Ringraziamo Bernard Foucart per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FRS-FNRS) e dal Fondo regina Elisabetta per la ricerca medica. Agnès Villers è assegnista di ricerca presso il Fondo belga per la Ricerca Scientifica.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of norme sanitarie per la cura e l&#39;uso di animali nella ricerca e con l&#39;accordo del comitato etico locale. 1. Preparazione del Artificial liquido cerebro-spinale Lo stesso supporto utilizzato per sezionare, tagliare e perfusione fette (1 ml / min) durante il periodo di riposo e le registrazioni elettrofisiologiche. Questo supporto è composto da 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mm MgSO 4 e 10 mm D-glucosio. <ol><li> Pesare i diversi componenti per 2 L di ACSF tranne MgSO4 che è già in soluzione (1 M). Usando una soluzione standard permette di essere sicuri della esatta concentrazione di Mg 2 + perché MgSO4 in polvere è altamente igroscopico. Ca 2 +: Mg2 + rapporto influenza notevolmente l&#39;induzione e il mantenimento LTP14 e, quindi, le loro proporzioni vanno sempre rispettati. </li><li> Mettere tutti i componenti ad eccezione CaCl 2 in un bicchiere cilindro graduato e portare a 2 L con acqua distillata H 2 O. </li><li> Mescolare energicamente. Quando tutto è sciolto, aggiungere CARBOGEN attraverso un gorgogliatore acquario e il tubo attaccato al serbatoio (95% O 2, 5% di CO 2). Attendere qualche minuto e aggiungere cloruro di calcio quando il pH è fissato a 7,4 con l&#39;azione del tampone bicarbonato. </li><li> Tenere 600 ml in un piatto di vetro rettangolare refrigerato e raffreddare a 4 ° C con ghiaccio intorno al piatto. Questo supporto saranno utilizzati per la dissezione dell&#39;ippocampo. </li><li> Filtra i restanti 1.400 ml e conservare in una beuta. </li></ol> 2. Preparazione del Rig elettrofisiologici e cervello Slice Recording Camera Il circuito di perfusione è fatto di due pompe peristaltiche, uno di pompaggio del liquido fresco da un serbatoio di riserva e l&#39;altro fluido utilizzato pompaggio da tsi registra da camera per un bidone. Fluido fresco viene aggiunto ad un sistema di perfusione casereccio dove viene ri-ossigenato e riscaldato prima di raggiungere la camera di registrazione di interfaccia per gravità (Figura 1A). La camera di registrazione di interfaccia è stato progettato da FST (Belle Strumenti Scienza, Vancouver, Canada, figura 1b). Fette di tessuto sono posti su filtro di rete tessuta applicato all&#39;anello ben rimovibile e può essere costantemente mantenuta in condizioni di interfaccia regolando l&#39;altezza di aspirazione ben dell&#39;ago. Un tubo di plastica fatta in casa bloccata alla sua estremità e forati lateralmente (0,5 mm) è fissato l&#39;ago di aspirazione per aumentare la stabilità livello nella camera. La testina di registrazione è montata su un bagno d&#39;acqua contenente una pietra dispersione gas che aiuta a mantenere un ambiente umido facendo passare aria umida attraverso i porti deflessione della testa di registrazione (per diminuire la formazione di goccioline d&#39;acqua). Bagno e media temperatura sono controllati dal continuo variando il livello di secolo corrente continuaruvida una gomma siliconica-embedded elemento riscaldatore nel bagno d&#39;acqua. Termistori nel bagno d&#39;acqua e pozzi di registrazione consentono la temperatura della camera per impostare e monitorare con precisione in questi siti. Il sistema di riscaldamento della camera è completata da un sistema di riscaldamento globale controllando la temperatura dell&#39;intero impianto. Il software sviluppato dai ricercatori dell&#39;Università di Edimburgo ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) monitora e equalizza la temperatura dell&#39;aria ossigenata, la fetta