Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH per DJB (AI041930, AI073142, AI075931 e AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui forniamo un protocollo per genica mirati ed efficaci in Δ ku80 parassita ceppi per permettere il recupero efficiente di progenie geneticamente manipolata che possiedono delezioni geniche mirate, sostituzioni geniche e / o geni marcati. L&#39;esecuzione sequenziale di questi metodi fornisce un approccio affidabile per l&#39;isolamento di mutanti parassita che contengono manipolazioni genetiche mirate singoli o multipli 1-3. Mentre la generazione di una delezione mirata dipende da molteplici fattori, l&#39;uso del ceppo ku80 Δ con la strategia e protocollo presentato aumenta notevolmente l&#39;efficienza e la facilità di fare ceppi mutanti ben definiti di T. gondii per studi di genomica funzionale. Il genoma di T. gondii durante le fasi asessuali è aploidi. Pertanto vantaggi di fare quando si pianifica di eliminare un gene è il gene che non deve essere essenziale in vitro. Tuttavia, l&#39;efficienza di targeting gene ko in Δ ku80 ceppi è estremamente elevata, e questo permette l&#39;isolamento di ceppi mutanti con tassi di replica significativamente compromessa. Se un gene mirato è essenziale, parassiti spesso cessano di replicare durante la selezione. Un altro fattore critico mirata manipolazione genetica è quella perfetta omologia con almeno 620 bp del fianco di mira genomico è necessaria per ottenere integrazioni mirate rilevabili 2. Regioni più lunghi di omologia producono elevate efficienze di targeting e il targeting utilizzando fianchi di DNA di circa 1.000 bp è un metodo affidabile ed efficiente 1-4. Per questo motivo è importante che genomiche fianchi di targeting sono generati dallo stesso ceppo di T. gondii (RH, Pru) come il ceppo che viene geneticamente manipolato. Mancanza di sufficiente omologia può spesso provocano la integrazione mirata di un fianco di targeting genomico, ma non l&#39;altro. Integrazione incompleto o mancato ottenimento di un ma koy anche essere dovuto alla persistenza episomiale. Subito dopo la trasfezione, tutte le molecole di targeting sono episomi non integrati, e qualche volta le molecole di targeting può persistere come episomi per molte generazioni. Utilizzando bersaglio fianchi di DNA di ~ 1 Kbp e continuando a passare i parassiti sotto la selezione prima di ri-subcloning risolve spesso i problemi connessi con la persistenza episomiale. Una volta che un knockout è convalidata e il marcatore HXGPRT viene rimosso, la strategia di targeting gene può essere ripetuta su un secondo GOI di generare più gene delezioni in un singolo ceppo parassita 1-3. La generazione di delezioni, sostituzioni, o geni con tag può anche essere realizzato utilizzando diversi marcatori selezionabili (bleomicina, CAT, pirimetamina resistente DHFR, ecc.) Sebbene il marcatore selezionabile CAT attualmente è presente nel tipo II Δ ku80 Pru genoma 1, questo marcatore può essere rimosso usando il HXGPRT </em&gt; protocollo di selezione descritti qui. Nelle nostre mani, la selezione HXGPRT è il più sicuro e il marcatore più efficace con la più alta efficienza di mira in cui una singola copia di inserimento mirato è sufficiente per la selezione robusta nel MPA + X medie. HXGPRT fornisce anche l&#39;approccio unico momento utile per l&#39;eliminazione mirata di un marcatore selezionabile (Figura 3) usando 6-thioxanthine (6TX) Selezione 2,3. Così questo protocollo fornisce l&#39;unica attuale approccio per lo sviluppo di ceppi mutanti definiti con diverse manipolazioni genetiche mirate. Questo protocollo fornisce un metodo valido ed efficace per la manipolazione genetica mirata a Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii e si applica all&#39;analisi di un singolo gene, una famiglia di geni, o genoma studi di genomica funzionale. Prima della disponibilità di ceppi Δ ku80 1,2, questi approcci non erano ampiamente possibile a causa della ineFficiency di questi metodi. Di conseguenza, questo protocollo è ampiamente applicabile per mirati manipolazione genetica di Toxoplasma gondii ed è accessibile a tutti i ricercatori interessati ad affrontare una serie di domande sulla biologia dei parassiti, risposta dell&#39;ospite, e la genomica funzionale.

