Ringraziamo Osman Kaftanoglu per utili consigli e assistenza durante le riprese. Vorremmo ringraziare i revisori anonimi per i commenti penetranti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio norvegese della ricerca (concede 180.504, 191.699 e 213.976), Marie Curie/FP7 (progetto rif. 238665), il National Institute on Aging (NIA concessione P01 AG22500), e Pew Charitable Trusts.

1. Il disaccoppiamento senescenza da cronologico Età Questa sezione descrive la configurazione delle colonie doppie di coorte, che consistono in una coorte di individui identificati che condividono la stessa età cronologica (&quot;coorte di età single&quot;), e un gruppo di api nido. Stesse individui di età della coorte singolo età alla fine si separano in diversi operai tipi con diverse dinamiche di invecchiamento - queste sono le api infermiere con le api rallentato e falciatrici con il declino funzionale accelerato. Tutte le procedure sono descritte per una colonia sperimentale. Si consiglia, comunque, di effettuare esperimenti per almeno due colonia di replica in modo che gli effetti colonie possono essere controllati per (due-replica-design). <ol><li> Preparazione caselle dell&#39;alveare per le colonie doppia coorte: Preparare una scatola normale alveare che riceve due pettini alimentari con miele, un altro pettine cibo con polline e due pettini vuote. Assicurarsi di individuare una regina accoppiata così come colonia donatore con più di 3.000api nido. Entrambi saranno introdotti più tardi (1.3). </li><li> Ottenere e marcatura individui con età cronologica simile: raccogliere favi di covata sigillato che sta per emergere. Per una replica aspettare di raccogliere pettini con un totale di 3.000-5.000 celle di covata innevate. Per ogni replica utilizzare una quantità equilibrata di covata da almeno tre fonti diverse alveare per evitare distribuzioni asimmetriche di genotipi materni (origine alveare). <ol><li> Mettere favi di covata in un incubatore a 34 ° C con il 60-70% di umidità relativa. Assicurati di memorizzare pettini in modo tale che covata emergente non può sfuggire. </li><li> Lasciate le api emergono per due giorni e segnare queste api con una piccola etichetta vernice sul torace (ad esempio Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). Il marchio di vernice consentirà identificare le api della coorte di età singolo (giorno della nascita), e per distinguerle dalle altre colonie replicate. </li></ol></li><li> Impostazione di una doppia colonia di coorte, che comprende la coorte di identified, api età singoli: Il giorno giovani api sono stati contrassegnati, raccolgono circa 2.500-3.000 nido api da una colonia donatore (cfr. la sezione 1 in discussione.), e aggiungere queste api non marcati alla casella di alveare che è stato preparato in precedenza (cfr. punto 1.1). Le ultime persone costituiranno il non identificato nido ape coorte. <ol><li> Aggiungere la regina, che sarà inizialmente limitata ad una gabbia regina (disponibile in commercio). Sigillare la gabbia con la caramella commestibile (ad esempio Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Germania) per rendere api operaie rilasciano lentamente la regina. </li><li> Aggiungere le api recentemente emerse e segnalate, che costituiranno la coorte singolo età. Queste api sono gli individui solo segnalati, e sono il focus group per tutti i seguenti passaggi. </li></ol></li><li> Monitoraggio foraggiamento insorgenza e marcatura falciatrici: Per valutare l&#39;insorgenza e la dinamica della transizione infermiere-raccoglitore nella coorte singolo dell&#39;età, monitorare lo sviluppo demografico delle attività di foraggiamento emolto altro giorno per ogni colonia. Inizia a contare cinque giorni dopo le colonie sono stati istituiti (Figura 1). <ol><li> Contare il numero totale delle api bottinatrici di ritorno da voli (conteggi ingresso) nel raggio di 3 x 20 min periodi di osservazione in orari stabiliti. Assicuratevi di non contare le api durante i periodi di voli di orientamento (vedi discussione). </li><li> Quando conta ingresso indicano una notevole attività di foraggiamento per iniziare (&gt; 100 conteggi ingresso / giorno), inizio marcatura raccoglitori. Per farlo, raccoglitori della coorte di età singolo (singoli individui segnalati) ricevono un secondo segno di vernice al ritorno dai loro primi voli di foraggiamento. Questo marchio vernice specificare il giorno di foraggiamento esordio, e permetterà di identificare più tardi all&#39;età di foraggiamento per ogni raccoglitore. </li><li> Ripetere le marcature al giorno fino a quando è stato segnato un numero sufficiente di api. Per stimare un numero sufficiente di raccoglitori marcati, si aspettano un tasso di recupero non superiore al 5-10% dopo queste api erano stati invecchiati, in genere dopo 14 giorni diforaggiamento. </li></ol></li><li> Campionamento: Poiché tutte le api inizialmente indicate con un età cronologica simile, gruppi di pari età di infermieri e vecchi raccoglitori possono essere raccolti simultaneamente, quando raccoglitori hanno foraged per ≥ 14 giorni. <ol><li> Singole api nutrici segnalati sono raccolti all&#39;interno dell&#39;alveare, e sono identificati da un comportamento di cura (alimentazione e pulizia delle larve con teste di mettere giù in celle di covata aperte). </li><li> Bottinatrici doppi marcati sono raccolti anche all&#39;interno dell&#39;alveare prima dell&#39;inizio