cervello, gli elettrodi e l&#39;impianto di perforazione restante fornire un ambiente stabile per registrazioni a lungo termine (Figura 1C) . La temperatura usato per topo fettine ippocampali è di 28 ° C. <ol><li> Risciacquare tutto il circuito di perfusione con H 2 O distillata per almeno 20 min e avviare i sistemi di riscaldamento. </li><li> Avviare il gorgogliare CARBOGEN nel circuito. Carbogen arriva nei fatti in casa-tubi perfusione attraverso fcandele ilter e nel bagno d&#39;acqua al di sotto della camera di registrazione. La portata nel bagno d&#39;acqua è controllata da un flussometro. Se la portata è troppo lento, il tessuto potrebbe diventare ipossico. Viceversa, se la portata è troppo alta, il gas potrebbe non essere sufficientemente riscaldata e idratata conseguente essiccamento del tessuto. Elevata portata di gas potrebbe aumentare la probabilità di spruzzi d&#39;acqua sul tessuto dal bagno d&#39;acqua sottostante che porta a shock osmotico. Ciò può essere evitato aggiungendo pezzetti di maglia di nylon (100 pm) all&#39;uscita dei porti deflessione. </li><li> Svuotare il circuito e riempire con ACSF filtrata. </li><li> Mettere l&#39;anello che sosterrà la fetta nella camera di tenuta. Un filtro a rete tessuto con aperture di maglia che vanno 500-750 micron è allungata e collegata all&#39;anello con colla epossidica resina a due componenti. Il filtro a rete tessuto è fatto di 87% poliammide e 13% elastan (collant 15 den). Colla deve essere applicata con attenzione per evitare la formazione di rilievi sulla superficie del ring. </li><li> Rimuovere con attenzione tutte le bolle d&#39;aria dal circuito. </li><li> Regolare il livello di ACSF nella camera di registrazione con la vite dell&#39;ago di aspirazione. La velocità delle pompe peristaltiche viene regolata a 1 ml / min per la pompa di aspirazione e di 5 ml / min per la pompa di scarico. </li></ol> Il sistema di perfusione è posto su un tavolo resistente alle vibrazioni rigido e circondato da una gabbia di Faraday. 3. Preparazione della Zona Dissection Strumenti chirurgici: un bisturi con lama # 11, piccole forbici standard di dissezione, forbici a molla, pinze curve, due Heidemann spatole e un cucchiaio. Materiale supplementare: una ghigliottina, un underpad, un chopper tessuto McIlwain con una lama di rasoio, carta da filtro, una pipetta Pasteur di vetro con una tettarella di gomma, plastica 2 pipette Pasteur di cui uno con una bocca larga, una capsula di Petri, un cilindro metallico di 7 mm di diametro (Figura 2A). <ol><li&gt; Nel piatto dissezione pieno di freddo ACSF (preparata nella fase 1), immergere un coperchio in vetro refrigerata da un piatto di colorazione, avvolto in carta da filtro. Rimuovere con attenzione le bolle d&#39;aria e ossigenare il ACSF attraverso un acquario gorgogliatore (Figura 2A). </li><li> Disporre di strumenti in ordine di utilizzo. Aggiungere tre strati di carta filtro sulla piastra chopper tessuto e una nuova lama di rasoio pulito con acqua distillata ed etere (Figura 2B). La lama deve essere orizzontale quando tocca la carta. Forza della lama viene regolata a metà del valore massimo e la velocità a circa un terzo del valore massimo. </li><li> Verificare attentamente se tutto è pronto (strumenti, temperatura ...), perché non avrete tempo dopo. </li><li> Chiedere a qualcuno di spruzzare la dissezione con una pipetta Pasteur pieno di ACSF freddo. </li><li> Anestetizzare il mouse con IP Nembutal (100 mg / kg) prima di decapitazione. Alotano può anche essere usato. Abbiamo confrontato entrambi i metodi e obtained stessi risultati. Decapitazione deve essere eseguita in anestesia dislocazione cervicale ma può anche essere usato. Tuttavia dislocazione cervicale necessita di una pratica molto buona per evitare la sofferenza