Toxoplasma gondii è un comune protozoo parassita intracellulare obbligato che spesso e cronicamente infetta una vasta gamma di animali e gli esseri umani 5. Si stima che oltre 1 miliardo di esseri umani sono attualmente e cronicamente infettati da questo agente patogeno. Oltre all&#39;importanza di malattia causata da T. gondii infezione, la crescente disponibilità di strumenti sperimentali, potenti risorse genomica 6, la facilità di crescita in vitro e di eccellenti modelli murini hanno reso T. gondii un sistema modello di punta per il più ampio studio di patogeni intracellulari eucariotiche e altri parassiti Apicomplexa significative che causano malattie devastanti come la malaria (Plasmodium sp.) e Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. Una limitazione significativa di Toxoplasma gondii come organismo modello è stato il recupero inefficiente di progenie che trasportano mirato manipolazioni genetiche. Questo problem Il targeting gene è causa di una bassa frequenza di ricombinazione omologa rispetto alla molto alta frequenza di ricombinazione non omologa in ceppi di T. wild-type gondii anche quando ampia omologia DNA è fornita in DNA molecole bersaglio utilizzati negli studi genetici 2. Abbiamo recentemente geneticamente bloccato la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di Toxoplasma gondii eliminando il gene che codifica la proteina 1,2 KU80. Il tipo risultante I e tipo II ku80 ceppi Δ tassi di sviluppo normale, dimensione e comportamenti sia in vitro che in vivo durante tachizoite e fasi bradyzoite in vitro e in vivo, tuttavia, questi ceppi presentano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa e questo fenotipo aumenta la probabilità di isolare rapidamente progenie desiderato di manipolazioni genetiche mirate da alcune centinaia ad alcune thoUSand volte 1,2,4. Recenti comunità a livello di impiego di tipo I e di tipo II Δ ku80 ceppi ha notevolmente intensificato il ritmo, la varietà, così come il tasso di successo di approcci genetici mirati a T. gondii 1-4,8-13. Qui si descrive un protocollo completo per l&#39;eliminazione mirata del gene, la sostituzione del gene, e tagging gene in Δ ku80 ceppi di T. gondii. Dimostriamo come progettare e affidabile indirizzare manipolazioni genetiche a specifici geni o loci genetici nel Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Manipolazione genetica mirata mediante ricombinazione omologa è il metodo di scelta per analisi genomica funzionale per ottenere una vista dettagliata della funzione del gene e fenotipo (s). Lo sviluppo di ceppi mutanti con delezioni, mutazioni geniche mirate mirati, funzione genica completata, e / o geni targhetta fornisce potenti strategie per colmare funzione genica, in particolare se queste manipolazioni genetiche possono essere efficacemente mirati al locus del gene di interesse utilizzando mediata dalla doppia integrazione attraversare ricombinazione omologa. A causa di tassi molto elevati di ricombinazione non omologa, analisi genomica funzionale di Toxoplasma gondii è stata precedentemente limitata dalla mancanza di metodi efficienti per il targeting gene delezioni e sostituzioni di geni per specifici loci genetici. Recentemente, abbiamo abolito la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di T. gondii eliminando il gene encoding proteine ​​1,2 KU80. I ceppi Δku80 comportano normalmente durante tachizoite (acuta) e bradyzoite (cronici) Ciclo in vitro e in vivo e mostrano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa. Le ku80 ceppi Δ rendono studi di genomica funzionale realizzabile sul singolo gene nonché sulla scala genoma 1-4. Qui riportiamo i metodi per l&#39;utilizzo di tipo I e di tipo II Δku80Δhxgprt ceppi per avanzare gene strategie selettive a T. gondii. Delineiamo metodi efficienti per la generazione di delezioni geniche, sostituzioni di geni, ei geni taggati con inserimento mirato o la cancellazione del fosforibosiltransferasi (HXGPRT) marcatore ipoxantina-xantina-guanina. Il gene descritto rivolti protocollo può essere utilizzato in una varietà di modi in Δku80 ceppi per avanzare analisi funzionale del genoma parassita e per sviluppare ceppi singoli che portanomultipla mirato manipolazioni genetiche. L&#39;applicazione di questo metodo genetico e successivi test fenotipici rivelerà aspetti fondamentali e unici della biologia di T. gondii e relativi agenti patogeni umani significativi che provocano la malaria (Plasmodium sp.) e cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Un