Name: fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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MKK ringrazia Ingegneria del Regno Unito e Physical Science Research Council (EPSRC) programma Life Sciences Interface per una borsa di studio personale. Vorremmo inoltre ringraziare finanziamento da parte del Regno Unito Biotechnology e Biological Sciences Research Council (BBSRC).

I protocolli per la preparazione del campione FLIM non differiscono da quelli per confocale o wide-field-based intensità microscopia a fluorescenza. L&#39;acquisizione dei dati è seguito dal compito principale di analisi dati, cioè estrarre i tempi di vita di fluorescenza dai dati grezzi. Una volta che questi sono stati ottenuti, l&#39;interpretazione dei dati consente di verificare o falsificare le ipotesi. 1. Cellule colorazione con rotori molecolari <ol><li> Preparare una soluzione stock (10 ml) sciogliendo circa 1 mg / ml del colorante in un solvente appropriato (ad esempio metanolo per BODIPY-C 12) 6,7 usando una bilancia accurata e una pipetta. </li><li> Le cellule (un cancro linea modello cellulare, HeLa nel nostro caso) per essere tinto sono coltivate su una piastra a cavità multiple con un lato coverslide per microscopia, in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera fino ~ 80% confluenti . </li><li> Aggiungere 10-20 microlitri della soluzione madre alle cellule viventi che crescono in un multi-well piastra (50 SmartSlide micro-incubazione sistema, WaferGen) in 4 ml di Opti-MEM (GIBCO) per pozzetto per una piastra da 6 pozzetti. Ciò produce un micro-molare concentrazione di colorante nel pozzo. </li><li> Riportare la piastra multipozzetto ad un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 ambiente per 10-45 minuti per la colorazione. </li><li> Rimuovere la piastra multipozzetto dall&#39;incubatore e lavare le cellule 3-4 volte con 4 ml di medium cell otticamente trasparente della cultura (ad esempio, Opti-MEM) per eliminare il colorante in eccesso. </li><li> Trasferire la piastra a cavità multiple alla fase microscopio e connettersi ad un controllore di temperatura / 5% CO 2 entrata del gas come richiesto, in preparazione per l&#39;imaging. </li></ol> 2. FLIM di rotori molecolari fluorescenti in cellule <ol><li> Posizionare il campione sul microscopio scena e ottenere una trasmissione e immagine di fluorescenza per identificare le cellule fluorescenti. Un diagramma schematico del set-up sperimentale è mostrato in fig. 1.Verify che emana fluorescenza dalla espe posizionicted (es membrana cellulare, citoplasma). Ottenere uno spettro di emissione di fluorescenza, e verificare che è quello del colorante o proteine ​​previsto, in questo caso lo spettro del rotore molecolare. Come controllo negativo, l&#39;immagine non-tinto campione e verificare che non è fluorescente. Sebbene questo passaggio non è essenziale specificamente per FLIM, è buona in generale e aiuta a verificare che il campione è quello che si pensa che sia. </li><li> Passa alla modalità FLIM - questo è facilmente eseguita spostando uno specchio di fuori del percorso fluorescenza fascio di rilevamento (&quot;esterno detector&quot; Cliccare su &quot;percorso del raggio setting&quot; sul pannello di controllo del software Leica TCS SP2 di acquisizione). Un filtro appropriato emissione di fluorescenza a bloccare qualsiasi luce eccitante di raggiungere il rivelatore deve essere in beampath rivelazione della fluorescenza. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Figura 1. Disposizione sperimentale per dominio del tempo utilizzando FLIM aclaser onfocal microscopio a scansione. <ol start="3"><li> Eseguire la scansione del campione e verificare, sul computer che controlla l&#39;acquisizione FLIM, che il tasso di conteggio del rivelatore (barra nera etichettato CFD sul software di controllo acquisizione del Becker &amp; Hickl SPC 830 a bordo) non più di circa l&#39;1% del tasso di ripetizione del laser ( barra verde etichettato software di acquisizione di controllo SYNC). Se è, ridurre l&#39;intensità di eccitazione laser, ad esempio inserendo un filtro a densità neutra nel percorso del raggio laser, per evitare di raccogliere pile-up curve distorte decadimento della fluorescenza. </li><li> Acquisire un&#39;immagine FLIM, tipicamente per 3-5 minuti, fermare la scansione e salvare i dati grezzi (un 3D di dati &quot;cubo&quot; composto da coordinate spaziali x e y, e il tempo). </li><li> Aprire i dati grezzi del pacchetto software di analisi di fluorescenza di decadimento, per esempio TRI-2 14 o software commerciale, per visualizzare l&#39;immagine intensità di fluorescenza. Questo è semplicemente il decadimento fluorescenza integrato, cioè l&#39;area sotto la curva di decadimento di fluorescenza, in ciascunpixel. </li><li> Selezionare un pixel tipica posizionando il cursore su di esso, e controllare il decadimento di fluorescenza in quel pixel. Se il conteggio di picco è inferiore a 100, utilizzare binning spaziale di pixel. I conteggi di pixel adiacenti (ad esempio 3x3 o 5x5) vengono aggiunti nel pixel centrale, in modo che un numero maggiore di picco è ottenuto. Ciò fornisce una maggiore precisione statistica per il passaggio successivo. In alternativa, la misurazione può essere ripetuta per un più lungo tempo di acquisizione (fase 5). Per i 30-50min, un conteggio di circa 10 volte superiore di picco (e conte totali) viene ottenuto, ma questa è troppo lungo un tempo di acquisizione per la maggior parte dei campioni biologici per il pericolo di introdurre artefatti dovuti al movimento del campione, la deriva microscopio, fototossicità e photobleaching. </li><li> Selezionare un valore di soglia globale pixel (sopra la quale il decadimento in un pixel è montato) e applicare un accoppiamento unico decadimento esponenziale all&#39;immagine. Il risultato produce una vita di fluorescenza per ciascun pixel sopra la soglia, che viene poi codificato incolore. Ogni pixel viene colorato con il risultato della misura, e una mappa FLIM si ottiene. Controllare i ridotti valori di chi-quadrato per vari pixels - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui corrispondenti, che dovrebbero essere distribuiti casualmente intorno allo zero. </li><li> La fluorescenza durata istogramma la frequenza con cui si verificano determinati tempi di vita di fluorescenza contro la vita stessa di fluorescenza. Regolare la gamma di colori in modo tale che la distribuzione durata della fluorescenza si inserisce nella gamma di colori. </li><li> Se un accoppiamento monoesponenziale non produce un valore di chi-quadrato di circa 1 (e fino a 1,3), e vi è una deviazione sistematica dei residui da zero, un modello più sofisticato è richiesto. Ad esempio, vai a montare un modello a doppio esponenziale per i decadimenti fluorescenza, per tenere conto di due diversi ambienti la sonda può essere poll L&#39;adattamento anche dare i pre-esponenziali fattori o ampiezze che