Questo lavoro è stato supportato da MRC, EU FP7, lolla, Wellcome Trust e Parkinson UK. Vorremmo anche ringraziare la signora Johanna Buchler per il suo contributo delle immagini confocal e i membri del laboratorio per il loro contributo costruttivo sul manoscritto e metodologia.

tutti gli esperimenti con topi e ratti sono stati approvati e condotti utilizzando le procedure di pianificazione 1 coperti sotto l'atto di casa ufficio animali (procedure scientifiche) 1986. La ricetta di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) può essere trovata nella tabella 1.
 1. acuta Hippocampal Fetta preparazione <ol><li>rimuovere il cervello del mouse più velocemente possibile, utilizzando una spatola e forbici per tagliare il cranio e inserirlo nella gelida affilate, ossigenato (95% O 2, 5% CO 2), alto-saccarosio ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Posto nel cervello del topo su una piastra di Petri e rimuovere il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi prima hemisecting giù la linea mediana del cervello.</li>
	<li>Posizionare i due emisferi sul lato che è stato appena tagliato e incollare ogni emisfero sul palco di un vibratomo.</li>
	<li>Tagliare 200-300 µm di spessore sezioni della regione completa di interesse. In caso di ippocampo, dovrebbero ottenere circa 3-4 fette per emisfero.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica, trasferire le fette in una camera sommersa ossigenato (95% O, 2, 5% CO 2) ACSF. Mantenere a 34 ° C per 30 min. 
	Nota: Il trattamento delle fette con attivi agenti farmacologici, quali proteine ricombinanti di Dkk1, può essere eseguito in questa fase aggiungendo gli agenti alla fetta camera.</li>
	<li>Rimuovere le fette dalla camera utilizzando un pennello, inserirli in una piastra a 24 pozzetti e difficoltà per 20 min a 1 h in paraformaldeide al 4% (saccarosio PFA)/4% a temperatura ambiente (TA). 
	Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in 1X PBS (10 min. ciascuno). 
	Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per 1-2 giorni, finché le fette sono conservate a 4 ° C in 1X PBS.</li>
</ol> 2. Immunofluorescenza per marcatori sinaptiche Nota: le ricette di tutti i buffer utilizzati possono essere trovate nella tabella 2.
<ol><li>Sostituire il PBS con tampone di blocco/permeabilizing (tabella 2) nei pozzetti fetta e incubare a temperatura ambiente per 4-6 h.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo policlonale cavia contro vGlut1 1:2,000 il fattore di diluizione nel buffer blocco/permeabilizzazione. 
	Nota: vGlut1 è un indicatore per la pre-sinaptica eccitatoria visualizzazione terminal. Per l'identificazione di sinapsi eccitatorie post-sinaptiche, utilizzare un anticorpo policlonale contro PSD-95 e diluito 1: 500 nella stessa soluzione. Utilizzare un volume minimo di 300 µ l in ogni pozzetto. Per identificare la posizione anatomica dell'ippocampo, utilizzare un anticorpo che può anche identificare la struttura neuronale, come MAP2 o tubulina. Lavorare fuori le concentrazioni corrette di tutti gli anticorpi primari per i marcatori sinaptici di scelta (pre- e post-sinaptico) e diluito in tampone fresco blocco/permeabilizing.</li>
	<li>Incubare le fette nella soluzione anticorpo primario durante la notte (o per 1-2 giorni) a 4 ° C. uso a scuotimento con vigoroso movimento.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).</li>
	<li>Diluire la 1: 500 appropriati anticorpi secondari in tampone bloccante. Ad esempio, quando si utilizza l'anticorpo di cavia vGlut1, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di cavia (ad es., asino anti-porcellino d') coniugata ad un fluorophore specifico. Quando si utilizza l'anticorpo di coniglio di PSD-95, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di coniglio (ad es., anti-coniglio di asino) coniugata ad un fluorophore specifico diverso.</li>
	<li>Incubare le fette in questa soluzione per 2-3 h a RT. Accertarsi che le fette siano protetti dalla luce, come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).</li>
	<li>Attentamente togliere le fette dalla piastra 24 pozzetti utilizzando un pennello e metterli in modo uniforme su vetrini pre-etichettate. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni fetta e quindi posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti sopra le fette. Evitare la formazione di bolle d'aria. Fate attenzione ad per usare abbastanza liquido di montaggio (300-400 µ l), come una quantità insufficiente può portare a secco fette.</li>
	<li>Lasciare asciugare per un minimo di 1-2 giorni a RT e mantenere le diapositive al riparo dalla luce.</li>
	<li>Archiviare le diapositive a 4 ° C nel breve termine, ma per l'archiviazione a lungo termine, conservare a -20 ° C.</li>
</ol> 3. Analisi e acquisizione di immagini confocal <ol><li>Imaging mediante microscopia a scansione laser confocale.