modello dettagliato è fornito per la costruzione di un plasmide di targeting per eliminare un gene, compreso il posizionamento di siti di enzimi di restrizione e la generazione dei primer che facilitano il targeting genetico e convalida di gene targeting, così come la costruzione plasmide per la successiva eliminazione di HXGPRT in un processo a singola fase (Figure 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Uno schema di massima è presentato per fare una delezione mirata gene (Figura 2A), le coppie di primer utilizzati per convalidare l&#39;eliminazione di un knockout, per esempio, di tipo I rop18 (Figura 2B), e risultati rappresentativi della convalida PCR sono riportati (Figura 2C). Questo risultato rappresentativo è mostrato per illustrare la gamma dei risultati ottenibili in loci genetici che sono relativamente difficili da bersaglio. Un gene delezione mirata successo comporterà l&#39;assenza del gene di ateresse prodotto di PCR (PCR 1), la presenza del 3 &#39;genomica fianco di targeting (PCR2), e la presenza del marcatore selezionabile HXGPRT adeguatamente integrato tra il 5&#39; e fianchi rivolti genomiche 3 &#39;che definiscono la cancellazione (PCR3 e pCR4) . Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9, e 11 vengono convalidati delezioni geniche mirate (KO), dove HXGPRT ha sostituito il GOI (Figura 2C). Un clone che non contiene un gene delezione può essere rappresentata da una varietà di modelli striature. Tipicamente, un clone senza gene delezione rispecchierà il ceppo parentale (pattern parentale) con bande osservati per PCR1 e PCR2, ma non per PCR3 o pCR4 come visto per i cloni 1 e 2 (Figura 2C). Questo &quot;modello genitoriale&quot; nasce da alcuni meccanismi potenziali. Di tanto in tanto, MPA parassiti selezionati resistenti portano non integrati episomi persistenti del pΔGOI rivolte plasmide, e notiamo che la continua selezione spesso costringe questi episomida integrare. Osserviamo anche alcuni retroscena rara nel tipo I Δ ku80 ceppo a causa di integrazione non intenzionale del pΔGOI mira plasmide, che contiene un HXGPRT cDNA espresso tramite DHFR 5 &#39;e 3&#39; elementi del promotore, in nessuna locus DHFR o nel HXGPRT parzialmente cancellato locus 14. Anche se questo è un evento raro integrazione mirata, non è stata l&#39;integrazione prevista e serve come un punto chiave da ricordare nella progettazione di qualsiasi strategia di sostituzione del gene. Omologia DNA superiore a 120 bp effettuate sul tuo pΔGOI mira plasmide può fornire un sito alternativo per la ricombinazione in Δ ku80 2 ceppi che potrebbero dare indietro un fondo indesiderato. Nel tipo II Pru Δ ku80 ceppo questo sfondo è ridotto o inesistente rispetto al tipo I, perché il marcatore selezionabile HXGPRT si basa su sequenze di tipo I che presentano polimorfismi nucleotidici se confrontato con il DNA di tipo II cheriduce notevolmente questa rara esperienza in esperimenti che utilizzano il tipo II Pru Δ ku80 ceppo 1. Se un locus genico è essenziale (non possono essere eliminati), o ha un gene estremamente bassa di mira frequenza al locus, o se persiste [non integrati] episomi non vengono facilmente eliminati attraverso la crescita e la selezione, questo modello genitoriale dominerà il pattern osservato in MPA cloni resistenti. In alternativa, la molecola di DNA di targeting si osserva talvolta ad integrare a solo il 5 &#39;o 3&#39; genomica fianco targeting e una banda viene osservata sia per PCR3 o pCR4 (ma non entrambi) insieme PCR1 e PCR2 come visto per il clone 10 (5 &#39;integrazione) e clone 7 (3&#39; integrazione) (Figura 2C). Questi modelli suggeriscono infrequente il verificarsi di un singolo croce sopra integrazione del plasmide mira al locus che integra HXGPRT ma questa integrazione mirata non elimina il gene di interesse. Questo modello (corsie 7 e 10 in Figura 2C) emphasizes la necessità di riferire dati PCR per verificare che l&#39;integrazione mirata verificato anziché un&#39;unica omologa attraversare e un secondo non omologa integrazione della molecola targeting. Raramente, osserviamo un misto genetico rappresentato da clone 12 (Figura 2C) che rappresenta sia un modello genitoriale e un modello di eliminazione mirata. Questo modello deriva probabilmente in occasione di due genotipi parassite che sono presenti nella stessa posizione in un ben clonazione. Viene mostrato un schema generale per la rimozione di HXGPRT da Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eliminare HXGPRT dal ceppo (Figura 3A). La coppia di primer utilizzato per convalidare la rimozione di HXGPRT da ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica un unico ~ 1,2 Kbp banda in PCR5 come visto nella cloni 4, 7, 9, 11 e 12 (Figura 3C). Se HXGPRT non viene rimosso dal locus, a ~ 3.Si osserva 4 banda Kbp (cloni 1, 2, 3, 6, 8, 10, e il controllo dei genitori). Diversi meccanismi agiscono per rendere la rimozione di HXGPRT (6TX selezione) più impegnativo e meno efficiente l&#39;integrazione di HXGPRT (MPA + X selezione). Selezione MPA è semplicemente più efficiente di 6TX selezione 14,16. Inoltre, sono necessari alti livelli di espressione HXGPRT per la selezione 6TX che per MPA selezioni 16,24. Di conseguenza, le mutazioni che possono ridurre l&#39;attività dell&#39;enzima HXGPRT o mutazioni o cambiamenti epigenetici che riducono il livello di espressione di HXGPRT al locus di un gene potenzialmente in grado di abolire l&#39;efficacia della selezione 6TX. Anche con queste sfide di selezione 6TX, il tasso di successo della selezione 6TX in Δ ku80 ceppi è superiore del 90% al primo tentativo 1-3. Viene mostrato un modello generale di codifica C-terminale diretto di geni codificanti proteine ​​(Figura 4). Questoschema utilizza integrazione diretta tramite doppia croce sopra ricombinazione omologa di HXGPRT 3 &#39;del gene etichettato e impiega anche strategie convalida analoghe a quelle sopra descritte. Quando un gene è sospettato di essere un gene essenziale questo può essere verificata utilizzando una seconda trasfezione con un isolato indipendente di targeting DNA plasmidico. Metodi alternativi, come i regimi per l&#39;espressione genica regolata, sono a disposizione per ulteriori verificare se un gene è essenziale 25. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figura 1. Presentazione del progetto di un DNA di targeting plasmide. Un. Schema per la progettazione di sovrapposizione primer utilizzati per la PCR amplifica il 5 &#39;e 3&#39; fianchi di destinazione con 33 sovrapposizioni bp per la navetta vettore pRS416 e cassette minigene HXGPRT. Primer raffigurati nello schema eranoutilizzato per generare il 5 &#39;e 3&#39; fianchi bersaglio di pΔROP18 10. B. Strategia generale per la progettazione di una molecola di DNA di targeting. La spina dorsale della pΔGOI è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primer F1 e R1, un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primers F2 e R2 e la cassetta minigene HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer F1 per tagliare il plasmide all&#39;estremità 5 &#39;estremità del 5&#39; DNA bersaglio fianco, RE.Y in R2 Primer per tagliare il plasmide alla &#39;fine del 3&#39; del DNA bersaglio 3 affiancare e RE.Z nei primers R1 e F2 di asportare il HXGPRT mincassette igene. C. sequenze dei primer utilizzati per generare il costrutto di mira per la cancellazione di rop18. Le regioni in grassetto corrispondono a T. gondii sequenza genomica, e le regioni nonbold corrispondono ai siti degli enzimi di restrizione e sequenze che si sovrappongono con pRS416 e la cassetta minigene HXGPRT. La coppia di primer HX_F e HX_R amplifica il HXGPRT cassetta minigene 14. Primer letti da 5 &#39;a 3&#39;. Tabella adattata da Fentress et al 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figura 2. Panoramica del protocollo per la delezione di un gene utilizzando HXGPRT. Un. Disruption di un MOL nel ceppo Δ ku80Δhxgprt da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa con un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA bersaglio fianco sul pΔGOI plasmide. Una strategia di PCR utilizzando PCR1, PCR2, PCR3 e pCR4 (non in scala) e &#39;stato che permette la verifica genotipo di convalidare cloni con l&#39;integrazione mirata di HXGPRT e delezione del locus GOI. B. coppie di primer Rappresentante progettato per convalidare l&#39;eliminazione della rop18 . ROP18_DF e ROP18_DR amplificano PCR1, ROP18_ExF e ROP18_CxR amplificano PCR2, ROP18_CxF e DHFR_CxR amplificano PCR3 e DHFR_CxF e ROP18_CxR amplificare pCR4 (Figura 2A). Primer letti da 5 &#39;a 3&#39;. Tabella adattata da Fentress et al 10. C. I risultati rappresentativi di validazione di una mirata delezione del gene (rop18) utilizzando HXGPRT. Dopo la trasfezione di plasmidi pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt e selezione in MPA +X, MPA + X cloni resistenti sono stati saggiati per la cancellazione di rop18. Ceppo parentale Il controllo è positivo per la PCR 1 (~ 400 bp) e la PCR 2 (~ 650 bp) del prodotto e negativo per la PCR 3 (~ 1.200 bp) e la PCR 4 (~ 1.300 bp) del prodotto. Una mirata GOI knockout è positivo per i PCR2, PCR3 e pCR4 prodotti ed è negativo per la PCR 1 prodotto (vedere la Figura 2A). Visualizzati sono pannelli rappresentativi dei risultati di PCR1 e PCR2 (pannello superiore), PCR3 (pannello centrale), e pCR4 (pannello inferiore). Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 mostrano il corretto pattern di bande di PCR 1, PCR2, PCR3 e pCR4 che definisce un evento gene delezione mirata nel clone. Cloni 1, 2, 7, 10 e 12 non sono delezioni geniche, e corrispondono ad altri potenziali risultati rappresentativi. (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δhxgprt, M = segnataglie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figura 3. Panoramica del protocollo per la ri-mira il gene di interesse a cancellare HXGPRT. A. Strategia per la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa nel ceppo Δ ku80Δgoi :: HXGPRT usando un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA bersaglio fianco sul pΔGOIc plasmide. La strategia PCR per la verifica genotipo è raffigurato con una coppia di primer di saggio per un prodotto di PCR (PCR5) che attraversa la delezione (non in scala). B. Una coppia rappresentante Primer progettato per convalidare la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT dal gra2 locus nel ceppo Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primer GRA2 _CLF e GRA2_CxR amplificano PCR5. Primer<html> leggere da 5 &#39;a 3&#39; del pannello. C. Rappresentante di cloni 6TX resistenti che possono essere ottenuti a seguito di trasfezione pΔGOIc plasmide in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT e selezione in 6TX. Cloni 4, 7, 9, 11 e 12 mostrano il corretto pattern di bande di PCR5 che corrisponde alla delezione mirata del marcatore HXGPRT (~ 1,2 Kbp prodotto che abbraccia &#39;al fianco con leggera sovrapposizione con il 5&#39; 3 il fianco e all&#39;esterno 3 &#39; fianco). Cloni 1, 2, 3, 6, 8, e 10 (questa banda è luce) rappresentano il pattern di bande atteso di circa ~ 3,4 kbp corrispondente al clone genotipo parentale, anche se questi cloni mostravano un grado di resistenza al 6TX quella ammessa la loro selezione (questo fenotipo può occasionalmente sorgere spontaneamente da arresto di espressione HXGPRT (vedi nota a protocollo 2.1 (punto 8), e la sezione Risultati Rappresentante). (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = segnataglie).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figura 4. Progettazione di una molecola di DNA di targeting per contrassegnare il C-terminale di una proteina. La strategia si basa sulla capacità del marcatore HXGPRT di funzionare anche come un 3 &#39;regione regolatoria a valle. La spina dorsale della pΔGOItag è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando il Fgoi e rTag primer, un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando la F2 e R2primer e la cassetta minigene HXGPRT. Il 5 &#39;DNA bersaglio fianco sostituisce il codone di terminazione con il tag (HA, Myc, His, ecc) seguita da un codone di terminazione sostituzione. MPA + X selezione integra il tag C-terminale ed un HXGPRT valle, e sposta il 3 &#39;UTR ad una posizione dopo il marcatore HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer Fgoi per tagliare il plasmide all&#39;estremità 5 &#39;estremità del 5&#39; DNA bersaglio fianco, e RE.Y nella Primer R2 per tagliare il plasmide alla &#39;fine del 3&#39; del DNA 3 fianco bersaglio, e RE.Z nel rTag primer e F2 per asportare la cassetta minigene HXGPRT all&#39;impiego per la costruzione del plasmide di riorientamento di locus del gene etichettato eliminare il marcatore HXGPRT da ristabilire la collocazione del 3 &#39;UTR.

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Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Qui riportiamo un metodo per l&#39;utilizzo di tipo I e tipo II<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi di<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Per generare in modo efficiente delezioni geniche mirate e sostituzioni del gene per l&#39;analisi genomica funzionale.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

16.9K Views.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. Qui riportiamo un metodo per l'utilizzo di tipo I e tipo II Δku80 Ceppi di Toxoplasma gondii Per generare in modo efficiente delezioni geniche mirate e sostituzioni del gene per l'analisi genomica funzionale.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...