attività quotidiana di foraggiamento. </li><li> Raccogliere le api in gabbie (tubi, scatole) che forniscono una sufficiente ventilazione, e tenere buio fino ulteriore elaborazione. In alternativa, per trascrittomica, epigenetico o studi di proteomica, scatto direttamente api congelamento in azoto liquido. Raccogliere un numero equilibrato di persone provenienti da tutti i gruppi di test e replicare colonie. </li></ol></li></ol> 2. Storno Lavoratori con Rapid per i lavoratori con l&#39;invecchiamento rallentato da Modifica del Hive Demografia &lt;/ P&gt; Questa sezione spiega come viene effettuata l&#39;inversione di lavoratori con invecchiamento accelerato (bottinatrici) per i lavoratori con l&#39;invecchiamento rallentato (api nutrici). Tale inversione comportamentale è indotta, quando raccoglitori sperimentano la mancanza di api nutrici, che normalmente impegnano nella cura covata. La procedura di reversione separerà una singola colonia replicare in due arnie: un alveare con la frazione infermiera ape (&quot;nurse-derivato&quot;), e un altro con la frazione raccoglitore (&quot;raccoglitore di derivazione&quot;). Dopo l&#39;inversione di successo, possibili sintomi di plastica e invertito l&#39;invecchiamento possono essere studiate della coorte di età unico con i lavoratori ritornati, bottinatrici continui, continui api nutrici e raccoglitori di nuova assunzione. Come prima, le api identificati della fascia di età unica, non la coorte di api nido non identificati, costituiscono il focus group sperimentale. <ol><li> Preparazione: Replicare alveari con infermieri (singolo segnato) e raccoglitori (doppia segnato) siano messi a disposizione, come descritto nella sezione precedente. Assicuratevi di non cominciare ritorno con meno di 500 segnati raccoglitori per replica colonia per garantire il recupero sufficiente dopo l&#39;inversione è stata completata. <ol><li> Per l&#39;identificazione sicura dei gruppi di test dopo l&#39;inversione è fondamentale che l&#39;intera popolazione raccoglitore nell&#39;alveare originale è stata segnata prima di ritorno. La seguente procedura è descritta per una replica. </li><li> Il giorno prima di reversione, preparare una scatola aggiuntiva alveare per l&#39;alveare raccoglitore di derivazione (vedere il punto 1.1). Individuare due regine e due favi di covata da alveari donatori. Prima del trasferimento alle colonie sperimentali spazzare via tutte le api adulte da questi pettini. Una regina in gabbia (vedi punto 1.3) e una covata pettine sostituiranno regina e covata pettini nella scatola alveare originale. L&#39;altra serie di regina e covata pettine verrà utilizzato il giorno successivo per la nuova casella alveare. Attribuzione simili di nuovi favi di covata e regine aliene per entrambi, l&#39;originale e il nuovo alveare si consiglia di assicurarsi che raccoglitori separati ed infermieras sarà ugualmente un&#39;esperienza cambiato spunti dell&#39;alveare (&quot;odore alveare&quot;). </li></ol></li><li> Reversion: Al mattino, poco prima della reversione, aggiungere la regina in gabbia e il pettine covata per la nuova casella che riceverà la frazione raccoglitore di derivazione. Attendere fino a quando inizia l&#39;ora di punta foraggiamento. Quindi spostare la colonia originale con bottinatrici segnalati e api nutrici almeno 100 metri di distanza dalla posizione originale. <ol><li> Alla posizione originale, impostare la nuova casella per l&#39;alveare raccoglitore di derivazione con covata e unica regina. </li><li> Raccoglitori potranno lasciare la casella alveare originale lussata, e tornate alla posizione originale. Consentire bottinatrici per tornare alla posizione originale per 2 ore al fine di raggiungere il prossimo per completare la separazione della popolazione raccoglitore dalle api nido. </li><li> Poi, di interrompere la separazione, chiudere l&#39;originale, ora &quot;nurse-derivato&quot; alveare, e trasferirlo in un apiario di almeno 3 km di distanza. </li></ol></li><li> Manutenzione Hive e monitoraggio per il successo della missione socialeinversione: Controllare gli alveari sperimentali regolarmente per un sano, covata aperta. <ol><li> Durante i primi giorni dopo la manipolazione colonia sostituire covata incustodito e morti per ridurre il carico potenziale patogeno. </li><li> Per convalidare l&#39;inversione di successo all&#39;interno dell&#39;alveare forager-derivato, scattare foto di favi di covata prima della loro introduzione, e di nuovo quando pettini vengono sostituiti o quando l&#39;esperimento reversione è completato (Figura 2). Le aree con covata precedentemente ridotti e con aperta, covata dal vivo sono indicatori affidabili di attività infermieristica in colonie falciatrici-derivati. </li></ol></li><li> Campionamento: Effetti fisiologici che accompagnano l&#39;inversione sociale possono essere rilevati 3-8 giorni dopo bottinatrici e infermieri sono stati separati. <ol><li> Consigliamo campionamento tutti i gruppi di test, vale a dire i lavoratori ritornati e raccoglitori corrente (alveare raccoglitore-derivati), così come gli infermieri continuative e raccoglitori di nuova assunzione (alveare infermiere-derivato) 8 giorni dopo è iniziata l&#39;inversione. </li><li> Colcampioni del SELECT come descritto al punto 1.5. </li></ol></li></ol> 3. Analizzando operaio-tipo modelli specifici senescenza cellulare da Quantificazione del Lipofuscina Lipofuscina