degli animali. </li><li> Sezionare il underpad il più rapidamente possibile sotto doccia fredda continua ACSF. </li></ol> 4. Rimozione Cervello <ol><li> Mentre si tiene ancora la testa con il dito indice e il pollice di una mano sul muso, fare un&#39;incisione con le forbici dissezione lungo la metà della parte superiore della testa a partire dal bordo del taglio ghigliottina e funzionante rostralmente all&#39;osso frontale . </li><li> Tagliare attraverso il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le piastre cranio e rimuovere i muscoli a lato caudale della testa. </li><li> Con le forbici dissezione, tagliare il muscolo temporale su ogni lato, lungo la piastra temporale, quindi tagliare le piastre frontali in mezzo, trasversalmente. Poi, fare un piccolo taglio sull&#39;osso occipitale, tra i due plAtes. </li><li> Per ogni lato, tagliato alla base caudale delle piastre occipitali. </li><li> Tagliare lungo la sutura sagittale con le forbici a molla. </li><li> Con una pinza, togliere le due metà del cranio, diffondendo loro distanti. </li><li> Con il bisturi, tagliare trasversalmente appena dopo il bulbo olfattivo e poco prima del cervelletto poi precipitare il cervello estratto nel piatto dissezione con freddo ACSF. </li></ol> 5. Dissezione ippocampale <ol><li> Una volta che il cervello è immerso nel piatto dissezione, recidere i due emisferi uno dall&#39;altro con un bisturi inserito nella metà. </li><li> La dissezione di ippocampo viene eseguita con spatole sotto controllo visivo attraverso un microscopio binoculare chirurgico (X25, Figura 2A). Su un emisfero, accuratamente diffondere le strutture di vedere il ventricolo laterale. Rimuovere il tronco cerebrale e diencefalo. Questo viene fatto applicando il spatole sulla corteccia frontale su un lato e sul diencefalo suldall&#39;altro lato. Fare attenzione a non toccare l&#39;ippocampo con spatole e per non allungare durante il sezionamento dei tessuti. </li><li> Sever del fornice quindi spingere delicatamente l&#39;ippocampo fuori della corteccia (rotolare via), con l&#39;inserimento di una spatola nel ventricolo. </li><li> Quando l&#39;ippocampo viene estratta, rimuovere il tessuto in eccesso e corteccia rimanenti vasi sanguigni. </li></ol> 6. Tagliare delle fette <ol><li> Con una bocca di plastica pipetta Pasteur, trasferire l&#39;ippocampo in un cucchiaio, con le sue Alvear verso l&#39;alto di superficie (lato convesso). </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso con uno standard di plastica pipetta Pasteur. </li><li> Suggerimento il cucchiaio verticalmente quasi a toccare la carta da filtro del chopper (Figura 2B) e scendere l&#39;ippocampo dal cucchiaio, dal rapido toccando la carta da filtro quindi spostare indietro il cucchiaio. </li><li> Orientare l&#39;ippocampo e tagliatelo a fette trasversalmente a 400 micron con l&#39;elicottero (vedi Figura 2C per l&#39;orientamento dell&#39;ippocampopus relativi alla lama di rasoio). Agire il più rapidamente possibile. </li><li> Rimuovere la carta da filtro con l&#39;ippocampo a fette e avvolgerla intorno al cilindro metallico per diffondere le fette un po &#39;. Poi, libera le fette con spruzzi di ACSF utilizzando una plastica standard di pipetta Pasteur e raccoglierli in una capsula di Petri riempita con ACSF freddo. </li></ol> 7. L&#39;incubazione delle fette di interfaccia <ol><li> Selezionare fette con uno standard di plastica pipetta Pasteur e rapidamente metterli nella camera di registrazione. Fette riprendersi dal trauma dissezione direttamente nella camera di registrazione, in un&#39;interfaccia a 28 ° C. </li><li> La fetta molto probabilmente lavandino. Abbassare il livello del liquido di raggiungere il livello di sezione, e poi sollevarlo per farlo galleggiare. </li><li> Ruotare