La plasticità sinaptica a lungo termine, in particolare, il potenziamento a lungo termine e la depressione a lungo termine sono stati ampiamente studiati lungo l'orientamento trasversale dell'ippocampo. È stato anche esaminato lungo l'orientamento longitudinale. Tuttavia, quando si tratta dell'orientamento longitudinale, è stata prestata pochissima attenzione all'asse longitudinale CA1 dell'ippocampo rispetto alla plasticità sinaptica.
Una precedente pubblicazione del nostro laboratorio ha dimostrato che i neuroni piramidali CA1 dell'ippocampo formano connessioni associazioniali che potrebbero supportare la plasticità sinaptica. Per ulteriori informazioni su questo protocollo, si consiglia di fare riferimento alla pubblicazione precedente con il riferimento riportato di seguito. Iniettare uretano per anestetizzare il mouse.
Posizionare il mouse completamente anestetizzato su una pastiglia di riscaldamento impostata su 37 gradi Celsius. Applicare il gel per gli occhi per inumidire gli occhi. Fissare saldamente il cranio del mouse utilizzando il morsetto per gli occhi.
Il morsetto per gli occhi offre la libertà di mobilità per lo sperimentatore durante le procedure chirurgiche. E può essere particolarmente utile anche per gli esperimenti che coinvolgono la corteccia uditivo. Tuttavia, occorre fare molta attenzione per ottenere le coordinate stereotassiche esatte.
Separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli alla fine dell'osso interparietale e occipitale del topo con il bisturi. Asciugare la materia dura con tampone di cotone. Quindi si fora la cisterna magna per drenare il liquido cerebrospinale.
Attaccare un batuffolo di cotone per continuare a drenare il liquido cerebrospinale. Tagliare e rimuovere la pelle sul cuoio capelluto e mantenere asciutta la regione esposta. Contrassegnare i punti corrispondenti alla regione ippocampale usando l'aiuto di una pinza veniyar.
Fai un'incisione nel cranio sopra la regione dorsale dell'ippocampo lungo i punti contrassegnati usando un bisturi o un trapano ad alta velocità mentre osservi al microscopio. Mantenere il tessuto cerebrale esposto umido applicando fisiologicamente salina o un olio inerte. Fissare e posizionare saldamente gli elettrodi di stimolazione e registrazione nel supporto stereotassico.
Regolare gli elettrodi di stimolazione e registrazione sopra l'ippocampo dorsale CA1. Usa il cervello del mouse in coordinata stereotassica come guida per localizzare la coordinata per la regione ippocampale dorsale longitudinale CA1. Per le registrazioni che utilizzano elettrodi multicanale, individuare innanzitutto le coordinate stereotassiche per la regione ippocampale CA1 utilizzando il primo canale.
Posizionare gli elettrodi rimanenti in modo che l'angolo di stimolazione e gli elettrodi di registrazione siano nell'intervallo da 30 gradi a 60 gradi rispetto alla linea mediana dal punto bregma. Questo angolo corrisponde all'orientamento longitudinale della regione ippocampale CA1. Accendere il sistema di registrazione.
Aprire il software neurale per la registrazione e l'acquisizione dei dati. Abbassare lentamente gli elettrodi di registrazione e stimolazione utilizzando il micromanipolatore fino a quando non tocca solo la superficie del cervello. Osserva un aumento dell'impedenza proprio quando l'elettrodo tocca la superficie cerebrale.
Questo può essere osservato nel canale rosso mostrato sullo schermo. Abbassare lentamente gli elettrodi alla profondità approssimativa corrispondente alle coordinate stereotassiche scelte per l'ippocampo CA1. Dare stimolazione fino a quando non si osserva un potenziale eccitatorio post-sinaptico evocato stabile.
Eseguire una curva input-output per rilevare la massima intensità di stimolo. Utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità della linea di base e impostare l'intensità dello stimolo per evocare la stimolazione ad alta frequenza o la stimolazione a bassa frequenza. Registrare il potenziale locale per un'ora dopo la stimolazione ad alta frequenza o la stimolazione a bassa frequenza.
Esportare i dati e analizzare utilizzando il software di scelta. Poveri 400 ml di soluzione di affezione già preparata in un pallone separato e ossigenati per circa 20 minuti. Poveri 200 ml della soluzione di affezione ossigenata.
