Questa ricerca è stata sostenuta da un finanziamento dal NIH NCRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti (J Trumble PI; BH Smith co-PI) e Arizona State University. I finanziamenti per il workshop di formare gli studenti (dati in figura 4) è stata fornita dalla fondazione scienza del Cile.

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Questo protocollo presentato due metodi affidabili per condizionare utilizzando la procedura PER. Questi sono due dei numerosi metodi che sono stati impiegati con successo 27, 21. Metodo 2 Ci avvaliamo per tutti gli studi sperimentali che utilizzano PER come è sempre affidabile, anche attraverso diversi sperimentatori. La stessa procedura di base è stato adattato a diversi tipi di studi con api da miele, compreso l&#39;uso di diversi stimoli condizionamento e diversi riflessi comportamentali. E &#39;stato anche legato alle indagini della base genetica delle differenze nell&#39;apprendimento 28,29, i correlati fisiologici della percezione olfattiva e della memoria nel cervello 13,14,30, e le modulatori e molecolari basi genetiche del comportamento 15,16,31 . A causa della conoscenza avanzata della rilevanza ecologica di apprendimento olfattivo alle api, che è iniziato con i primi studi di Karl von Frisch più di 100 anni fa <sup&gt; 31, i risultati di AL può essere facilmente collegato ad esigenze di sopravvivenza di una colonia. Più di recente, è stato adattato ad uno studio agricolo per studiare gli effetti subletali comportamentali di pesticidi e tossine ambientali 17. La procedura di base è potente nel senso che può essere applicato ad analizzare i problemi in altre specie. Due specie di falena, Manduca Sexta e Spodoptera littoralis, sono stati utilizzati in studi PER indagare le basi neurali di identificazione odore e capacità di apprendimento olfattivo &#39;ogni specie 32,33. PER esperimenti con i moscerini della frutta hanno fornito molte intuizioni sulle cascate di segnalazione molecolari coinvolti nella chemosensation e di apprendimento 34. E PER è stato recentemente utilizzato per studiare assuefazione alla pulce (Rhodnius prolixus) 35, un importante vettore di malattia. In generale, la procedura è robusto a variazioni nel metodo; l&#39;uso di dmetodi ifferent probabilmente produrrà la stessa differenza relativa tra i gruppi di trattamento. Nonostante la procedura relativamente semplice, diversi problemi possono a volte impedire alle api mellifere di imparare l&#39;associazione odore-saccarosio. I seguenti argomenti sono possibili modifiche al protocollo e alcuni dei problemi più comuni che possono insorgere durante PER condizionata. Considerazioni sul numero e tipo di prove nel protocollo condizionata Qualsiasi protocollo apprendimento richiederà l&#39;esposizione delle api a una serie di prove in fase di acquisizione. Questo numero dipende in gran parte la difficoltà del compito. Api del miele possono imparare un compito semplice dopo un singolo processo, ma hanno bisogno di almeno tre prove per indurre la formazione della memoria a lungo termine. Come previsto, le api mellifere richiederanno significativamente maggiore di prove per imparare adeguatamente un compito difficile. Generalmente, vi è un numero massimo di prove dalla quale le api non migliorano significativamente l&#39;prestazioni ir. Questa massima dipende dal compito specifico, i tipi di odori e concentrazioni, e la concentrazione di saccarosio. Quando si utilizza più di un tipo di prova con diversi odori, presentare i diversi tipi di prova in una sequenza pseudocasuale di mantenere le api da memorizzare una semplice sequenza di presentazioni odore invece di imparare le differenze tra gli odori 36. In queste sequenze pseudocasuali, ci deve essere un numero uguale di prove per ciascun tipo di odore. Inoltre, la probabilità di un processo di tipo odore preceduta da e seguito dallo stesso odore, o qualsiasi altri odori, deve essere uguale per tutti gli odori. Per due odori - A e B - utilizzare la seguente sequenza: ABBABAAB. Negli otto studi ogni odore è presentato quattro volte. Concatenare sequenze identiche per raggiungere il numero desiderato di prove per ciascun odore. Indipendentemente dal disegno sperimentale, ci sono alcuni parametri che devono rimanerecostante al fine di ottimizzare l&#39;apprendimento. La sovrapposizione tra il