la fetta nella posizione corretta mentre abbassando il livello. Fette sono sempre orientati nello stesso modo per facilitare il posizionamento di elettrodi (2 stimolante e uno elettrodi di registrazione) nella regione CA1. </li><li> Fermarsi quandoil fluido è in interfaccia. A &quot;menisco&quot; dei media intorno alla fetta è indicativo di un livello sufficiente di supporti. Il filtro di rete deve essere saturo di media, ma non completamente sommerso. </li><li> Tenere la camera coperta con carta da filtro posto sopra il coperchio forato. </li><li> Lasciare riposare la fetta per almeno 1,5 ore a 28 ° C. </li></ol> 8. Registrazione delle risposte sinaptiche <ol><li> Registrazione di elettrodo: vetro capillari sono tirati da ottenere una resistenza punta di 2-5 MW quando è riempita di ACSF. Un piccolo pezzo di carta da filtro è disposto intorno alla punta dell&#39;elettrodo e cera ossea è applicato all&#39;estremità da ridurre la condensazione. Elettrodi stimolanti: platino-iridio elettrodi bipolari a grappolo con un diametro di 12,5 micron sono acquistati da FHC (USA). Con una cura, ciascun elettrodo può essere usato almeno 30 volte (Figura 1B). </li><li> Posizionare gli elettrodi nella radiatum strato della regione CA1, tutti gli elettrodi rivestitiup (Figura 3A). Elettrodi vengono abbassati 75 a 150 micron sotto la superficie della fetta con Narishige micromanipolatori. I due elettrodi di stimolazione sono posti a stimolare due fasci distinti di Schaffer collaterali. Quando gli elettrodi vengono abbassati sulla fetta, carte da filtro sono accuratamente messi tutti intorno a chiudere la camera. </li><li> Stimolazione bifasica (0,08 msec durata dell&#39;impulso per mezza onda) viene eseguita a tensione costante con uno stimolatore Grass collegato a unità di isolamento SIU-V. Massima risposta è controllato aumentando l&#39;intensità dello stimolo da 2 V a 12 V. massimo EPSPs di campo sono amplificati 1.000 volte con un amplificatore WPI ISO-80 e filtrati a 10 Hz e 10 kHz. Il segnale viene poi inviato ad un PC tramite uno strumento nazionale di un convertitore A / D. Stimolazione, l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati vengono eseguite utilizzando il programma WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSPs di campo sono registrate al 40% dell&#39;ampiezza massima ottenuta in un ingresso-outmettere curva. Per ogni sezione, le piste fEPSP sono normalizzati contro la pendenza media del 30 min precede LTP induzione. </li><li> LTP è innescato applicando un singolo treno di stimolazione (100 Hz) alla concentrazione di prova su una via mentre il secondo percorso serve da controllo. </li></ol> 9. Pulizia del Setup <ol><li> Sciacquare tutto il circuito con una soluzione al 3% di acqua ossigenata (H 2 O 2) per almeno 10 minuti, poi scolare. Il circuito sarà accuratamente risciacquati con acqua distillata prima di iniziare qualsiasi esperimento. L&#39;uso di H 2 O 2 non è assolutamente necessaria come altri laboratori utilizzano solo acqua distillata per pulizia ma abbiamo notato la deposizione di residui scuri nel sistema di tubazioni utilizzando solo acqua. </li><li> Sostituire l&#39;acqua nel bagno d&#39;acqua sotto la camera di registrazione. </li><li> Bath gli elettrodi stimolanti suggerimenti in alcool per 5 min. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio un protocollo risultante dalla combinazione dei metodi sviluppati e utilizzati da altri laboratori aventi un grande esperienza in registrazioni LTP 11,17. Questo protocollo è atto ad adulto ippocampo mouse e può essere utilizzato in animali di qualsiasi età e qualsiasi sfondo genotipo. Esso permette anche l&#39;analisi LTP in topi transgenici sviluppare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 18,19. L&#39;utiliz...