Coprire in pellicola para e trasferire in un congelatore di 80 gradi per circa 20 minuti per fare una granita. Poveri i restanti 200 ml di soluzione di affettare in una camera di tenuta della fetta cerebrale e tenere in acqua bot di 32 gradi Celsius con gorgogliamento continuo. Esegni la soluzione di affezione refrigerata e povera di circa 50 ml in un bicchiere.
Decapitare il topo anestetizzato. Tagliare la pelle che copre il cranio del topo e tagliare il pezzo del cranio lungo la linea mediana fino all'osso occipitale. Apri il cranio con le forcep smussate.
Raccogliere delicatamente il cervello con una spatola e posizionare nella soluzione di affettamento refrigerata nel becher. Separare i due emisferi cerebrali lungo la linea mediana con una lama bisturi. Isolare l'ippocampo staccandolo delicatamente dalla corteccia con una spatola.
Ritaglia l'estremità setto e temporale dell'ippocampo isolato. Applicare una piccola quantità di colla sulla piastra di affettamento. Per una fetta ippocampale CA1 longitudinale, attaccare la regione CA3 dell'ippocampo alla piastra di affettare con la colla.
Per la fetta trasversale, che fungerà da controllo, attaccare l'estremità ventrale dell'ippocampo alla piastra di affettare del vibratoma. Mettilo nella camera di affezione. Impostare i parametri del vibratomo.
Affettare l'ippocampo attaccato con il vibratoma. Una buona fetta longitudinale del cervello ippocampale CA1 avrà uno strato di CA1 e due strati di giro dentato. Inoltre, saranno presenti gli oriens dello strato e il radiorato di strato della regione CA1.
In alternativa, una fetta cerebrale ippocampale trasversale avrà le regioni dentate di giro CA3 e CA1 in tatto. Trasferire le fette cerebrali nella camera di tenuta della fetta cerebrale nel bot dell'acqua. Incubare per 20 minuti a una temperatura di 32 gradi Celsius e portare a temperatura ambiente per il recupero.
Sovrasfondere continuamente il servo ACS nella camera di registrazione alla velocità di 2 ml al minuto. Trasferire la fetta cerebrale nella camera di registrazione, regolare la posizione della fetta cerebrale con le forcep smussate e tenerla in posizione con un hap. Attivare il software per l'acquisizione dei dati.
Fetta cerebrale longitudinale. Per le fette longitudinali, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nello strato oriens. Posizionare l'elettrodo di stimolazione sul lato setto o temporale della fetta cerebrale con la registrazione dallo stesso strato.
In alternativa, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nel radiorato dello strato, posizionare l'elettrodo di stimolazione nel lato setto o temporale della fetta cerebrale. Per le fette trasversali come controllo, posizionare l'elettrodo di stimolazione sulla regione del percorso collaterale CA3 Schaffer e l'elettrodo di registrazione sulla regione CA1. Accendere il generatore di stimolo isolatore e dare stimolazione.
Regolare la profondità dell'elettrodo di registrazione fino a quando non si osserva un potenziale eccitatorio post-sinaptico stabile. Eseguire una curva input-output per rilevare la massima intensità di stimolo. Utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità di stimolo per la registrazione di base che evoca stimolazione ad alta frequenza o stimolazione a bassa frequenza.
Fare riferimento al PDF allegato per i parametri che inducono il potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine. Il potenziale eccitatorio post-sinaptico evocato è aumentato in risposta alla stimolazione ad alta frequenza in vivo. Ciò dimostra che l'ippocampale longitudinale CA1 supporta il potenziamento a lungo termine.
Per le fette cerebrali longitudinali di CA1 ippocampali, è stato osservato un aumento della risposta alla stimolazione ad alta frequenza sia sul lato setto che temporale degli oriens dello strato e del radiato di strato. Ciò dimostra che la plasticità sinaptica indotta lungo la regione longitudinale dell'ippocampo CA1 non è lineare o specifica della direzione. Utilizzando protocolli già stabiliti per la depressione a lungo termine, nessuna depressione a lungo termine è stata indotta sia in vivo che in vitro.
Come conclusione, vi abbiamo mostrato come indagare la plasticità sinaptica a lungo termine nella regione longitudinale dell'ippocampo CA1 sia in vivo che in vitro. Maggiori dettagli del protocollo sono disponibili nel PDF che accompagna questo video per aiutarti a indagare la plasticità sinaptica a lungo termine lungo la regione longitudinale dell'ippocampale CA1 nei tuoi laboratori.
