Questo lavoro è stato finanziato dalla American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N e National Institutes of Health assegno di ricerca AI081220. BIC è supportato da una Cavalieri Templari Eye Foundation assegno di ricerca.

Panoramica I protocolli sono forniti per definire la prima dose di mutageno portando ad una uccisione 70% dei parassiti (protocollo 1). La procedura successiva è prevista per arricchire i mutanti egress indotte da un pool mutagenizzato parassita (protocollo 2, Figura 2). Questo è seguito da un protocollo per testare l&#39;incidenza di mutanti egress in piscina arricchito, o per convalidare il fenotipo uscita in mutanti individuali (protocollo 3). Infine, viene fornito un protocollo per generare cloni singolo parassita da popolazioni arricchiti mediante diluizione limitante (protocollo 4). 1. Titolazione del mutageno Usare particolare cautela, come guanti doppi, quando si lavora con composti altamente mutageni e liquidi. Raccogliere separatamente i rifiuti liquidi per il corretto smaltimento. <ol><li> Inoculare T25 fiaschette per coltura tissutale confluenti con fibroblasti umani prepuzio (HFF) cellule con 1 ml di tachizoiti fresco e lisate crescere 18-25 hr a 37 °; C in 5% CO 2 in Ed1 medio (D-MEM supplementato con 1% inattivato al calore siero fetale bovino, 0,2 mM L-glutammina, 50 U / ml penicillina, 50 pg / ml streptomicina, e 0,25 mg / ml di amfotericina B ). Vedi Roos et al. per la crescita generale e dei media di cellule HFF e parassiti 21. </li><li> Sostituire il mezzo con 10 ml 0,1% di siero bovino fetale media (Ed1 diluito 1:10 in D-MEM) e lasciare in umidificata incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO 2 (denominata &quot;37 ° C incubatore&quot; da qui in poi) per 10 min . </li><li> Aggiungere 0, 12.5, 25, 50, o 100 ENU pl (1 Stock M in DMSO) o EMS (1 Stock M in DMSO) per pallone (diluizioni mutageni di lavoro sarà 1,25, 2,5, 5, e 10 mm, rispettivamente). Aggiungere DMSO a 100 pl per ogni beuta. Incubare per 4 ore a 37 ° C incubatore. </li><li> Lavare tre volte per 10 secondi a temperatura ambiente risciacquando il monostrato con 10 ml di PBS freddo (pre-raffreddata a 4 ° C). </li><li> Aggiungere 5 ml di PBS, raschiare il monostrato sciolto con un poliziotto in gomma (cella scrAPER), passare le cellule raschiate con un ago 26,5 G rimuovere fisicamente il parassita dai fibroblasti (clip dall&#39;albero fuori l&#39;ago con le forbici pesanti per non esporre l&#39;ago), e filtro a 3.0 micron filtro in policarbonato. Passaggi aghi multipla aumenterà l&#39;efficienza di rilascio parassiti dalla cellula ospite. </li><li> Contare la concentrazione parassita utilizzando un emocitometro. Lasciate che i parassiti accontentarsi di 5 min in hemocytomer prima del conteggio. </li><li> Diluire i parassiti a 10.000 parassiti per 3 ml a Ed1 (per 10 ml 33.333 parassiti sono necessari). </li><li> Inoculare un pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con 3 ml di parassiti diluiti (contenente 10.000 parassiti). Diluire serialmente i parassiti di 10 volte nell&#39;arco di 3 pozzi in un 6-ben confluenti piastra con cellule HFF contenenti 2,7 ml Ed1 mediante il trasferimento di 300 ml dal primo pozzo. Lasciare le piastre indisturbati nel 37 ° C incubatore per 7 giorni. </li><li> Aspirare il terreno, fissare 15 min con 3 ml / pozzetto di etanolo 100%, macchiacon 3 ml / pozzetto soluzione di violetto cristallo (12,5 g cristalvioletto in 125 ml di etanolo miscelati con 500 ml di ossalato di ammonio 1%) per 15 min, lavare con 3 ml / pozzetto di PBS (1 minuto) e aria secca. Tutti a temperatura ambiente. </li><li> Contare placche e selezionare concentrazione di mutageno necessario per ottenere la sopravvivenza del 30% dei parassiti esposti (70% uccisione dosaggio: vedi Figura 1). Una dose di 70% abbattimento è stato usato storicamente 14 e indotte meno di 100 mutazioni puntiformi per genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manoscritto). </li></ol> 2. Arricchimento di mutanti egress (figura 2) <ol><li> Eseguire mutagenesi come sopra descritto utilizzando un dosaggio mutageno indurre il 70% uccisione. Crescere la popolazione mutagenizzato per un passaggio in un pallone nuovo di cellule ospiti. </li><li> Infettare un T25, HFF confluenti pallone di coltura tissutale con 120.000 parassiti appena lisati di una popolazione mutagenizzato in 10 ml Ed1. Incubare per 2 ore in un incubatore a 35 ° C in 5% CO2 e umidificata (D&#39;ora in poi chiamato &quot;35 ° C incubatore&quot;). </li><li> Aspirare il terreno e risciacquare 10 secondi con 10 ml di PBS freddo e quindi aggiungere 10 ml Ed1 terreno supplementato con 25 mg / ml di solfato di destrano (DS) 13. Incubare per 26 ore in un incubatore a 40 ° C sotto 5% di CO 2 e umidificata (D&#39;ora in poi chiamato &quot;40 ° C incubatore&quot;). </li><li> Preparare la soluzione di lavoro di esaltatori di uscita. Diluire l&#39;induttore di uscita scelta alla concentrazione di lavoro in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml HBSSc supplementato con 25 mg / ml DS. Pre-riscaldare le diluizioni per 30 min a 37 ° C a bagno-maria. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di lavoro. </li><li> Aspirare il terreno dalle parassitiferi fiaschi e aggiungere pre-riscaldato soluzione induttore di uscita. Incubare a 37 ° C incubatore per i tempi indicati in tabella 1. </li><li> Aspirare il terreno di 10 secondi e sciacquare con 10 ml di PBS freddo e poi aggiungere 10 ml Ed1 integrato con 25 mg / ml DS e 50 uM pirrolidina ditiocarbammato (PDTC: add 5 pl di 100 mM Archivio PDTC in PBS) 13. Incubare 5 ore a 35 ° C incubatore. </li><li> Aspirare il terreno di 10 secondi e risciacquare una volta con 10 ml di PBS (temperatura ambiente) e poi aggiungere 10 ml Ed1 media. Mettere flaconi di nuovo nel 35 ° C fino a quando i parassiti incubatore distruggere il monostrato: flaconi shake al giorno. Il recupero richiede circa 7 giorni. </li></ol> 3. Validazione dei fenotipi mutanti mediante saggi egress Dopo aver eseguito lo schermo arricchimento e crescita della popolazione arricchito per un passaggio nelle cellule HFF, i fenotipi devono essere confermati da un test di uscita 11,13. Questa analisi dovrebbe anche essere utilizzato per convalidare singoli cloni Dopo il protocollo 4. <ol><li> Inoculare 20.000 parassiti per bene in un piastra da 24 pozzetti contenenti le cellule HFF confluenti coltivate su vetrini coprioggetto (1 ml Ed1 medium per pozzetto). Incubare in 8 ore a 35 ° C incubatore poi trasferire in un incubatore a 40 ° C per 24 ore. </li><li> Lavare con 1 ml / pozzetto PBS (10 secondi a temperatura ambiente). Aggiungere 1 ml (induttori egress includere un solo DMSO controllo negativo), pre-riscaldati e diluito in HBSSc e incubare per i tempi descritti nella Tabella 1. </li><li> Aspirare il terreno e fissare con 1 ml / pozzetto metanolo 100% per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Se i parassiti genitori che esprimono una proteina autofluorescente sono stati utilizzati per la mutagenesi, procedere al passaggio # 3.5 13. Se non che esprimono proteine ​​fluorescenti parassiti sono stati usati come linea parentale, macchia i coprioggetti fissi con Diff-Quick colorare per 1 min a temperatura ambiente 11. </li><li> Lavare 5 min con 1 ml / pozzetto in PBS della piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. </li><li> Per i parassiti che esprimono proteine ​​fluorescenti: lavare rapidamente il vetrino in DDH 2 O (ad immersione) e montarlo su vetrini sotto gelmount per proteggere il segnale di fluorescenza. Per i Quick Diff parassiti macchiati, lavare per 10 secondi in 100% di etanolo e lasciare asciugare prima di montare sul vetrino. </li><li> Utilizzando un (fluorescenza) con un microscopio40-60x obiettivo conta la percentuale di vacuoli egressed