)</td><td>Spherotech</td><td>CP-45-10</td><td>Lake Forest, IL</td></tr></tbody></table>

construction of a high resolution microscope with conventional and holographic optical trapping capabilities

Sistemi microscopio ad alta risoluzione con trappole ottiche consentono di intervenire precisa di vari oggetti rifrazione, come dielettrici perline uno o organelli cellulari 2,3, nonché per lettura ad alta risoluzione spaziale e temporale della loro posizione rispetto al centro della trappola. Il sistema qui descritto presenta uno di tali &quot;tradizionale&quot; trappola operante a 980 nm. Esso fornisce inoltre un secondo sistema intrappolamento ottico che utilizza un pacchetto olografico disponibile in commercio per creare e manipolare simultaneamente schemi di cattura complessi nel campo visivo del microscopio a 4,5 ad una lunghezza d&#39;onda di 1064 nm. La combinazione dei due sistemi permette la manipolazione di oggetti multipli refrattivi allo stesso tempo mentre condurre simultaneamente misure ad alta risoluzione di moto e di produzione di forza a scala nanometrica e piconewton alta velocità e.

La configurazione assemblata permette all&#39;operatore di intrappolare più oggetti rifrazione in tempo reale e posizionarli in tre dimensioni all&#39;interno del campo di vista. Illustriamo le capacità olografiche dello strumento intrappolando 11 microsfere (Figura 2). La trappola confinare ogni oggetto è ricreare manualmente posizionato su di intrappolare in modo che la disposizione finale raffigura il logo della University of Utah, dove è stato eseguito questo esperimento. Una funzione combinata ...

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

Il sistema qui descritto impiega una trappola ottica tradizionale e una linea intrappolamento ottico olografico indipendente, capace di creare e manipolazione di più trappole. Questo consente la creazione di complessi arrangiamenti geometrici di particelle di rifrazione e che permetta ad alta velocità misurazioni simultanee, ad alta risoluzione della attività degli enzimi biologici.

Costruzione di un microscopio ad alta risoluzione con convenzionali e Holographic Capabilities intrappolamento ottico

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

construction-high-resolution-microscope-with-conventional-holographic

Research

JoVE Journal

Engineering

12.1K Views.  University of Utah. Il sistema qui descritto impiega una trappola ottica tradizionale e una linea intrappolamento ottico olografico indipendente, capace di creare e manipolazione di più trappole. Questo consente la creazione di complessi arrangiamenti geometrici di particelle di rifrazione e che permetta ad alta velocità misurazioni simultanee, ad alta risoluzione della attività degli enzimi biologici.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Immunologia e infezioni

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Bioingegneria

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Lens-meno compatta digitale olografico microscopio per MEMS di ispezione e caratterizzazione

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Ingegneria

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Dimostrazione di un microscopio Hyperlens-integrato e super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Construction and Operation of a Light-driven Gold Nanorod Rotary Motor System

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and artificial nanomotors and may provide new routes towards single cell analysis, studies of non-equilibrium thermodynamics, and mechanical actuation of nanoscale systems. A facile way to drive rotation is to use focused circularly polarized laser light in optical tweezers. Using this approach, metallic nanoparticles can be operated as highly efficient scattering-driven rotary motors spinning at unprecedented rotation frequencies in water.
In this protocol, we outline the construction and operation of circularly-polarized optical tweezers for nanoparticle rotation and describe the instrumentation needed for recording the Brownian dynamics and Rayleigh scattering of the trapped particle. The rotational motion and the scattering spectra provides independent information on the properties of the nanoparticle and its immediate environment. The experimental platform has proven useful as a nanoscopic gauge of viscosity and local temperature, for tracking morphological changes of nanorods and molecular coatings, and as a transducer and probe of photothermal and thermodynamic processes.

Plasmonic gold nanorods can be trapped in liquids and rotated at kHz frequencies using circularly-polarized optical tweezers. Introducing tools for Brownian dynamics analysis and light scatteringspectroscopy leads to a powerful system for research and application in numerous fields of science.

Costruzione e funzionamento di un sistema motore basato su luce oro Nanorod Rotary

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Biologia dello sviluppo

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Biochimica

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Una guida per costruire un altamente propenso spazzato Tile microscopio per l'esteso campo di vista singola molecola Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...