CS e gli Stati Uniti è fondamentale per il condizionamento efficace. L&#39;intervallo inter-trial (Figura 1, Tabella 1) deve essere costante e di essere ottimizzato per irregolarità o un intervallo inter-trial troppo corti o troppo lunghi possono influenzare in modo significativo l&#39;efficacia del protocollo di condizionamento 1. Considerazioni sull&#39;importanza e Progettazione di Trials test comportamentali Risposte registrati durante la &#39;fase di acquisizione&#39; di un esperimento, quando il CS e gli Stati Uniti sono presentati insieme, possono essere utili. Tuttavia, fate attenzione che le condizioni di presentazione odore possono variare da un tipo di prova per un altro. Durante le prove rinforzati, l&#39;odore seguita da saccarosio è presentato in combinazione con uno stimolo visivo (movimento del dispositivo per l&#39;erogazione della gocciolina saccarosio) che possono influenzare la risposta del ape. E le api hanno solo tre secondis per mostrare una risposta (quattro secondi di stimolazione odore meno quello sec sovrapposizione con la presentazione di saccarosio; Figura 1). Se l&#39;esperimento coinvolge le api imparano a differenziare i due odori (ad esempio, armato e non armato), l&#39;odore non rinforzato presentato sulla sperimentazione alternativi avviene senza lo stimolo visivo della presentazione ricompensa e le api hanno i ben quattro secondi per rispondere. Pertanto, le risposte alle due odori non sono pienamente comparabili durante l&#39;acquisizione. Con qualsiasi protocollo condizionata, non fare affidamento esclusivamente sulle curve di acquisizione 1. Per verificare meglio ciò che le api hanno imparato, introdurre una serie di prove di laboratorio, non armato, durante il quale né l&#39;odore è rinforzata, che assicura che i test di tutti gli stimoli si svolge in condizioni identiche. A seconda dello scopo specifico della sperimentazione, collaudo può essere costituita da prove di laboratorio singole odore condizionato o una serie di prove con il od condizionatao o una combinazione delle odori condizionati e nuovi. Uno studio singolo test dell&#39;odore condizionato fornisce un semplice test se ricordano le api l&#39;odore condizionata. Tuttavia, la risposta al primo test di prova può riflettere livello di motivazione delle api e il loro richiamo dell&#39;odore condizionato. Una serie di prove di laboratorio, sia una serie di prove di estinzione degli odori condizionata o una serie di singoli test del condizionato e uno o più nuovi odori, può anche essere utilizzato per valutare la memoria. La serie di prove di estinzione in grado di valutare quanto fortemente ricordano le api l&#39;associazione condizionato. Più forte è il richiamo del maggior numero di prove necessarie per estinguere la risposta condizionata. Una serie di singole prove di odori condizionati e nuovi può anche valutare la specificità memoria delle api dell&#39;odore condizionato. E &#39;inoltre indispensabile per condizionare e testare sia il controllo e gruppi trattati presso gli stessi punti temporali. Comparzione le prestazioni di api subito dopo condizionamento per le api detenuti per periodi di tempo più lunghi è problematico a causa della esposizione al saccarosio Uniti alimentando le api a sazietà. Ad esempio, un calo di prestazioni dopo lunghi intervalli di tempo potrebbe essere causa di memoria degrado o potrebbe essere dovuto a cambiamenti di stato motivazionale e / o apprendimento indotti dall&#39;esposizione rinforzato negli Stati Uniti, rendendo i risultati ambigui. Pertanto, le prestazioni di un gruppo di trattamento deve sempre essere giudicato rispetto a un gruppo di controllo condizionato e testato negli stessi punti temporali. Odore Concentrazione e Integrità Ci sono diversi modi in cui la concentrazione e l&#39;integrità del odore (CS) può essere compromessa. Il problema più diffuso con la consegna odore è l&#39;esaurimento delle cartucce di odori da un uso eccessivo (Figura 2). Sostituire le cartucce 10-12 usi (ogni 2 o 3 prove con gruppi di 5 api da miele) per evitare questa trappola. E &#39;inoltre fondamentale utilizzarecartucce freschi per prove di laboratorio, dal momento che le cartucce usate possono essere differenzialmente esauriti e quindi presenti stimoli odore ineguali. Un altro problema comune è la contaminazione cartuccia odore