rispetto ai vacuoli che rimasti intracellulare (vedi Figura 4). </li></ol> 4. Clone mutanti egress limitando la diluizione Dopo la convalida del fenotipo della popolazione mutante arricchito uscita utilizzando il protocollo 3, la popolazione policlonale deve essere clonato per ottenere cloni singolo parassita. <ol><li> Contare popolazione parassitaria in un emocitometro e diluire ad una concentrazione di 500 parassiti per ml in Ed1 media. </li><li> In una piastra a 384 pozzetti contenente un monostrato confluente di cellule HFF, sostituire il mezzo con 40 pl / pozzetto di Ed1 mezzo utilizzando una pipetta multicanale. Come mostrato in figura 5, quattro popolazioni policlonali può essere clonato per placca come segue: pipettare 40 pl / pozzetto di diluito mutante 1 in pozzetti C3-C12, mutante 2 in pozzetti C13-C22, mutante 3 in pozzetti H3-H12, e mutante 4 in pozzi H13-H22 (volume finale nei pozzetti è ora 80 pl). Utilizzando una pipetta multicanale, pipetta il soldistribuzione pesi su e giù per 5 volte, quindi trasferire 40 microlitri alla riga sotto la riga di partenza (da fila C a D o la riga H a I). Continua a queste diluizioni seriali di 2 volte attraverso fila G (mutanti 1 e 2) o riga N (mutanti 3 e 4). Eliminare l&#39;olio extra 40 microlitri dall&#39;ultima fila. Incubare in un incubatore a 35 ° C per 7-10 giorni senza disturbare la piastra. </li><li> Controllare i pozzetti su un microscopio invertito con un 10-20x obiettivo per la presenza di placche singole, come visibile dei fori &#39;in monostrato. </li><li> Pick 4 pozzi per mutante con una targa unica e trasferire i parassiti in una confluente pallone coltura di tessuti con le cellule HFF e pieno di Ed1 media. Crescere i parassiti in un incubatore a 35 ° C ed agitare i flaconi al giorno per disperdere i parassiti extracellulari. Ciò richiede in genere 7 giorni. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Il ENU mutageni e EMS non sono stabili quando conservati per lunghi periodi di tempo. Pertanto, il test di potenza mutagenole scorte è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Risultati della titolazione tipici e uccisione curve sia per ENU e EMS sono mostrati nella Figura 1. Tuttavia, si raccomanda di effettuare saggi placca per ogni esperimento mutagenesi per verificare che il dosaggio appropriato è stato usato. Per mantenere la diversità nella popolazione parassita mutagenizzato, è importante procedere alla schermata di uscita mutante più rapidamente possibile. In genere, un passaggio dei parassiti in un pallone nuovo viene eseguita per lasciare che i parassiti sopravvissuti recuperare prima di andare avanti con lo schermo. Va tenuto presente che questo avrà come conseguenza nella divisione dei mutanti. Pertanto non si può escludere che più mutanti isolati clonali dopo aver completato l&#39;intera procedura contenere esattamente lo stesso genotipo. Per evitare di isolare i mutanti più volte lo stesso si raccomanda di isolare solo un mutante singola uscita per mutagenesi, a meno che i fenotipi (ad esempio differenziali sensibilità induttori uscita) sonomolto diversi tra loro. D&#39;altra parte, non ogni schermata risultati in isolamento di mutanti con fenotipo desiderato. In particolare, il Ca 2 +-ionoforo A23187 fenotipo resistente è rara e richiede molteplici esperimenti di mutagenesi e gli schermi per isolare un mutante singola uscita. Pertanto si raccomanda di eseguire esperimenti di mutagenesi 5-10 e schermo in parallelo. Il potere arricchimento dello schermo è stata testata miscelando un mutante uscita noto con wild-type parassiti a diversi rapporti. Queste miscele sono state sottoposte allo schermo e l&#39;incidenza del fenotipo mutante nella popolazione arricchita è stata valutata. Utilizzando tipo selvatico parassiti esprimono citoplasmatica RFP e una linea mutante esprime YFP citoplasmatica le incidenze potrebbe rapidamente essere stabilita