è un biomarcatore universale di senescenza cellulare. Come prodotto accumulo intrinseca, autofluorescenza specifico di lipofuscina (emissione max = 530-650 nm) può essere utilizzato per il rilevamento 18. <ol><li> Dissezione e fissazione: api Raffreddare su ghiaccio, fino immobili; rimuovere e sezionare il campione di tessuto desiderato. <ol><li> Trasferire in fissativo (paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS, pH 7,2) per incubazione overnight a 4 ° C. </li><li> Lavare i campioni 3 volte in PBS. </li></ol></li><li> Processazione dei tessuti e il montaggio: Tagliare campioni di tessuto in sezioni con non più di 40 micron di spessore, ad esempio utilizzando un microtomo lama vibrante, ad esempio Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Germania). <ol><li&gt; Per compensazione, incubare sezioni di tessuto durante la notte nel 30% glicerolo (PBS), e un altro 2 ore nel 50% glicerolo (PBS). </li><li> Montare sezioni su vetrini microscopici in 50% glicerolo (PBS). Per la guarnizione conservazione a lungo termine di copertura scivola con lo smalto. </li></ol></li><li> Acquisizione delle immagini: Per rilevare lipofuscina, si consiglia di utilizzare un microscopio confocale a scansione laser che fornisce le linee laser con λ = 514, 561nm o simili per l&#39;eccitazione, e con la banda rilevatore mettemmo a 570-650 nm. <ol><li> Per una migliore identificazione di lipofuscina, includere un secondo canale, e fare una scansione simultanea di spettri d&#39;onda più corta (di eccitazione = 405 nm, emissione = 410-450 nm). Il canale lunghezza d&#39;onda rivelerà entrambi, lipofuscina granulare, ma anche non specifico &quot;background&quot; a causa della trachea autofluorescenti e altre strutture non granulari. Il secondo, il canale di lunghezza d&#39;onda più corta solo rivelerà autofluorescenza non specifico, ma non lipofuscina. Così, l&#39;identificazione lipofuscina può essere faci<html> tated confrontando i segnali in entrambi i canali, con uno solo di essi rivelando i granuli di lipofuscina fluorescenza specifica. </li><li> Per l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione utilizza un obiettivo con ingrandimento 40X o superiore, e preferibilmente una apertura numerica di 1.25 o superiore. Immagine Scan pile con dimensioni di circa 100 x 100 x 10 micron 3. Ogni singolo campione e il tessuto deve essere rappresentato da più stack di immagine. </li><li> Per ridurre la variabilità intra-individuale e inter-individuale causato dalla variazione tecnica, tenere sempre la potenza del laser e costante sensibilità del rivelatore. </li><li> Per ridurre i pregiudizi da giorno per giorno varianti tecniche scansione numero di campioni pari di tutti i gruppi di test in ciascuna delle diverse sessioni di scansione. </li></ol></li><li> Elaborazione delle immagini: utilizzare pacchetti software con moduli che consentono l&#39;elaborazione avanzata di stack di immagini microscopiche, ad esempio ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / IJ / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Generare una sporgenza massima 2D per ciascuna delle pile di immagini 3D. </li><li> Applicare un filtro Gauss con una dimensione modesta kernel per attenuare il rumore ad alta frequenza, e di preservare le strutture con dimensioni di granuli di lipofuscina. </li><li> Unire entrambi i canali dei colori per facilitare l&#39;identificazione della lipofuscina (vedi punto 3.2). </li></ol></li><li> Analisi Image: Assicurarsi che il soggetto di eseguire le operazioni di quantificazione sarà cieco per verificare l&#39;identità del gruppo. <ol><li> Per tutte le immagini, prima di scegliere una regione di interesse (ROI) che copre le strutture competenti, e ha dimensioni simili a quelle del ROI da altre immagini. </li><li> Quindi selezionare il numero desiderato di granuli di lipofuscina che rappresentano ogni ROI. Quando si seleziona granuli di lipofuscina all&#39;interno di una ROI, l&#39;applicazione delle seguenti regole ridurrà parzialità soggettiva. <ol><li> Scegliere una posizione coerente per la selezione del primo GranuLe. Questo può essere, per esempio, il bordo più a sinistra di una ROI, e il granulo che è più vicino al bordo sarà sempre la prima selezione. </li><li> Uno dopo l&#39;altro, granuli sono scelti, che sono più vicini alla selezione precedente (vicino di casa). </li><li> Quando si sceglie il vicino, muoversi solo in una direzione, ad esempio, solo la ricerca di destro dalla selezione precedente. Questa regola impedisce che la selezione è dominato da gruppi occasionali di granuli densamente. </li><li> Quando la selezione è completata, valutare la dimensione di ogni particella lipofuscina delineando e misurando la rispettiva area granulo. Utilizzare appropriati test statistici per confrontare individui dei diversi gruppi sperimentali. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Noi adottiamo qui descritto in precedenza si avvicina 8,16,17,19,20, e integrarli in un unico flusso di lavoro che faciliterà lo studio dell&#39;invecchiamento flessibile di api mellifere. Il nostro obiettivo è quello di fornire agli scienziati che sono alle prime armi in questo campo con uno strumento standardizzato di avere materiale campione significativo, e per migliorare la riproducibilità sperimentale tra i diversi gruppi di ricerca. Mentre le nostre procedure sono semplificate e non richiedono attre...