dovuto utilizzare la cartuccia per più di un odore completamente senza pulirlo. Un flusso d&#39;aria sporca o contaminata può anche involontariamente introdurre stimolo olfattivo aggiuntivo (filtri a carboni attivi possono prevenire contaminazione di fondo). Ciò è particolarmente problematico quando l&#39;accoppiamento PER condizionata con misure delle risposte fisiologiche l&#39;odore. Cartucce odore Leaky presentano un problema dal momento che le api da miele sono esposti agli odori prima del processo inizia, che riduce la salienza dello stimolo odore. Raccordo allentato la fornitura d&#39;aria per la consegna odore può causare poca o nessuna consegna odore quando si apre la valvola, riducendo artificialmente la risposta delle api per l&#39;odore previsto. Soluzione di saccarosio e stimolo incondizionato (Reward) L&#39;amonte, la concentrazione, e l&#39;integrità della soluzione di saccarosio utilizzato come gli Stati Uniti sono vitali per il successo dell&#39;esperimento. Il condizionamento è una funzione della quantità e concentrazione di soluzione di saccarosio-acqua usata come gli Stati Uniti 37. Le siringhe micrometriche utilizzati nel metodo 2 permettono un controllo molto preciso (fino a 0,2 ml) di consegna Stati Uniti, e si consiglia loro di utilizzare per entrambi i metodi descritti. L&#39;uso dei stuzzicadenti (metodo 1) è adeguato per le circostanze in cui non possono essere utilizzate le siringhe costosi, come ad esempio, nella formazione di grandi gruppi di studenti, lavoro nel campo, o con budget inferiori. Realizzazione accurata del metodo 1 è bene finché i tempi è mantenuta con regolare sostituzione di stuzzicadenti per evitare l&#39;accumulo di saccarosio (e la concentrazione consegnato). Tuttavia, utilizzando stuzzicadenti è più difficile da controllare con precisione e valutare la quantità e la grandezza degli USA erogata, che è importante per gli studi di condizionamento 1. La concentrazione di saccarosio necessaria perfornire una ricompensa sufficiente a mantenere le api motivati ​​a imparare l&#39;associazione condizionata può dipendere dalla difficoltà del compito e stato interno delle api o periodo dell&#39;anno. I compiti più difficili richiedono una soluzione di saccarosio più elevato per le api &#39;per imparare con successo il compito. Stampo può accumulo in soluzioni di saccarosio anche a 5 ° C, che compromettere l&#39;integrità della soluzione, che colpisce la salute e la percezione del premio delle api durante l&#39;esperimento. Si consiglia di sostituire la soluzione ogni pochi giorni. Precisione, Timing e coerenza di CS e US Consegna La questione più critica sulla corretta attuazione di una procedura di PER, o per quella materia qualsiasi procedura condizionata, comporta la precisione, i tempi e la consistenza di CS e la consegna degli Stati Uniti (Figura 1). Gli investigatori che sono nuovi alla procedura spesso sono imprecise circa la consegna di uno o entrambi gli stimoli. ISI diche non riescono a consentire la sovrapposizione CS e US compromettere le prestazioni condizionata. Il PLC automatizza un segnale acustico per lo sperimentatore di consegnare saccarosio 3 secondi dopo l&#39;inizio della consegna odore. Gli investigatori devono tenere il saccarosio / acqua goccia vicino al ape per una rapida consegna dopo il segnale. Queste procedure aiutano a trascinare un ISI coerente. Posizionamento di un cronometro da l&#39;arena di condizionamento permette per un comodo posizionamento momento del processo, nonché il monitoraggio il tempo delle api in campo sia prima che dopo la consegna degli stimoli. In questo modo l&#39;ITI di può essere relativamente coerente e l&#39;intera procedura può essere eseguito ad un ritmo controllato. ITI di che sono troppo brevi, per esempio meno di 1 min, o troppo lungo può portare a scarso rendimento condizionata 1. Stagionali, ambientali e contestuali Effetti sulla Honey Bee Prestazioni Prestazioni di miele d&#39;api può essere significativamente influenzato da suoi dintornisia prima che durante il condizionamento. Spesso, le fluttuazioni di temperatura e disponibilità di cibo che vengono con il mutare delle stagioni altereranno la motivazione delle api per imparare. Quando i fiori sono in fiore, la motivazione delle api per imparare l&#39;associazione condizionato in laboratorio diminuisce 