	<ol><li>Identificare la regione dell'ippocampo essere imaged (ad es., il cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) o il giro dentato (DG)) per mezzo di un 10x o 20x obiettivo.</li>
		<li>Cambiamento di un x 40 o 63 x obiettivo a immersione in olio per assicurarsi che l'anatomia della fetta è intatto identificando neurites continuo e organizzato la struttura. Utilizzare un indicatore di un neurone, quali MAP2, come riferimento ( Figura 1A).</li>
		<li>Successivamente, passare a un 60 x obiettivo a immersione in olio (NA = ~1.3 - 1.4) e regolare le impostazioni per ciascun canale per ottenere segnale ottimale e contrasto. Impostare l'intensità di ogni laser per evitare la saturazione dei pixel di utilizzando l'opzione alto / basso contrasto. 
		Nota: Queste impostazione verrà dipendono il microscopio utilizzato, ma fare riferimento alla Tabella materiali per le impostazioni di risparmio energia di laser utilizzati in Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Per risultati ottimali, utilizzare una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Le impostazioni dovrebbero rimanere costante durante le diverse condizioni dell'esperimento stesso. Zoom aggiuntivi possono essere applicati se necessario.</li>
		<li>Valutare la profondità dove la colorazione è anche e acquisire la serie di immagini di almeno 8 equidistante (250 nm) aerei. Poi prendere 3 pile adiacenti immagini rappresentative provenienti dalla stessa zona di interesse per fetta. 
		Nota: La profondità può variare da una sezione a altra ma sempre dovrebbe essere circa 2-5 µm dalla superficie della fetta.</li>
		<li>Ripetere l'acquisizione in almeno 3 fette per condizione e da 6-8 animali per gruppo di trattamento.</li>
	</ol></li> <li>Image analysis. 
	Nota: Utilizzare un software di analisi di immagine automatizzato (Vedi la Tabella materiali). Si noti che alcuni sistemi richiedono una licenza, mentre altri sono gratuiti, come ad esempio ImageJ. Il software utilizzato deve analizzare le immagini in 3D tenendo conto di tutti i piani dello stack imaged. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli del software utilizzato nell'analisi di immagine ( Figura 1).
	<ol><li>Uso un protocollo di soglia di intensità abitudine-basata per identificare tutti i puncta sinaptica e indicatori di un neurone, che manualmente sono ottimizzati e selezionati all'interno del software [vedi Tabella materiali per lo specifico software utilizzato in questo protocollo]. 
		Nota: Il software identifica un'intensità minima e massima per ogni fluoroforo e associa una percentuale di intensità per ogni oggetto riconosciuto. Si noti che la percentuale di intensità varierà secondo il fluoroforo utilizzato e l'anticorpo contro il marcatore sinaptico.</li>
		<li>Per marcatori sinaptici, garantire che dimensione filtri (&#62; 0.1 µm 3 e &#60; 0.8µm 3) sono selezionati all'interno del software e applicate all'immagine. Regolare i parametri per garantire che gli oggetti selezionati non sono sovrapposte. Escludere qualsiasi oggetto che sono troppo grandi o troppo piccoli per essere considerati puncta sinaptica (Vedi Figura 2B). 
		Nota: Una volta ottimizzato, gli stessi valori di soglia vengono quindi applicati a tutte le immagini all'interno di un determinato esperimento.</li>
		<li>Quantificare il numero medio, intensità e volume delle singola puncta sinaptica (pre- o post-sinaptico) utilizzando i protocolli ottimizzati soglia selezionati all'interno del software. Normalizzare il numero puncta al volume del campo dell'immagine (all'incirca 16.928 µm 3 nel sistema utilizzato qui). Normalizzare l'intensità puncta sinaptica per l'intensità del marcatore neuronale riferimento. 