mediante citometria di flusso (figura 3) 13. I risultati mostrano che fenotipi mutanti possono essere regolarmente arricchito al 80% di purezza a partire da 1 parassita uscita mutante per 10.000 wild-type parasites 13. Tuttavia, quando l&#39;uscita mutante: wild-type rapporto avviamento parassita è 1:100.000 parassiti, la popolazione isolata è solo 1-2% (1:100) mutanti di uscita. Di conseguenza il potere di arricchimento dello schermo è di 1000 volte. Poiché lo schermo inizia con l&#39;inoculazione di parassiti 120.000, di cui in genere il 70% sono vitali, di solito eseguire due turni di arricchimento. I parassiti isolati sono cresciuti tra i round di arricchimento. Questa procedura porta ad una popolazione mutante 100% anche se a partire da 1:1.000.000 egress mutanti: wild-type parassiti. Il dosaggio uscita per convalidare e caratterizzare i fenotipi richiede una molteplicità di infezione della cellula ospite che consente la differenziazione di vacuoli individuali. Ciò è particolarmente importante quando si analizzano le condizioni con alte percentuali di uscita dei parassiti, come singoli sono sparsi in giro. Come mostrato in Figura 4, se le popolazioni egressed non sono ben separati è facile sottovalutare la percentualedi uscita contando due vacuoli egressed come uno vacuolo. Poiché uscita e l&#39;invasione sono relativi processi, e alcuni termosensibili fenotipi mostrano un fenotipo lieve a temperatura più bassa, non tutti i mutanti avranno efficienze invasione simili. Tali mutanti devono quindi essere inoculate in diversi dosaggi volte più elevate per ottenere un&#39;alta densità vacuolo sufficiente per una valutazione accurata del loro fenotipo uscita. Inoltre, alcuni induttori egress non efficacemente stimolare l&#39;uscita di vacuoli contenenti quattro parassiti o meno. Come tale, è importante che vacuoli contenere otto parassiti o più quando iniziare il test uscita. Nel nostro laboratorio mutanti schermo isolato con una particolare uscita enhancer contro esaltatori egress altri. Con la loro profilazione cross-reattività i mutanti possono essere raggruppati in classi diverse. Infine, non tutti i mutanti egress saranno sensibili alla temperatura. In particolare i mutanti isolati con induttori egress innescando passi prima del rilascio di intracellular Ca 2 + sono inclini a fenotipi non-sensibili di temperatura. Ciò è dovuto alle vie parallele che possono portare alla possano uscire converge prima che il segnale sul rilascio intracellulare di Ca 2 +. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Chemical mutageno titolazione del dosaggio. Saggi placca A. eseguita in una piastra da 6 pozzetti utilizzando diverse concentrazioni EMS ei numeri diversi di parassiti come indicato per pozzetto. Le macchie bianche sono placche parassiti formati nel monostrato HFF. B, C. Le curve di sopravvivenza di parassiti su esposizione a vari dosaggi di EMS (B) e ENU (C). La sopravvivenza è stata valutata mediante analisi della placca. Un dosaggio inducendo 70% uccisione viene scelto per esperimenti di mutagenesi. Medie di tre esperimenti indipendenti + / - deviazione standard vengono visualizzati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Rappresentazione schematica della schermata uscita arricchimento mutante. Temperatura è indicato l&#39;asse y, mentre progressione temporale è rappresentato dalla asse x. Parassiti verdi riflettono egress parassiti mutanti, parassiti rossi riflettono wild-type parassiti. I tempi di cambiamenti delle condizioni e lo stimolo induttore di uscita sono indicate in alto e sono contrassegnati da frecce sulla linea blu che riflette il profilo di temperatura. Adottato da Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Tipico di arricchimento egress fenotipi mutanti. Risultati di arricchimento di un mutante uscita mescolato wild-type parassiti a diversi rapporti (asse X). La percentuale di egress fenotipi mutanti