38. Quando la colonia viene sottolineato - da temperature estreme, carenze alimentari, o di stress-correlate alla patologia - le api mostreranno una riduzione delle loro prestazioni di apprendimento all&#39;interno. Api del miele conservati in una stanza volo può imparare bene per un po &#39;, ma c&#39;è anche lo stress della malattia e invecchiamento degradano le loro prestazioni di apprendimento nel tempo. Il contesto durante il condizionamento può anche ridurre le prestazioni delle api. Eventuali odori estranei, di movimento, e altri stimoli possono distrarre l&#39;ape dagli stimoli sperimentali. Per evitare questo problema, mantenere un contesto visivo semplificato ragionevolmente coerenti. Genotipo e esperienza Influisce PER Prestazioni &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; lavoratori api possono differire notevolmente in termini di prestazioni su qualsiasi procedura di condizionamento dovuto alla specializzazione compito, genotipo, o altri fattori ambientali 20. Pertanto, è importante standardizzare, per quanto possibile, i tipi di animali utilizzati in un esperimento per ridurre variazione inter-individuale. In una colonia guidata da una regina open-accoppiati, il che significa che si accoppiò con molti diversi droni, gli operai saranno diversi nel genotipo paterno. Sfondo genetica può portare a differenze drammatiche reattività sensoriale 39 e l&#39;apprendimento delle prestazioni 29. Utilizzando colonie guidati da regine inseminate strumentalmente dallo sperma da singoli droni 28 riduce questo inter-individuale variazione. I protocolli descritti sopra, comprende un metodo per la raccolta di lavoratori api dall&#39;ingresso nido. Tuttavia, queste api mellifere differiscono l&#39;uno dall&#39;altro per quanto riguarda l&#39;età o l&#39;attività comportamentale. Possono essere giovani (inexperienced) o più anziani (più) raccoglitori esperti. Essi possono essere giovani api mellifere rendendo i loro primi voli di orientamento. Oppure possono essere le api di guardia. Per ridurre la variabilità, contrassegnare le api con smalto ad asciugatura rapida o tag di marcatura sia come emergono come adulti (da controllare per l&#39;età) e / o quando cominciano foraggiamento (per controllare per esperienza). Poi, pochi giorni dopo, raccogliere le api marcate per il condizionamento. I lavoratori che sono impegnati in comportamenti di cura possono essere raccolti dai fotogrammi all&#39;interno dell&#39;alveare. Gli infermieri possono essere identificati positivamente quando inseriscono le loro teste in una cella di covata per nutrire e curare la larva dentro. Utilizzando Vergine Queens o Droni per PER condizionata Oltre alle operaie api da miele, vergine regine api e droni possono essere facilmente condizionati in una procedura di PER per gli studi volti a sviluppare linee genetiche di api che si differenziano per l&#39;apprendimento delle prestazioni 28. Regine Vergini devono essere raccolti subito dopo they emergono da impupamento e messo direttamente in imbracature di ritenuta, senza anestesia. Giovani, droni immaturi raccolto dal favo di covata all&#39;interno della colonia non sono generalmente motivati ​​a imparare. Dopo che hanno iniziato l&#39;accoppiamento voli, droni facilmente imparano PER compiti 28. Essi devono essere raccolti che tornano da un volo di accoppiamento e mantenuto durante la notte in una piccola gabbia in una colonia utilizzato per l&#39;allevamento regine. Non tentare di imbrigliare il giorno prima di condizionamento; essi non sopravvivono bene in cablaggi durante la notte. Un paio di ore prima del condizionamento i droni possono essere raccolti dalle gabbie e inserito nel imbracature di ritenuta, senza anestesia. Conclusioni Questa procedura PER, nel modo di metodi, pari a un punto di partenza per la progettazione di esperimenti PER. La maggior parte dei protocolli PER richiederanno che la procedura descritta da modificare in qualche modo per attuare gli obiettivi specifici della sperimentazione e AlloggiE i gruppi di trattamento multipli. E &#39;facile da implementare. Tuttavia, la corretta esecuzione richiede attenzione ai dettagli e la pratica. Una volta masterizzato può essere un potente procedura per aggiungere come strumento di ricerca per diversi programmi di ricerca di base e applicata con diverse specie di insetti.