		Nota: Le sinapsi sono definite come la co-localizzazione tra marcatori sia pre- che post-sinaptici. Una volta i protocolli di soglia per pre- e post-sinaptico puncta hAve è stato stabilito, il software dovrebbe identificare la co-localizzazione dei puncta sinaptica come la sovrapposizione di 1 pixel o più in un unico piano. 
		Nota: Per l'analisi statistica, confermare di che tutti i set di campioni seguano la normalità e l'omogeneità delle varianze, come determinato da Lilliefords e test χ2, rispettivamente. Campioni che presentano una distribuzione normale e l'omogeneità delle varianze dovrebbero essere analizzati con test parametrici, come descritto di seguito. Ad esempio, puncta sinaptica eccitatoria analisi devono essere eseguita utilizzando un one-way ANOVA con blocco e replica. Ogni singolo esperimento dovrebbe essere considerata come un blocco; in genere esistono tre esperimenti indipendenti, ciascuno con 1-3 topi da ogni condizione.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Figura 1: analisi dei puncta sinaptica utilizzando l'analisi dell'immagine software. (A) Screenshot della personalizzazione di protocollo soglia di intensità. L'esempio fornito è per PSD-95, in cui i puncta selezionato hanno una dimensione definita di &#62; 0,1 µm 3 e &#60; 0,8 µm 3 e presenti oggetti sovrapposti ridotta a icona. Si noti che l'immagine mostrata è per un aereo confocale abilitare la visualizzazione più facile dei puncta sinaptica e selezione dei parametri precisi. (B) Screenshot dell'analisi uscita dal software (dopo la selezione del protocollo ottimizzato). Un esempio di crudo puncta sinaptica numeri misurazioni basate sul volume. Questi valori vengono poi esportati ad un software di foglio di calcolo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Figura 2: controllo di qualità delle impostazioni fetta e parametro per puncta sinaptica. Immagini confocal (A) rappresentative (obiettivo 40x) della regione di interesse: il CA1 strato radiato (sr) e strato oriens (così) di una fetta hippocampal sono identificati dalla macchiatura MAP2. Barra della scala = immagini Confocal di 2 µm. (B) (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde) e PSD-95 (rosso)-da fette hippocampal. Nota l'identificazione dei puncta chiaro pre- e post-sinaptico. Puncta superiore a 0,8 µm 3 sono esclusi dalla quantificazione (frecce bianche). Barra della scala = 2 µm (C) confocale immagini (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde)-dal criostato-taglio sezioni hippocampal dai cervelli intero risolto in PFA. Si noti la presenza di fori grandi e irregolari, ragruppata vGlut1 colorazione. Barra della scala = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La valutazione precisa del numero di sinapsi è essenziale nel campo delle neuroscienze. Qui, indichiamo come valutare la densità delle sinapsi nella regione CA1 strato radiato di fette hippocampal come sistema modello. Singolo-sezione EM10dimostra il significato per quanto riguarda i metodi esistenti nel nostro recente articolo di ricerca sull'effetto della carenza di Wnt nell'ippocampo e dove abbiamo anche valutato il numero di sinapsi. La grandezza di perdita di sinapsi sono simili tra single-sezione EM e la fetta di cervello metodo descritto qui10. Quindi, questa scoperta dimostra l'accuratezza e l'affidabilità della tecnica.
Importante, una limitazione di singolo-sezione EM e di immunostaining sinapsi, come presentato qui, è l'impossibilità di stimare con precisione il numero di sinapsi assoluta per una regione specifica del cervello. Infatti, è importante identificare le modifiche morfologiche globale, quanto le variazioni di volume totale potrebbero influire numero sinaptica. Un'altra limitazione è che alcuni anticorpi sono meno efficienti alle regioni del cervello intatto, parzialmente a causa della estrema densità di connessioni sinaptiche di colorazione. Abbiamo sperimentato la qualità superiore di colorazione di vGlut1 e gephyrin utilizzando questa fetta preparazione e successiva fissazione di PFA per un massimo di 1 h, rispetto alla fissazione immediata dell'intero cervello in PFA (Figura 2). Quest'ultimo ha portato alla macchiatura sinaptica ragruppata, con buchi nel tessuto. Tuttavia, la penetrazione dell'anticorpo di vGlut1 è ancora limitata in entrambi i metodi (un paio di decine di micron). Non ci ha fatto superare questa limitazione, anche con l'anticorpo aumentata incubazione, ma fornendo la penetrazione dell'anticorpo è maggiore la profondità totale che è imaged, non ci dovrebbe essere alcuna influenza sul risultato finale. Inoltre, si dovrebbe prestare particolare attenzione a garantire che la colorazione è anche durante l'intero stack acquisita.