Al giorno d&#39;oggi, non vi è limitata comprensione di come le memorie complesse vengono memorizzate e richiamate a livello di circuito neuronale. Tuttavia, un&#39;ipotesi unificante di memoria è disponibile e ampiamente riconosciuti: memorie sono memorizzati come cambiamenti nella forza delle connessioni sinaptiche tra i neuroni nel sistema nervoso centrale. Di per sé, la ricerca sulla plasticità sinaptica ha largamente beneficiato di due scoperte svolta. (1) In un esperimento seminale, Bliss e Lomo 1, utilizzando il coniglio anestetizzato intatta, trovato che la consegna di una breve alta frequenza (1 sec, 100 Hz) impulso alla via perforante dell&#39;ippocampo causato una lunga durata (vari ore) aumento delle relative connessioni sinaptiche. Questo fenomeno affascinante è stato chiamato &quot;potenziamento a lungo termine&quot; o LTP da Douglas e Goddard nel 1975 2. (2) Successivamente, è stato trovato che un fenomeno simile potrebbe essere innescato in fettine cerebrali (0,4 mm) mantenuta artificialmente in vita in vitro </em&gt;. La LTP più studiato è stato osservato in vitro, fornendo uno o più tetani ad un fascio di assoni (cosiddetti collaterali Schaffer) durante la registrazione del campo risultante sinaptica eccitatoria potenziale evocato nei neuroni piramidali della cosiddetta regione CA1. I meccanismi di induzione di LTP sono stati ampiamente rivelato. Fondamentalmente, un afflusso di Ca 2 + attraverso i recettori NMDA attiva enzimi con due conseguenze: una fosforilazione di recettori AMPA (che aumenta la loro efficienza) e una incorporazione di recettori AMPA extra nella membrana postsinaptica 3. Per contro, i meccanismi della fase di mantenimento LTP sono largamente sconosciuti, soprattutto perché é sperimentalmente molto più difficile mantenere una fetta sano per molte ore che per 30 a 60 min. Molti studi sono stati dedicati alla comprensione dei meccanismi di LTP e teorie interessanti sono state elaborate nel corso degli anni, 4-11. Ma ONUfino ad ora, i meccanismi molecolari precisi alla base della crescita stabile in forza sinaptica non sono stati chiariti. Questo potrebbe essere dovuto alla difficoltà di riprodurre i risultati precedenti in laboratori diversi utilizzando tecniche diverse per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali. Nel loro documento metodologia, Sajikumar et al. 12 ha sottolineato l&#39;importanza delle condizioni sperimentali per la preparazione di fettine di ippocampo di ratto e la registrazione delle LTP stabile. In questo video vi presentiamo tutte le fasi di ottimizzazione sviluppati nel nostro laboratorio nel corso degli anni di essere in grado di registrare un LTP molto stabile nel topo fettine di ippocampo. Questa ottimizzazione è stata fatta dai protocolli sviluppati e utilizzati con successo da altri laboratori che studiano i meccanismi di LTP in topi e ratti 13 11. Esso consente a ricercatori esperti di indurre e registrare un tempo molto lungo LTP duratura in topi adulti con un alto tasso di successo. Il pbase hysiological della indotto LTP è stato attentamente verificato e dimostrato 14. In questo lavoro la metodologia, si dimostra che le modifiche delle condizioni sperimentali, come la temperatura o l&#39;ossigenazione possono avere un profondo impatto sulla manutenzione LTP, mentre la procedura di dissezione può modificare profondamente le fette eccitabilità. Si deve inoltre sottolineare che il controllo preciso di tutti questi parametri richiede una formazione di diversi mesi per gli studenti alle prime armi.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

Potenziamento a lungo termine (LTP) è un tipo di plasticità sinaptica caratterizzata da un aumento della forza sinaptica e crede di essere coinvolti nella codifica della memoria. LTP suscitato nella regione CA1 di fettine di ippocampo acute è stata ampiamente studiata. Tuttavia i meccanismi molecolari alla base della fase di questo fenomeno manutenzione sono ancora poco conosciuti. Questo potrebbe essere dovuto in parte alle diverse condizioni sperimentali utilizzate da diversi laboratori. Infatti, la fase di mantenimento LTP è fortemente dipendente da parametri esterni come ossigenazione, temperatura e umidità. Esso dipende inoltre parametri interni come orientamento del piano di tranciatura e vitalità fetta dopo dissezione. L&#39;ottimizzazione di tutti questi parametri permette l&#39;induzione di un potenziamento molto riproducibile e molto stabile a lungo termine. Questa metodologia offre la possibilità di esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari coinvolti nella crescita stabilein forza sinaptica in fettine di ippocampo. Si evidenzia anche l&#39;importanza delle condizioni sperimentali in vitro in indagini di fenomeni neurofisiologici.

Questa metodologia è stata utilizzata per analizzare le proprietà di potenziamento a lunga durata a lungo termine indotta in fettine ippocampali acute da adulti topi C57BL/6J (JANVIER SAS, Francia) 14. Sorprendentemente, il miglioramento delle condizioni sperimentali ha portato ad un nuovo modo di guardare alla LTP. Abbiamo dimostrato che la crescita di lunga durata in forza sinaptica non ha richiesto la sintesi di nuove proteine. Qui, dimostriamo che l&#39;induzione LTP dipende...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare<em&gt; In vitro</em&gt; Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K Views.  University of Mons. Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare In vitro Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...