nella popolazione cresciuta dopo lo schermo è tracciata sulla asse y ed è stata valutata mediante citometria a flusso (egress parassiti mutanti espressi YFP citoplasmatica, wild-type parassiti espresso cytoplasmic RFP). I risultati di tre esperimenti indipendenti sono rappresentati da punti dati rosse, blu e verde. Adottato da Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. I risultati tipici di un saggio uscita. A segnare quattro frecce. Vacuoli contenenti diverse intatti parassiti 4-8. B. Frecce indicano quattro gruppi di parassiti riflettenti sparsi quattro vacuoli indipendenti egressed. Egress è stata indotta da A23187 (B) o DMSO come controllo negativo (A). Parassiti esprimere citoplasmatica YFP 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluizione seriale per le linee clonali parassiti. Quattro popolazioni policlonali (rosso, blu, giallo, verde) sono diluiti serialmente in un singolo da 384 pozzetti confluenti piastra con cellule HFF. Row C e ricevo 10 parassiti per bene esono 2-volte diluito (40 pl + 40 pl) fino righe H e N, rispettivamente. La tonalità di grigio indica la diminuzione del numero di parassiti per bene. Tipicamente, singoli cloni si trovano in righe e JL DF. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Stock </td><td> Concentrazione di lavoro </td><td> microlitri necessario per T25 (10 ml) </td><td> Tempo di incubazione (min) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M in DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanolo </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 1 pM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin * </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 10 pM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin non può essere utilizzato nella arricchirezione dello schermo, come i parassiti non sopravvivono stimolo nigericin; utilizzare solo nigericin nella convalida dei mutanti di uscita. Tabella 1. Egress induttori usati nelle procedure. Diluire in 10 ml HBBSc contenente 25 mg / ml DS per lo schermo, o non DS per la convalida mutante (test uscita). Tutti i composti da Sigma-Aldrich.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

<html> Il protocollo descritto fornisce un metodo efficiente per isolare mutanti Toxoplasma con un difetto di uscita. Abbiamo isolato con successo mutanti lungo varie fasi del percorso di uscita, alcuni dei quali hanno un fenotipo duplice invasione 13. Eventuali effetti sulla invasione può essere determinata utilizzando la cosiddetta rosso-verde saggio, che differenzia invasa da non-invasi da parassiti colorazione differenziale anticorpi 23,24. Per entrambi i saggi invasione e di uscita po...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Destrano solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 Stock mM in PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Portafiltro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um policarbonato filtro </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubatori </td><td> Diversi produttori </td><td></td><td> Umidificato, 5% CO 2, a 35, 37 e 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Diversi produttori </td><td></td><td> Idealmente invertito, a grande campo con l&#39;obiettivo di petrolio 63x o 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (secondo Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (numero di catalogo Hyclone SH30588) </li><li> 100 MgCl ul 1M 2 (100 mM end) </li><li> 100 pl 1M CaCl 2 (100 mM end) </li><li> 2,0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mM end) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