Nel nostro studio, abbiamo voluto distinguere eccitatori da sinapsi inibitorie. Di conseguenza, abbiamo scelto vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, rispettivamente, come queste proteine sono altamente espressi nell'ippocampo del topo adulto e sono specifiche per ogni sinapsi sottotipo4,5. Altri marcatori sinaptiche eccitatorie ed inibitorie avrebbe potuto essere utilizzati per identificare ogni sinapsi rispettivi, come recettori arricchito ad ogni sinapsi, tra cui i recettori NMDA ed AMPA per eccitanti e recettori GABAA per sinapsi inibitorie. Altri neurotrasmettitori o neuromodulatori possono essere identificati anche con il nostro protocollo, assicurando che gli anticorpi specifici sono disponibili, come mostrato per sinapsi dopaminergica nel corpo striato22. Inoltre, riducendo lo spessore di ogni fetta a 120 µm può parzialmente superata la bassa quantità di campioni ottenuti con fettine acute, che è di importanza fondamentale per gli studi nelle strutture del cervello piccolo come l'amigdala.
Applicazioni future del nostro protocollo potrebbero essere attuate nello studio delle diverse aree del cervello e disturbi. Ad esempio, nel corpo striato (una regione del cervello associata con il morbo di Parkinson), una combinazione di vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 potrebbe essere utilizzata per distinguere tra le sinapsi eccitatorie da afferenze provenienti dalla corteccia o talamo, rispettivamente22.
In conclusione, abbiamo indicato un metodo affidabile per esaminare il numero di sinapsi in tessuti cerebrali utilizzando marcatori pre- e post-sinaptici per definire una sinapsi. Fasi critiche prevedono la preparazione di fette hippocampal buone, un tempo di fissazione di fino a 1 h in PFA, l'applicazione di abbastanza liquido di montaggio, l'uso di anticorpi affidabili, le impostazioni di acquisizione immagine appropriata e rilevazione rigorose puncta sinaptica. In definitiva, questo metodo è relativamente veloce ed è facilmente riproducibile da qualsiasi laboratori che hanno accesso ad un microscopio confocale.

Il cervello umano è composto di circa 1014 sinapsi. Numero di sinapsi è strettamente regolato durante lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (CNS). Durante lo sviluppo, il numero di sinapsi è modulata da sinaptogenesi e potatura per formare reti di un neurone funzionali. Apprendimento e memoria sono supportati dal regolamento del numero di sinapsi e forza, un processo conosciuto come potenziamento sinaptico e depressione1. D'importanza, la stabilizzazione delle sinapsi mature è essenziale per il mantenimento di connessioni di rete neuronale. Inoltre, i deficit nella densità sinaptica sono stati segnalati nelle fasi iniziali di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio)2. Pertanto, la capacità di identificare accuratamente e valutare il numero di sinapsi è fondamentale ai fini della valutazione della patologia e fisiologia del cervello.
La massima densità e natura compatta delle sinapsi rendono difficile per stimare il loro numero preciso nelle aree del cervello intatto. Sinapsi chimiche nel SNC sono costituite da due neuroni nell'apposizione vicina, separati da un cleft sinaptico3. Il terminale pre-sinaptica, o bouton sinaptico, emerge da un assone e consiste di vescicole accumulate, che contengono i neurotrasmettitori che definiscono la specificità di una sinapsi — vale a dire, glutammato e acido gamma - aminobutirrico (GABA) per eccitanti e inibitorio sinapsi, rispettivamente. Le membrane delle vescicole contengono vescicolari trasportatori specifici per ogni neurotrasmettitore: trasportatore vescicolare glutammato (vGlut) per il glutammato e il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT) per GABA. Il terminale post-sinaptico è una struttura molto densa composta da diverse proteine, tra cui i recettori, molecole di adesione e proteine impalcatura. In sinapsi eccitatorie, proteina di densità-95 post-sinaptica (PSD-95) è il più abbondante dell'impalcatura proteina4, modulante eccitanti N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e recettore di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) funzione, considerando che gephyrin ancore recettori inibitori al terminale post-sinaptico inibitorio5. Nel complesso, la specificità delle proteine ai compartimenti pre- e post-sinaptici aiuti la differenziazione e identificazione di sottotipi di sinapsi.