Molti insetti conoscere stimoli ecologicamente rilevanti, e quindi cambiano le loro risposte comportamentali a tali stimoli al fine di adattarsi a nuove relazioni predittive nel loro ambiente. Diversi meccanismi diversi possono essere alla base questa plasticità comportamentale (ad esempio, non associativa, associativa / pavloviano, e operante / strumentale 1). Questi tipi di plasticità differiscono nel modo stimoli o comportamenti sono associati a eventi importanti, quali il verificarsi di cibo, un compagno, o pericolo. La comprensione di queste forme di plasticità è molto importante per la ricerca di base nel modo in cui il sistema nervoso cambia per codificare nuove memorie 2. E &#39;anche importante per comprendere i comportamenti adattivi di insetti che sono vettori di malattie importanti (ad esempio, tse-tse e la zanzara) e di insetti che sono importanti agricolo, sia nella produzione agricola (api da miele) o come parassiti. Studiare la plasticità comportamentale in qualsiasi animAl richiede un livello di controllo sperimentale su un numero di variabili che non è realizzabile nel campo 1. Si richiede lo sviluppo di un protocollo di condizionamento robusto che può essere impiegato in condizioni più controllate, ma che sono ancora rilevanti per il comportamento in condizioni naturali. Il miele delle api (Apis mellifera) è un ottimo modello per come sviluppare un protocollo per l&#39;esecuzione di analisi controllate di plasticità comportamentale 3,4. La risposta estensione proboscide (PER) in api mellifere è un riflesso naturale comportamentale in cui l&#39;ape estende la sua proboscide in risposta alla stimolazione antenne con una soluzione di zucchero. Durante il normale comportamento di foraggiamento, PER verifica quando il miele delle api trova il nettare in un fiore. Fortunatamente, le api mellifere saranno prontamente presentare questo comportamento semplice e facilmente quantificabile in laboratorio. Questo rende possibile studiare, in un ambiente controllato, i meccanismi che influenzano questo comportamento ecologicamente rilevante 5. PER can essere utilizzato anche all&#39;interno di un protocollo di condizionamento per indagare la percezione dello stimolo e l&#39;apprendimento e la memoria in diverse condizioni di trattamento, che sono progettati per rivelare i meccanismi comportamentali e neurali che sono alla base della plasticità 6. Fin dai primi studi di Kuwabara 7, PER condizionata è stato ampiamente utilizzato per rivelare non associativa, associativo e meccanismi operanti che sono alla base della plasticità comportamentale api mellifere 8. Questi meccanismi sono identici a quelli rivelato negli studi di liberamente battenti api mellifere 9. A differenza degli studi di liberamente volanti api da miele, PER protocolli di condizionamento possono essere accoppiati con elettrofisiologia 10,11 o live-cell imaging di fluorescenza 12-14 del cervello. Inoltre, i protocolli PER permettono di manipolazione sperimentale dei processi neurali attraverso trattamenti farmacologici o genetici molecolari per verificare ipotesi circa i ruoli dei componenti specifici della rete, come ad esempio neuromodulators 15,16. PER protocolli hanno anche fornito un modo importante per valutare gli effetti subletali di condizioni ambientali e tossine sulla salute e bottinatrici efficienza delle api mellifere 17. Questa procedura descrive due metodi di consegna odore in parallelo. Metodo 1 è una versione di odore e di stimolo incondizionato (saccarosio) consegna che fornisce un metodo poco costoso e tecnicamente semplice per presentare l&#39;odore e la ricompensa di saccarosio. Questo metodo è buono per la formazione di base e quando l&#39;automazione non è possibile. Si tratta di un ottimo modo per introdurre questa tecnica per un laboratorio di classe o di insegnamento. Durante condizionata per gli esperimenti che coinvolgono compiti più difficili e valutazioni fisiologiche accoppiati della percezione degli odori, l&#39;apprendimento, o la memoria, è molto importante per regolare in modo accurato e preciso l&#39;insorgenza, tempistiche di consegna, la durata degli stimoli. Per la consegna stimolo più affidabile, usare un mezzo di automatizzare la consegna di un odorend un preciso metodo di consegna ricompensa. Metodo 2 impiega automatizzato consegna odore e precisa consegna saccarosio. E &#39;tecnicamente più sofisticato e richiede più per la configurazione iniziale di metodo 1, ma aumenta in modo significativo la coerenza dei tempi e la quantità di stimoli utilizzati per il condizionamento e dovrebbe essere usato quando possibile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1278">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sucrose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9378-1KG</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Odorant compounds (for example):</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="6" style="width:587px;">For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">1-hexanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">471402-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">2-octanone</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W280208-800G-K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">heptanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51778-5ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">gerianol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">163333-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">nonanal</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">131210-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hexane</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Heavy Mineral Oil</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">330760-1L</td>
			<td style="width:587px;">Make sure it&#8217;s odorless</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ethanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Scintillation vials</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z190535-1PAK</td>
			<td style="width:587px;">Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bee harness</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Duct tape</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z188956-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Wash bottles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z560847-3EA</td>
			<td style="width:587px;">For the 70% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Small fan in mountable housing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Dryer tubing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 1 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">20 ml disposable plastic syringes</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">WU-07945-18</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">15 mm filter paper circles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274844-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Pushpins</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Toothpicks</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 2 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07840-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont micrometer syringe tip</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07841-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">26G 3/8&#8221; Leur hub hypodermic needles</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-10</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:371px;">1cc tuberculin syringes (plastic/glass)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z181641-1EA&#160;&#160; OR &#160;&#160;Z192090-200EA</td>
			<td style="width:587px;">glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small rubber/silicone restrictors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-02</td>
			<td>Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">75 X 100 mm filter paper</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z695106-500EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Direct Logic 05 Programmable Logic Controller</td>
			<td style="width:203px;">Koyo Electronics Industries Co, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">http://www.koyoele.co.jp/&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; english/support/dlc.html#plc</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">1 mm, 4mm &#38; 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Polypropylene connectors &#38; leur fittings</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">65-mm Correlated Flowmeter</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-03216-08</td>
			<td style="width:587px;">Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump</td>
			<td style="width:203px;">Aquacave</td>
			<td style="width:119px;">AE-TETRA-300</td>
			<td style="width:587px;">www.aquacave.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">LIF series Solenoid Valves for .042 &#34; ID Tubing, Configuration &#34;E&#34;</td>
			<td style="width:203px;">The Lee Company</td>
			<td style="width:119px;">LFAA1200118H</td>
			<td style="width:587px;">Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer</td>
			<td style="width:203px;">RadioShack</td>
			<td style="width:119px;">273-074</td>
			<td style="width:587px;">www.radioshack.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research