danno un&#39;indicazione della quantità relativa di colorante in uno ambientemento o l&#39;altro. In alternativa, una funzione esponenziale allungato può essere opportuno rappresentano una distribuzione di vite fluorescenza. </li><li> I risultati per le durate di fluorescenza, pre-esponenziali fattori, e il rapporto di vita e la pre-esponenziale rapporto fattore per ciascun pixel può essere codificato a colori. Ogni pixel è colorato in base al suo valore, e il contrasto a causa di tempi di vita di fluorescenza, pre-esponenziale dei fattori e dei loro rapporti si ottiene. Anche in questo caso, controllare i ridotti valori di chi-quadrato (che può anche essere codificati a colori e visualizzati sotto forma di immagine) - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui, che devono essere distribuiti casualmente intorno allo zero. </li><li> Istogrammi durata della fluorescenza deve accompagnare tutte le immagini per una visualizzazione semplice dei valori medi di durata della fluorescenza, la distribuzione e la durata della fluorescenza. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Decadimenti di fluorescenza misuratail rotore fluorescente molecolare ad aumentare la viscosità in metanolo / glicerolo miscele sono mostrati nella fig. 2. I decade fluorescenza sono monoesponenziale, e la vita di fluorescenza varia sensibilmente in funzione della viscosità. Aumenta da circa 300 ps in metanolo (0,6 viscosità cP) a 3,4 ns nel 95% glicerolo (viscosità 950 cP). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Profili decadimento Figura 2. Fluorescenza per BODIPY-C 12 in metanolo / glicerolo miscele di viscosità varia 6. Il diagramma di taratura logaritmica della durata della fluorescenza rispetto a τ viscosità η per il rotore fluorescente molecolare è mostrato in fig. 3. Si tratta di una linea retta come richiesto dall&#39;equazione Förster Hoffman 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove k è 0 la radiativvelocità e costante, e Z e X sono costanti, con 0 &lt;x &lt;1. Prendendo il logaritmo su entrambi i lati rese <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> dove x è la pendenza della retta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Figura 3. Un grafico di log fluorescenza viscosità log vs vita per BODIPY C-12 produce una linea retta secondo la Förster-Hoffmann equazione 6. Dopo l&#39;incubazione delle cellule viventi con il rotore fluorescente molecolare una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. FLIM immagini di cellule HeLa incubate con un colorante meso-sostituito BODIPY sono mostrati nella fig. 4. I decade di fluorescenza in ogni pixel dell&#39;immagine può essere adeguatamente montate con un unico modello di decadimento esponenziale. Figura 4. (A) L&#39;intensità della fluorescenza e (b) FLIM immagini di cellule HeLa colorati con BODIPY-C 12. Le luminose regioni puntuate mostrano una vita più breve rispetto ad altre regioni. Questo liftime inferiore corrisponde ad una viscosità più bassa nel puncta, goccioline lipidiche probabilmente, secondo la Förster-Hoffmann equazione. Riportando i tempi di vita estratti da ogni pixel, si ottiene un istogramma di fluorescenza vita dell&#39;intera immagine come mostrato in fig. 5. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Figura 5. Istogrammi di vite fluorescenza da immagini FLIM di cellule HeLa colorati con meso-sostituiti BODIPY rotori molecolari.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