La valutazione del numero di sinapsi può essere eseguita con diverse tecniche. Il più comune è l'uso di microscopia elettronica (EM), che consente l'analisi della sinapsi in aree cerebrali compatta e intatta con alto ingrandimento e risoluzione. Tuttavia, questa tecnica è molto costosa, richiede preparazione del campione complicato e richiede molto tempo. Altre tecniche includono l'uso della matrice tomografia6, che ha un grande svantaggio in quanto richiede attrezzature specializzate e costose per eseguire l'analisi. Inoltre, linee transgeniche che esprimono specifici marcatori sinaptici sono utili a valutare la sinapsi numero7, ma la generazione di nuove linee può essere restrittiva e costoso, e la sovraespressione di proteine può causare indesiderato fuori bersaglio fenotipi.
A causa di queste limitazioni e per semplicità, molti ricercatori valutano numero di sinapsi esaminando i livelli della proteina sinaptica totale. Tuttavia, la perdita di sinapsi può essere osservato prima di cambiamenti sostanziali nella proteina, come risultati rimodellamento sinaptici strutturali nella dispersione di apposizione pre- o post-sinaptica, con Nessuna degradazione di proteine sinaptiche. Inoltre, in annuncio, i livelli della proteina sinaptica sono ridotti seguente sinapsi degenerazione o morte di un neurone8,9. La quantificazione dei livelli totali non consente questa distinzione. Così, c'è la necessità di sviluppare un metodo affidabile, accessibile e accurato per la valutazione del numero di sinapsi nel cervello.
In questo articolo, descriviamo come accuratamente identificare e determinare il numero delle sinapsi usando la microscopia di immunofluorescenza nelle fette hippocampal del cervello del roditore. Le sinapsi sono definite dalla colocalizzazione di marker pre- e post-sinaptico che appaiono in una distribuzione punctata. Dimostriamo la validità di questa tecnica attraverso lo studio di Wnt segnalazione nel cervello. WNT sono proteine secrete importanti per la formazione, la eliminazione e la manutenzione delle sinapsi. L'induzione in vivo di un antagonista secreto della cascata della Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), porta alla perdita sinaptica eccitatoria preservando sinapsi inibitorie nell' ippocampo10. Illustriamo l'identificazione e il conteggio delle sinapsi eccitatorie ed inibitorie nelle fette hippocampal da un topo adulto esprimendo Dkk1 ed evidenziare la trasferibilità di questa tecnica ad altri tipi di preparazioni di coltura di tessuti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

Nel cervello, le sinapsi sono specializzate giunzioni tra neuroni, determinare la forza e la diffusione della segnalazione di un neurone. Il numero delle sinapsi è strettamente regolato durante lo sviluppo e la maturazione neuronale. D'importanza, i deficit nel numero di sinapsi possono portare a disfunzione conoscitiva. Pertanto, la valutazione del numero di sinapsi è parte integrante della neurobiologia. Tuttavia, come le sinapsi sono piccole e molto compatto nel cervello intatto, la valutazione del numero assoluto è impegnativa. Questo protocollo descrive un metodo per identificare e valutare le sinapsi nelle fette hippocampal del roditore, usando la microscopia di immunofluorescenza facilmente. Esso comprende una procedura a tre fasi per valutare le sinapsi in immagini di alta qualità di microscopia confocale analizzando la co-localizzazione di proteine pre- e postsinaptici nelle fette hippocampal. Viene inoltre spiegato come l'analisi viene eseguita e dà esempi rappresentativi da sinapsi sia eccitatori che inibitori. Questo protocollo fornisce una solida base per l'analisi delle sinapsi e può essere applicato a qualsiasi ricerca che studia la struttura e la funzione del cervello.