Insetti modificano le loro risposte agli stimoli attraverso l&#39;esperienza di associare quegli stimoli con eventi importanti per la sopravvivenza (per esempio, cibo, compagni, minacce). Ci sono diversi meccanismi comportamentali attraverso i quali un insetto apprende associazioni salienti e li riferisce a questi eventi. E &#39;importante capire questo plasticità comportamentale per i programmi volti ad assistere i insetti che sono benefiche per l&#39;agricoltura. Questa comprensione può essere utilizzato anche per scoprire le soluzioni ai problemi biomedici e agricoli creati da insetti che fungono da vettori di malattie e parassiti. Il protocollo condizionata Proboscis Extension Response (PER) è stato sviluppato per api da miele (Apis mellifera) oltre 50 anni fa per studiare come percepiscono e conoscere gli odori floreali, che segnalano le risorse di nettare e polline una colonia ha bisogno per la sopravvivenza. La procedura PER fornisce un quadro solido e di facile impiego per lo studio di molti diversi mecha ecologicamente rilevantinismi di plasticità comportamentale. È facilmente adattabile all&#39;uso di parecchie altre specie di insetti ed altri riflessi comportamentali. Questi protocolli possono essere facilmente impiegati in combinazione con vari mezzi per il monitoraggio dell&#39;attività neuronale nel sistema nervoso centrale tramite elettrofisiologia o Bioimmagini, o per manipolare percorsi di neuromodulatori mirati. Si tratta di un test affidabile per rilevare rapidamente gli effetti sub-letali sul comportamento causati da stress ambientali, tossine o pesticidi. Mostriamo come il protocollo di PER è semplice da implementare utilizzando due procedure. Uno è adatto come un esercizio di laboratorio per gli studenti o per rapide analisi degli effetti di un trattamento sperimentale. L&#39;altro fornisce un maggiore controllo accurato di variabili, che è importante per gli studi di condizionamento comportamentale. Mostriamo come diverse misure per la risposta comportamentale che vanno dal binario sì / no a più variabile continua come la latenza e la durata della proroga proboscide può essere usato per testare Hypotheses. E, discutiamo alcuni problemi che i ricercatori incontrano comunemente quando utilizzano la procedura per la prima volta.