FLIM offre alcuni vantaggi chiave rispetto intensità-based imaging di fluorescenza. Esso può riferire eventi fotofisiche che sono difficili o impossibili da osservare da imaging intensità di fluorescenza, perché può separarli da effetti concentrazione del fluoroforo. Ciò è particolarmente utile per mappare viscosità intracellulare di imaging rotori fluorescenti molecolare. La durata della fluorescenza può essere facilmente convertito in una viscosità utilizzando una curva di taratura, come mostrato in fig. 3, indipendente dalla concentrazione di fluorescenti rotori molecolari. In FLIM ci possono essere artefatti che possono complicare l&#39;interpretazione dei dati. A 10 artefatti strumentali includono luce diffusa, che verrà visualizzato come un picco sopra l&#39;inizio del decadimento di fluorescenza e può essere confuso con un tempo di decadimento breve, o un piccolo picco dopo l&#39; IRF che può essere causato dai riflessi all&#39;interno del microscopio. Questi manufatti leggeri sparsi possono essere identificati come taliperché possono essere distinti con la discriminazione spettrale - sono sempre alla stessa lunghezza d&#39;onda della luce eccitante. Ricordando che in aria, la luce viaggia a 30 cm in 1 nanosecondo aiuta a individuare l&#39;origine di riflessioni. Filtro o di vetro a fluorescenza potrebbe anche causare un artefatto, soprattutto in fluorescenza del campione bassa, ma questo può essere facilmente identificata da prendere una misura in assenza del campione: se un decadimento si ottiene in queste circostanze, è dovuta allo strumento e non ha niente a che fare con il campione! D&#39;altra parte, notare che autofluorescenza campione può inoltre contribuire ad un decadimento fluorescenza. In tempo-correlata conteggio di singolo fotone (TCSPC), tempo-per-ampiezza convertitore (TAC) non linearità può causare convulsioni poveri, ma può essere identificato bloccando l&#39;eccitazione e lucente luce ambientale, ad esempio dalla sorgente di luce trasmessa sul campione e misurando la temporizzazione. Uno sfondo costante deve essereottenuto in ciascun pixel dell&#39;immagine. Regioni in cui deviazioni da uno sfondo costante verificarsi, non cederà mai una buona e dovrebbe essere evitato per la misura, se non può essere eliminato regolando i parametri per la scheda TCSPC. Un artefatto è infame in TCSPC fotone pile-up, che è causato da un tasso troppo alto di rilevamento fotone. 11,12 Questo porta solo al primo fotone che è stato misurato, ignorando qualsiasi fotoni successivi, perché l&#39;elettronica sono i tempi occupati e l&#39;elaborazione del primo fotone. Pile-up porta a un accorciamento della durata di fluorescenza, e il modo migliore per evitare questo è di mantenere il tasso di conteggio di fotoni a circa l&#39;1% del tasso di ripetizione laser. Prospettiva Esistono diverse implementazioni di FLIM, e, a seconda dell&#39;applicazione, ciascuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. 13 Il microscopio a fluorescenza ideale sarebbe acquisire l&#39;intera multidimensionale fluorescenza emission contorno di intensità, posizione, durata, lunghezza d&#39;onda e la polarizzazione in una singola misura, con sensibilità al singolo fotone, la massima risoluzione spaziale e tempo di acquisizione minimo. Non vi è attualmente nessuna tecnologia con questa combinazione unica di caratteristiche, e per costruire uno rimane una sfida per gli sviluppatori di strumentazione. L&#39;applicazione di nuove tecniche fisiche per problemi importanti in biologia cellulare è spesso il percorso di scoperte inattese, e vi è una lunga strada da percorrere prima che siamo vicini a saturare le capacità di imaging di fluorescenza per la biologia cellulare. Infatti, imaging parametri di fluorescenza come durata, spettro e polarizzazione, nonché immagini più rapidamente in 3D a più alta risoluzione spaziale, sono determinate a rivelare nuovi aspetti della biologia cellulare.