Le strutture complesse colonia di animali altamente sociali sono mantenuti attraverso l&#39;interazione di una casta riproduttiva e una casta aiutante di tipicamente lavoratori non per la riproduzione di diversi comportamenti di attività sociale. Nei diversi lavoratori, specifici adattamenti fisiologici consentono comportamenti di cura sib distinte, e sono anche legate alle differenze di durata della vita estreme. Le api da miele e ratti talpa rappresentano i modelli animali più sviluppati per studiare come socialità è legata a modelli di accelerazione, trascurabile o invertita invecchiamento 1-3. Nelle colonie api, una regina sola deposizione delle uova è assistita da migliaia di lavoratori che tendono la covata, foraggio per il cibo, e di impegnarsi in guardia, termoregolazione o comportamenti di igiene 4. Tra questi lavoratori sono estremamente breve durata bottinatrici, api nutrici con rialzato, e in inverno (diutinus) api con durata di vita più lunga. Individui, tuttavia, non sono legati in via permanente un certo worker-tipo, ma visualizzare un ontogenesi comportamentale flessibile: cambiano da un comportamento missione sociale ad un altro (&quot;caste temporali&quot;). Api Callow possono cambiare a covata tendente api nutrici, che alla fine può cambiare foraggiamento di fuori. Tuttavia, le api imberbe nido possono anche trasformarsi in api invernali più longevi e raccoglitori di breve durata può anche tornare in infermieri in genere più longeve. Lavoratori con estrema (le api invernali) ed intermedio (api nutrici) durata della vita sono ben sviluppati di produzione e stoccaggio di alimenti organi con le risorse abbondanti - al contrario di raccoglitori di breve durata (recensiti 1,5). Tuttavia, che il regolamento di vita individuale va al di là dei semplici cambiamenti nel bilanciamento delle risorse di un individuo è suggerito da una ricerca su una proteina tuorlo, che ha diverse funzioni adattate nel non-riproduzione lavoratore casta, come la produzione di gelatina 6, controllo ormonale 7, immune 8 e antiossidante difesa 9. Modelli di fdeclino unzion (senescenza) disparità specchio durata della vita tra i lavoratori, come stabilito per olfattivo, e anche per altri cerebrali funzioni di motore o 10-13. In particolare, il significativo declino della funzione di apprendimento dopo solo due settimane di foraggiamento corrisponde a una progressione di mortalità simile a bottinatrici 14, in contrasto con la mancanza di declino rilevabile (senescenza trascurabile) in api lunga durata invernali 15. Per identificare le impronte molecolari dell&#39;invecchiamento flessibile abbiamo adattato paradigmi sperimentali consolidati che consentono di monitorare e manipolare l&#39;invecchiamento di tipo transizioni 8,16,17. Esperimento 1 dettagli su come ottenere campioni in cui gli effetti dell&#39;età cronologica e lavoratore-tipo specifici comportamenti sociali in materia di invecchiamento possono essere separati. Esperimento 2 descrive l&#39;inversione di raccoglitori con accelerati in api nutrici con dinamiche di invecchiamento rallentato. Esperimento 3 fornisce un approccio per sondare gli effetti della senescenza cellulare da parte anatomical quantificazione di un biomarcatore stabilito per l&#39;invecchiamento cellulare (lipofuscina) 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apifonda</td>
 <td>S&uuml;dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>phosphate-buffered saline</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.04094.1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