La diffusa, intracellulare obbligato, protozoo parassita Toxoplasma gondii causa malattia opportunistica in pazienti immuno-compromessi e causa difetti di nascita al momento dell&#39;infezione congenita. Il ciclo di replica litico è caratterizzato da tre fasi: 1. invasione attiva di una cellula ospite nucleata; 2. la replicazione all&#39;interno della cellula ospite; 3. uscita attiva dalla cellula ospite. Il meccanismo di uscita è sempre più apprezzato come un processo unico e altamente regolamentato, che è ancora poco conosciuta a livello molecolare. I percorsi di segnalazione sottostanti uscita sono stati caratterizzati mediante l&#39;uso di agenti farmacologici che agiscono su diversi aspetti dei percorsi 1-5. Come tali, diversi inneschi indipendenti di uscita sono stati identificati quali convergono tutti rilascio intracellulare di Ca 2 +, un segnale che è anche critica per l&#39;invasione della cellula ospite 6-8. Questa intuizione ha informato di un approccio del gene candidato che ha portato alla identizione degli impianti come il calcio proteina chinasi dipendente (CDPK) coinvolti in uscita 9. Inoltre, molti recenti scoperte in uscita comprensione sono state realizzate con (chimica) approcci genetici 10-12. Per combinare la ricchezza di informazioni farmacologica con l&#39;accessibilità crescente genetica di Toxoplasma abbiamo recentemente istituito una schermata che permette l&#39;arricchimento per i mutanti parassita con un difetto della cellula ospite in uscita 13. Anche se mutagenesi chimica utilizzando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o etile metanosolfonato (EMS) è stata utilizzata per decenni nello studio della biologia Toxoplasma 11,14,15, solo recentemente ha la mappatura genetica delle mutazioni alla base dei fenotipi diventano routine 16 -18. Inoltre, generando termosensibili mutanti, processi essenziali possono essere sezionati e le sottostanti direttamente geni identificati. Questi mutanti comportano come tipo selvatico sotto la temperatura permissiva (35 ° C), ma non proliferate alla temperatura restrittivo (40 ° C) come risultato della mutazione in questione. Qui illustrano un nuovo metodo di screening per isolare mutanti fenotipica con un sensibile alla temperatura fenotipo uscita 13. La sfida per schermi egress è quello di separare egressed da non egressed parassiti, che è complicata dal rapido re-invasione e l&#39;adesività generale dei parassiti per le cellule ospiti. Una schermata di uscita precedentemente stabilito si basava su una serie complessa di passaggi biotinilazione per separare intracellulare dai parassiti extracellulari 11. Questo metodo inoltre non generare mutanti condizionali conseguente fenotipi deboli. Il metodo qui descritto supera il forte attaccamento di egressing parassiti includendo un concorrente glicano, solfato di destrano (DS), che impedisce parassiti di attaccarsi alla cellula ospite 19. Inoltre, i parassiti extracellulari sono specificamente ucciso da pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), che lascia i parassiti intracellulariilleso 20. Pertanto, con una nuova schermata fenotipica per isolare specificamente parassiti mutanti con difetti in uscita indotta, il potere della genetica possono ora essere pienamente dispiegato per svelare i meccanismi molecolari alla base della cellula ospite uscita.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetica è un metodo efficace per svelare il livello molecolare di come<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses dalla sua cellula ospite. I protocolli sono fornite mutagenizzare chimicamente parassiti, per arricchire mutanti con difetti in uscita indotta, e convalidare il fenotipo di mutanti clonati.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K Views.  Boston College. Forward genetica è un metodo efficace per svelare il livello molecolare di come Toxoplasma Egresses dalla sua cellula ospite. I protocolli sono fornite mutagenizzare chimicamente parassiti, per arricchire mutanti con difetti in uscita indotta, e convalidare il fenotipo di mutanti clonati.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

L&#39;utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...