Campione con rotori molecolari fluorescenti Hardware: invertito Leica TCS SP2 microscopio confocale a scansione Coherent Mira 900 Ti: Sapphire laser a femtosecondi con un V6 Verdi pompa laser o Hamamatsu PLP-10 470 picosecondo sorgenti pulsate di diodi laser di eccitazione Becker &amp; Hickl SPC 830 bordo in 3GHz, Pentium IV, 1 GB di RAM del computer con Windows XP testa fredda Becker &amp; Hickl PMC100-01 rivelatore basato sulla Hamamatsu H5773P-01 fotomoltiplicatori, montati sulla porta X1 microscopio, o rivelatori ibridi DCC 100 rivelatore di modulo di controllo Software: TRI-2 14 o SPCImage 2,8 da Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

Diffusion è spesso un importante fattore limitante in reazioni chimiche o processi biologici e gioca un ruolo in una vasta gamma di eventi intracellulari. Viscosità è uno dei parametri fondamentali che riguardano la diffusione delle molecole e proteine, e le variazioni di viscosità sono state collegate a malattie e malfunzionamenti a livello cellulare. 1-3 Mentre i metodi per misurare la viscosità bulk sono ben sviluppati, microviscosità immagini ancora una sfida . Mappe di viscosità di oggetti microscopici, come le cellule singole, fino ad oggi sono difficili da ottenere. Viscosità Mapping con tecniche di fluorescenza è vantaggioso perché, simile ad altre tecniche ottiche, è minimamente invasivo, non distruttivo e può essere applicata alle cellule e tessuti viventi. Fluorescenti rotori molecolari vite presentano fluorescenza e rese quantiche che sono una funzione della viscosità del loro microambiente. 4,5 torsione o intramolecolarela rotazione porta al decadimento non-radiativo dal retro stato eccitato allo stato fondamentale. Un ambiente viscoso rallenta la rotazione o torsione, limitare l&#39;accesso a questa non-radiative percorso di decadimento. Questo porta ad un aumento della resa quantica di fluorescenza e la durata della fluorescenza. Imaging vita di fluorescenza (FLIM) di coloranti modificati BODIPY idrofobiche che agiscono come fluorescenti rotori molecolari mostrano che la vita di fluorescenza di queste sonde è una funzione della microviscosità del loro ambiente. 6-8 Un grafico logaritmico della durata della fluorescenza contro le rese viscosità solvente una linea retta che obbedisce l&#39;equazione Förster Hoffman. 9 Questa trama serve anche come un grafico di taratura per convertire vita di fluorescenza in viscosità. Dopo l&#39;incubazione delle cellule viventi con il rotore modificato BODIPY fluorescente molecolare, una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. Il valore di viscosità ottenuto in the puncta in cellule vive è di circa 100 volte superiore a quello dell&#39;acqua e del citoplasma cellulare. 6,7 Time-ha deliberato misure di anisotropia di fluorescenza di correlazione cedere tempi di rotazione in accordo con questi valori microviscosità di grandi dimensioni. Mapping la durata della fluorescenza è indipendente dell&#39;intensità di fluorescenza, e consente così la separazione di concentrazione sonda e effetti di viscosità. In sintesi, abbiamo sviluppato un approccio pratico e versatile per mappare la microviscosità in celle in base a FLIM di rotori molecolari fluorescenti.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l&#39;immagine l&#39;ambiente e l&#39;interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.9K Views.  King's College London. Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l'immagine l'ambiente e l'interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Ricerca

Bioingegneria

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and physiological state of living cells. Plasma membranes of tumor cells are known to have significant alterations in their composition, structure, and functional characteristics. Along with dysregulated metabolism of glucose and lipids, these specific membrane properties help tumor cells to adapt to the hostile microenvironment and develop resistance to drug therapies. Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting fluorescence of endogenous metabolic cofactors, such as reduced nicotinamide adenine dinucleotide NAD(P)H and oxidized flavins. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor, a synthetic viscosity-sensitive dye, with a strong fluorescence lifetime dependence on the viscosity of the immediate environment. In combination, these techniques enable us to better understand the links between membrane state and metabolic profile of cancer cells and to visualize the changes induced by chemotherapy.

Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting endogenous fluorescence. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor.

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and ...

Ricerca sul cancro

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Biochimica

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Immunologia e infezioni

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H) and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD) are coenzymes of metabolic reactions. NAD(P)H and FAD exhibit autofluorescence and can be spectrally isolated by excitation and emission wavelengths. Both coenzymes, NAD(P)H and FAD, can exist in either a free or protein-bound configuration, each of which has a distinct fluorescence lifetime-the time for which the fluorophore remains in the excited state. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) allows quantification of the fluorescence intensity and lifetimes of NAD(P)H and FAD for label-free analysis of cellular metabolism. Fluorescence intensity and lifetime microscopes can be optimized for imaging NAD(P)H and FAD by selecting the appropriate excitation and emission wavelengths. Metabolic perturbations by cyanide verify autofluorescence imaging protocols to detect metabolic changes within cells. This article will demonstrate the technique of autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD for measuring cellular metabolism.

This protocol describes fluorescence imaging and analysis of the endogenous metabolic coenzymes, reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H), and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD provides a label-free, nondestructive method to assess cellular metabolism.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Neuroscienze

Formazione di sferoidi multicellulari per analisi metaboliche e ipossia basate su FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autore in primo piano: Standardizzazione dei metodi di formazione degli sferoidi per l'analisi metabolica e dell'ossigenazione mediante microscopia per imaging a fluorescenza

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive