Il nostro metodo ci consente di visualizzare singole molecole con un'area dell'immagine 40 volte più grande rispetto ai metodi convenzionali e ha un segnale di fondo notevolmente ridotto. A differenza di altre tecniche, il nostro approccio utilizza una singola lente obiettiva, non richiede una speciale camera campione ed è facilmente compatibile con i sistemi di microscopio commerciali. Dopo aver raccolto i componenti necessari inizia a costruire il sistema.
Qui, diversi elementi sono già in posizione in panchina. Montato su un blocco di alluminio è un corpo al microscopio con uno stadio Piezo e un portacampioni. Sul banco ci sono anche tre laser ed elementi ottici per combinare i fasci.
Le travi combinate sono accoppiate a una fibra monodale nel modo più efficiente possibile. Come fase preliminare finale, assemblare una sorgente luminosa collimata in un sistema di gabbie. Questo ha una sorgente luminosa coerente temporanea collegata a una fibra a singola modalità, un adattatore in fibra, una lente acromatica e un diaframma.
Iniziare a lavorare con il percorso di rilevamento. In primo luogo, posizionare la sorgente luminosa collimata nella porta obiettivo del corpo del microscopio. Regolare lo specchio sotto gli obiettivi in modo che il fascio di uscita sia approssimativamente orizzontale e allineato con i fori del banco.
Inserire uno specchio dicroico nel percorso del fascio e riflettere la trave di 90 gradi. Aggiungere specchi per consentire la regolazione del percorso del fascio trasmesso a una fotocamera sCMOS. Utilizzare gli specchi per assicurarsi che il fascio colpisca il centro del chip.
Quindi, inserire un obiettivo a tubo di lunghezza focale da 300 millilitri a circa una lunghezza focale dalla fotocamera. Rimuovere la sorgente luminosa collimata dal corpo del microscopio. Quindi regolare la posizione dell'obiettivo del tubo per impostare il suo piano focale.
Interrompere le regolazioni quando la fotocamera risolve chiaramente il motivo sul soffitto. Il percorso di rilevamento è illustrato in questo schema. Si noti l'aggiunta di un filtro passa multi banda prima dell'obiettivo del tubo per l'imaging a fluorescenza multicolore.
Torna al corpo del microscopio. Lì, reinstallare la sorgente luminosa collimata nel supporto obiettivo. Dopo lo specchio dicroico, posizionare uno specchio piegato nel percorso della trave riflessa per reindirizzarlo di 90 gradi.
Rimuovere la sorgente luminosa collimata dal corpo del microscopio e posizionarla nelle vicinanze. Quindi, inserire una lente di lunghezza focale di 400 millimetri a circa una lunghezza focale dallo specchio. Al corpo del microscopio installare l'obiettivo obiettivo.
Quindi regolare la posizione dello specchio lungo l'asse ottico. Osserva il soffitto sopra l'obiettivo e fermati quando si forma un perfetto modello di disco Airy lì. Ora rimuovere l'obiettivo e reinstallare la sorgente luminosa collimata con un diaframma aperto.
Determinare dove lungo il percorso del fascio la trave è più piccola a circa 400 millimetri di distanza dallo specchio. Una volta identificato il punto, montare uno specchio lì, un piano di immagine coniugato. Lo stato dell'insieme a questo punto viene visualizzato in questo schema.
Lo specchio appena aggiunto è etichettato M5. Inserire un altro specchio per riflettere il fascio di 90 gradi e montare un obiettivo di lunghezza focale di 150 millimetri oltre. L'obiettivo deve essere a 150 millimetri dal piano dell'immagine coniugato. Quindi, togliere temporaneamente la prima lente nel percorso del fascio di eccitazione.
Con questa configurazione trova la posizione focale della seconda lente. Posizionare uno specchio galvo a singolo asse in questo punto focale come piano focale posteriore coniugato. Fornire zero volt allo specchio galvo e ruotare il suo supporto in modo che rifletta il fascio di 90 gradi.
Successivamente lungo il percorso del fascio, posizionare uno specchio pieghevole che riflette la trave a 90 gradi. Posizionare l'obiettivo di 100 millimetri lungo il percorso del fascio dal piano focale posteriore coniugato. Ancora una volta, rimuovere la sorgente luminosa collimata dal supporto del microscopio.
Aggiungere un'altra lente di collimazione da 100 millimetri con un adattatore in fibra e una fibra monomodale insieme a un diaframma. Quindi utilizzare il diaframma, la fibra e l'obiettivo per inviare un fascio collimato attraverso il sistema di imaging. Quindi, inserire una lente cilindrica di lunghezza focale di 400 millimetri poco prima dell'ultima lente di collimazione nel percorso del fascio.
Usalo per mettere a fuoco la trave. Inserire una lente cilindrica di 50 millimetri di 450 millimetri davanti alla prima. Si tratta di una rappresentazione schematica della configurazione finale con i percorsi di rilevamento ed eccitazione.
L'uscita dei tre laser è accoppiata nel percorso dalla fibra a modalità singola. Per i test preparare un campione di idrogel 3D. Questo è costituito da perline cremisi da 20 nanometri mescolate con idrogel.
Al setup posizionare il campione di idrogel nel supporto del campione. Per l'eccitazione del campione accendere il laser da 638 nanometri e regolarne la potenza a meno di un milliwatt. Configurare il software di controllo della fotocamera in modalità trigger interno e acquisire video.
A questo punto il motore galvo ha zero volt applicati. Posizionare la fotocamera in modo che l'immagine si trova al centro dell'obiettivo. Quindi, regola lo specchio che è il piano dell'immagine coniugato.
Ruotare la manopola orizzontale sullo specchio per ottenere un'illuminazione altamente inclinata. Registrare l'immagine della piastrella come nell'immagine a fluorescenza del campione di idrogel 3D con perline da 20 nanometri. La barra di scala è di 20 micrometri.
Procedere dopo aver installato hardware e software per spazzare il mirror galvo. Questo è il software di scansione mirror galvo per la configurazione. Disporre l'imaging completo del campo visivo impostando Vmin su meno 500 millivolt.
Quindi impostare Vmax su 500 millivolt. Passare quindi al software di acquisizione della fotocamera. In modalità trigger selezionare Esterno.
Nel menu a discesa LightScan PLUS selezionare Giù avanti, quindi fare clic su Scan Speed Control. È ora possibile impostare alcuni parametri di controllo. In Altezza finestra immettere 180 righe.
In Esposizione immettere 28 millisecondi. Al termine, tornare al software di controllo mirror. Nel software di controllo mirror accendere stack 3D ON. Specificare il numero di pile e le dimensioni del passo.
Fare clic su Scatta video per avviare la registrazione delle immagini. Questo è un esempio di imaging Epi di DNA etichettato a singolo filamento. Al contrario, la tecnica delle piastrelle spazzate altamente inclinate ha prodotto questa immagine.
L'immagine HIST mostra meno sfondo rispetto all'immagine Epi. Il DNA si trova in un idrogel 3D, e la lunghezza d'onda dell'eccitazione è di 638 nanometri. Ecco un'immagine Epi del fattore di allungamento della traduzione eucariota etichettato 2.
L'immagine HIST ha migliorato il rapporto segnale-sfondo. Ha anche un'illuminazione più uniforme. Entrambi hanno la stessa potenza di illuminazione di 7,5 milliwatt.
La velocità di imaging era di entrambi 2,5 fotogrammi al secondo. È importante mantenere costantemente un angolo di inclinazione elevato e sincronizzare lo specchio di spazzamento con la lettura della fotocamera. Ciò garantisce un elevato rapporto segnale-sfondo durante l'acquisizione dell'immagine.
Prevediamo che la microscopia HIST andrà a vantaggio di diverse applicazioni, tra cui l'imaging a super-risoluzione a profondità di imaging più profonde e la profilazione dell'espressione genica ad alta produttività in fette di tessuto spesse.