Presentiamo due esempi di utilizzo dei protocolli PER sopra descritti. Il primo esempio fatto uso del metodo 2 di studiare come le api il miele percepiscono odori diversi in funzione della somiglianza molecolare per l&#39;odore utilizzato come CS 5,24,25. Il secondo è un esempio di utilizzo del metodo 1 e alcune delle precauzioni che devono essere prese quando si inizia ad usare PER condizionata esperimenti nel laboratorio di ricerca. Studi come questo sono stati utilizzati per descrivere la olfattiva &#39;spazio percettivo&#39; di api e falene in combinazione con Bioimmagini 13 o elettrofisiologico analisi 26. Le api da miele (n = 20) sono stati condizionati ad associare l&#39;odorizzante decanale con rinforzo saccarosio oltre 12 avanti l&#39;associazione di condizionamento prove (Figura 3a). Circa il 10% delle api mellifere risposto &#39;spontaneamente&#39; il primo processo, che è normale. Dopo che la percentuale che responded aumentare nel corso dei prossimi studi fino al 100% delle api mellifere risposto alla quinta prova e ogni prova successiva. Diversi studi hanno dimostrato che questo aumento di risposta è specifico alla condizione in avanti accoppiamento (figura 1) rispetto a diversi importanti procedure di controllo 3. Dopo la fase di acquisizione, ogni ape è stato sottoposto ad una serie di prove di laboratorio, non rinforzate (Figura 3B) che comporta l&#39;esposizione al odore CS e diversi altri odoranti che sistematicamente diversi dalla CS in strutture molecolari. Le api da miele hanno risposto maggiormente al CS. Le loro risposte agli altri odoranti diminuite in funzione dei cambiamenti sistematici nella struttura, con le risposte più bassi ai odoranti meno come il CS. Nella Figura 4, i risultati di un recente workshop in cui gli studenti hanno imparato, per la prima volta, come per condizionare le api mellifere utilizzando il metodo 1 sono illustrati. Studenti abeti<html> t condizionato api da miele di avanti accoppiamento methycyclohexanone (MCH) o ottanolo (OCT) con rinforzo saccarosio (Figura 4A). Risposte per cento sono stati inferiori al primo processo e sono aumentati in prove successive, indicando che le api hanno imparato l&#39;associazione odore-saccarosio. Ci sono state differenze nel grado che le api hanno imparato l&#39;associazione condizionata tra i diversi gruppi di studenti. Nella nostra esperienza, questi tipi di differenze potrebbero essere dovute al odore che è stato utilizzato come CS, agli elementi imprecisi nel metodo (metodo 1), o al livello di formazione degli sperimentatori. Nel terzo caso, la prestazione diventa rapidamente più coerente con maggiore esperienza degli sperimentatori. Dopo il condizionamento, ogni ape è stato testato due volte con ogni odore. In gruppi di api che erano stati condizionati con abbinamento avanti di PTOM o MCH, la risposta è stata, come previsto, più forte l&#39;odore condizionato (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; Il secondo gruppo di api mellifere che hanno subito in avanti accoppiamento di ottobre è stata condizionata in parallelo ad un altro gruppo in cui l&#39;odore ottobre è stata all&#39;indietro accoppiato con saccarosio. abbinamento a ritroso è uno dei diversi tipi di procedure di controllo per dimostrare che l&#39;aumento della risposta è specifico per inoltrare l&#39;accoppiamento e non a causa di un altro processo, come ad esempio l&#39;eccitazione non specifico da sensibilizzazione. Per accoppiamento all&#39;indietro, il saccarosio Stati Uniti e l&#39;odore CS sono presentati in ordine inverso di ciò che viene mostrato in Figura 1. Acquisizione Dati da accoppiamento indietro siamo non mostrato perché la CR non può essere segnata data la presentazione dell&#39;odore CS dopo la presentazione del saccarosio. come sarebbe previsto per il condizionamento associativo, i livelli di risposta a ottobre erano più alti nel gruppo in avanti accoppiato rispetto al gruppo all&#39;indietro (Figura 4C). 7fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1: Schemi di disegno sperimentale per il condizionamento utilizzando avanti accoppiamento. Vedere la Tabella 1 per le definizioni dei termini utilizzati in questa figura. (A) Il CS (odore) precede e si sovrappone con gli Stati Uniti (soluzione di acqua / saccarosio). Il rapporto tra il CS e US mostrato è ottimale per le api da miele condizionata e falene. Ma l&#39;ottimale ISI può dipendere dal protocollo di condizionamento e specie animale 1. (B) Ripartizione e relativa tempistica di CS, CR, Stati Uniti, e UR. Il CR che si verifica sia prima presentazione degli Stati Uniti o nel corso degli studi non armato &quot;test&quot; è la misura dipendente per protocolli sperimentali. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Odore esaurimento con il riutilizzo di cartucce. Per questi dati, cartucce odore eranoset-up con esanolo come descritto nel testo. Esanolo è comunemente usato come un CS in studi PER; Tuttavia, il tasso effettivo di esaurimento dipenderà l&#39;odore e solvente. Le cartucce sono stati poi utilizzati una volta per 4 secondi ogni minuto su 8 prove (supponendo 5 api mellifere / processo in un esperimento standard che sarebbe pari a 40 usi). Le diluizioni che il solvente indicato, che erano relativamente standard per gli esperimenti PER, erano 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) L&#39;odore è stata campionata dopo la prima e l&#39;ottava prove di adsorbimento su una fase solida microestrazione (SPME) fibra che è stato poi desorbito su un gascromatografo. Le relative aree sotto i picchi erano più alti dopo il primo processo relativo alla ottava per entrambi i solventi e per entrambe le concentrazioni (Wilcoxon abbinato coppie firmato rank test p &lt;0.05 [*] o maggiore), il che dimostra che meno l&#39;odore è stato consegnato dalla cartuccia dopo che la cartuccia è stata utilizzata più volte. (C, D) Gli stessi dati mostrano solo l&#39;ottavo tr<html> IAL con l&#39;asse y espanso. Essa mostra che la deplezione era leggermente maggiore per esano rispetto all&#39;olio minerale, ma solo alla concentrazione più bassa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Acquisizione e test utilizzando decanale come il CS e il metodo 2 di condizionamento. (A) Trial-by-trial di risposta (CR) su 12 prove di abbinamento a termine (Figura 1). I dati sono da api n = 20 miele condizionata in quattro gruppi di 5 api mellifere ciascuno. L&#39;ISI è stato di 3 secondi e l&#39;ITI era 6 min. (B) prove non rinforzate con odori diversi da decanale per lunghezza e / o la posizione del carbonio carbonilico catena di carbonio. Gli odori sono stati presentati in una serie randomizzato tra i quattro gruppi e sono stati intervallati da prove rinforzati con Decanal (ogni due o tre prove), al fine di evitare l&#39;estinzione del CR. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. dati provenienti da un workshop durante il quale studenti universitari sono stati addestrati a condizionare le api mellifere utilizzando PER metodo 1. dati (A) Acquisizione da tre gruppi di api da miele condizionati per ottanolo (n = 23 e 15 per Gps 1 e 2, rispettivamente) e metilcicloesanone (n = 10) (B) CR durante le prove non rinforzate con entrambi gli odori.; quattro studi presentati in serie casuale di tutti i gruppi. (C) prove non rinforzate con entrambi gli odori in due gruppi di api da miele, uno in avanti accoppiato (Gp 1, n = 23) e uno indietro accoppiati (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Term (sigla) </td><td> Definizione </td><td> Esempio Rilevante </td></tr><tr><td> Stimolo condizionato (CS) </td><td> Lastimolo che suscita poca o nessuna risposta in un primo momento e segnala Uniti </td><td> ODOR </td></tr><tr><td> Risposta condizionata (CR) un </td><td> La risposta al CS dopo associazione con gli Stati Uniti </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Stimolo incondizionato (US) </td><td> Uno stimolo biologicamente significativo che suscita una risposta </td><td> Saccarosio / SOLUZIONE ACQUA </td></tr><tr><td> Risposta incondizionata (UR) un </td><td> La risposta alla US </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus Interval (ISI) </td><td> Il tempo tra l&#39;inizio della SC e insorgenza degli Stati Uniti </td><td> ODORE di intervallo saccarosio </td></tr><tr><td> Inter-Trial Interval (ITI) </td><td> Il tempo tra successivi abbinamenti CS-USA per un singolo animale </td><td> ODORE (prova n) ODORE (prova n + 1) Intervallo </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Importante Terminologia. Fare riferimento alla Figura 1 per un esempio di questi termini. Per un PER di condizionamento del CR e UR sono gli stessi, anche se per altri tipi di associazioni e riflessi del CR e UR possono differire. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Movie 1.</a> Un video di un miele delle api PER esecuzione dopo che era stato condizionato a rispondere a un odore. Nota la risposta PER dell&#39;ape circa 1,5 sec seguente odore insorgenza. Software di monitoraggio mappato i movimenti delle antenne in risposta alla presentazione del odore. Le linee tracciate in alto a destra del video raffigurano i movimenti delle antenne reali. I due grafici in basso dello schermo mostrano movimenti delle antenne sulla X (a sinistra) e Y (destra) coordinate. Le linee verticali nel grafico mostrato nel video indicano, da sinistra a destra, la luce ON, PER, luce fuori e proboscide retrazione.

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A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

a-proboscis-extension-response-protocol-for-investigating-behavioral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.5K Views.  Arizona State University. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species. 

Video: A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Combinando comportamentali Endocrinologia ed Economia Sperimentale: Decisione testosterone e sociale Fare

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Ricerca

Neuroscienze

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

Abilitazione ad alta risoluzione display in scala di grigi e misurazioni accurate Tempo di risposta su computer convenzionali

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Un metodo generale per la valutazione di incubazione della brama di saccarosio in ratti

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

Un leggero, Cuffie-based per la gestione di sistema feedback uditivo in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

Protocollo di stimolazione magnetica transcranica online per misurare la fisiologia corticale associata con l'inibizione di risposta

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...