Perdita di sinapsi si presenta presto nella malattie neurodegenerative come l'annuncio e la malattia del Parkinson2,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi deficit rimangono capiti male. Le carenze nella segnalazione Wnt sono state associate AD13,14,15,16,17. WNT sono glicoproteine secrete e svolgono un ruolo essenziale nella formazione della sinapsi e la modulazione della trasmissione sinaptica18,19,20,21. Recentemente, abbiamo identificato Wnt come regolatori chiave di manutenzione sinaptica nel sistema nervoso maturo10,22. Per studiare con precisione l'impatto di segnalazione Wnt su sinapsi nell'ippocampo dei topi geneticamente modificati, abbiamo approfittato di una preparazione di fetta di cervello e microscopia confocale per valutare i cambiamenti nel numero di sinapsi. Abbiamo identificato fette sani in cui la struttura era ben conservato (Figura 2A). Inoltre, la selezione dei puncta sinaptica è stata definita con cura, con l'esclusione di grandi oggetti macchiati probabilmente rappresentano aggregati proteici (Figura 2B). Questo criterio è stato applicato a tutte le immagini, con gli stessi parametri di analisi rigoroso.
Abbiamo usato un sistema di modello transgenico che induce l'espressione dell'antagonista Wnt secreta Dkk1 in adulto di topi (iDkk1) sotto tetraciclina controllano (Vedi la Tabella materiali)10,22. Abbiamo dimostrato che il blocco di segnalazione Wnt nell'ippocampo adulto provoca perdita di sinapsi eccitatoria in particolare della regione CA1 strato radiato (Figura 3). Figura 3A illustra immagini rappresentative confocal di marker pre- e post-sinaptico eccitatorio (vGlut1 e PSD-95, rispettivamente) ha acquisito da fette hippocampal di iDkk1 topi esprimenti Dkk1 per due settimane, così come i rispettivi controlli. Abbiamo analizzato queste immagini utilizzando il software Volocity ed ha dimostrato una riduzione significativa del numero di sinapsi eccitatorie, quantificato mediante la co-localizzazione dei puncta vGlut1 e PSD-95-etichettato nella regione CA1 dell'ippocampo dei topi di iDkk1 che seguono la induzione di Dkk1 per due settimane (Figura 3B, * p &#60; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). Nel CA1 strato radiato, il numero di sinapsi eccitatoria puncta per 1.000 µm3 è stata ridotta da 500 a topi di controllo a 300 in topi iDkk1. Al contrario, espressione di Dkk1 indotta non ha colpito il numero delle sinapsi inibitorie (identificato con la co-localizzazione tra il pre- e post-sinaptico marcatori vGAT e gephyrin, rispettivamente), come mostrato nella Figura 4A-B (p &#62; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo).
D'importanza, abbiamo effettuato un'analisi di potenza statistica per stimare il numero di animali necessari per generare questi risultati robusti e fette appropriato. Utilizzando R, abbiamo calcolato che sono stati necessari circa 35 fette per condizione (animali fette x 6 3 immagini x 3 = 36) per rilevare una dimensione di grande effetto (f = 0,4) con confidenza dell'80% (potenza = 0,8) in un one-way ANOVA con blocco e la replica, come descritto in passaggio 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: perdita di sinapsi eccitatorie nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative dei CA1 strato radiato Visualizza sinapsi eccitatorie, identificati da co-localizzazione tra vGlut1 e PSD-95 (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) la percentuale di sinapsi eccitatorie tra controllo e iDkk1 è stata quantificata utilizzando software menzionati nella Tabella materiali (* p &#60; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: sinapsi inibitorie sono invariate nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative del CA1 strato radiato delle sinapsi inibitorie identificate tramite la co-localizzazione tra vGAT e gephyrin (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) percentuale delle sinapsi inibitorie tra topi di controllo e iDkk1, come quantificato utilizzando il software Volocity (p &#62; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta saccarosio ACSF componenti</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>Note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido chinurenico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido piruvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucosio</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sommersa ACSF componenti</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		
		<tr>
			<td>D-glucosio</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabella 1: Composizione ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blocco/permeabilizing Buffer</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>Note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siero di asino</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% saccarosio</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluire da 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Buffer utilizzati per la macchiatura immunofluorescente.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Views.  University College London. Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Ricerca

Neuroscienze

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...