obtaining specimens with slowed, accelerated and reversed aging in the honey bee model

Società di animali altamente sociali presentano grandi differenze di durata della vita tra gli individui strettamente correlati. Tra gli insetti sociali, l&#39;ape è il miglior modello istituito per studiare come la plasticità della durata della vita e l&#39;invecchiamento è spiegata da fattori sociali. La casta dei lavoratori delle api mellifere comprende api nutrici, che tendono la covata, e bottinatrici, che raccolgono il nettare e polline. Il lavoro precedente ha dimostrato che le funzioni cerebrali e le prestazioni di volo senesce più rapidamente in bottinatrici che in infermieri. Tuttavia, le funzioni cerebrali possono recuperare, quando bottinatrici tornano a compiti di cura. Tali modelli di senescenza accelerata funzionale e rovesciato sono legati al mutamento livelli di risorse metaboliche, alterazioni proteina abbondanza e funzione immunitaria. Vitellogenina, una proteina tuorlo con funzioni adatte a controllo ormonale e difesa cellulare, può servire come un importante elemento regolatore in una rete che controlla le diverse dinamiche di invecchiamento nei lavoratori. Qui si descrive come l&#39;emergere di infermieri e raccoglitori possono essere monitorati, e manipolato, compresa l&#39;inversione di raccoglitori in genere di breve durata in infermieri più longevo. I nostri risultati rappresentativi mostrano come gli individui con età cronologica simili si differenziano in bottinatrici e le api nutrici in condizioni sperimentali. Noi rappresentiamo come inversione comportamentale da bottinatrici torna agli infermieri può essere convalidato. Infine, mostriamo come i diversi senescenza cellulare può essere valutata misurando l&#39;accumulo di lipofuscina, un biomarcatore universale della senescenza. Per studiare i meccanismi che possono collegare influenze sociali e l&#39;invecchiamento plasticità, questo protocollo fornisce uno strumento standardizzato di acquisire materiale campione significativo, e di migliorare la comparabilità dei dati tra gli studi futuri.

Sezioni 1 e 2 del protocollo dettaglio come gruppi di prova possono essere ottenuti per studiare attributi di accelerazione, rallentato e invertito invecchiamento in colonie con un unico gruppo di età. Per monitorare lavoratore-tipo di differenziazione che accompagna l&#39;ontogenesi normale abbiamo valutato conta falciatrici (&quot;conta ingresso&quot;) per 6 colonie (Figura 1, confronta sezione 1). I grafici mostrano che il cambiamento considerevole dal infermiera allo stato raccoglitore non è in ge...

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Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

In lavoratori api, l&#39;invecchiamento dipende comportamenti sociali piuttosto che su età cronologica. Qui vi mostriamo come operaio-tipo con modelli molto diversi di invecchiamento possono essere ottenuti e analizzati per senescenza cellulare.

Ottenere campioni con rallentato, accelerato e invertito l&#39;invecchiamento in Honey Bee Modello

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Norwegian University of Life Sciences.  In lavoratori api, l'invecchiamento dipende comportamenti sociali piuttosto che su età cronologica. Qui vi mostriamo come operaio-tipo con modelli molto diversi di invecchiamento possono essere ottenuti e analizzati per senescenza cellulare. 

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In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Ricerca

Biologia

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissezione e di osservazione di Honey Bee dorsale della nave per gli studi della funzione cardiaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Una trappola per polline stampata in 3D per gli ingressi dell'alveare di Bombble Bee(Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Raccolta e identificazione del polline dalle colonie di api da miele

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...