MKK ringrazia Ingegneria del Regno Unito e Physical Science Research Council (EPSRC) programma Life Sciences Interface per una borsa di studio personale. Vorremmo inoltre ringraziare finanziamento da parte del Regno Unito Biotechnology e Biological Sciences Research Council (BBSRC).

I protocolli per la preparazione del campione FLIM non differiscono da quelli per confocale o wide-field-based intensità microscopia a fluorescenza. L&#39;acquisizione dei dati è seguito dal compito principale di analisi dati, cioè estrarre i tempi di vita di fluorescenza dai dati grezzi. Una volta che questi sono stati ottenuti, l&#39;interpretazione dei dati consente di verificare o falsificare le ipotesi. 1. Cellule colorazione con rotori molecolari <ol><li> Preparare una soluzione stock (10 ml) sciogliendo circa 1 mg / ml del colorante in un solvente appropriato (ad esempio metanolo per BODIPY-C 12) 6,7 usando una bilancia accurata e una pipetta. </li><li> Le cellule (un cancro linea modello cellulare, HeLa nel nostro caso) per essere tinto sono coltivate su una piastra a cavità multiple con un lato coverslide per microscopia, in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera fino ~ 80% confluenti . </li><li> Aggiungere 10-20 microlitri della soluzione madre alle cellule viventi che crescono in un multi-well piastra (50 SmartSlide micro-incubazione sistema, WaferGen) in 4 ml di Opti-MEM (GIBCO) per pozzetto per una piastra da 6 pozzetti. Ciò produce un micro-molare concentrazione di colorante nel pozzo. </li><li> Riportare la piastra multipozzetto ad un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 ambiente per 10-45 minuti per la colorazione. </li><li> Rimuovere la piastra multipozzetto dall&#39;incubatore e lavare le cellule 3-4 volte con 4 ml di medium cell otticamente trasparente della cultura (ad esempio, Opti-MEM) per eliminare il colorante in eccesso. </li><li> Trasferire la piastra a cavità multiple alla fase microscopio e connettersi ad un controllore di temperatura / 5% CO 2 entrata del gas come richiesto, in preparazione per l&#39;imaging. </li></ol> 2. FLIM di rotori molecolari fluorescenti in cellule <ol><li> Posizionare il campione sul microscopio scena e ottenere una trasmissione e immagine di fluorescenza per identificare le cellule fluorescenti. Un diagramma schematico del set-up sperimentale è mostrato in fig. 1.Verify che emana fluorescenza dalla espe posizionicted (es membrana cellulare, citoplasma). Ottenere uno spettro di emissione di fluorescenza, e verificare che è quello del colorante o proteine ​​previsto, in questo caso lo spettro del rotore molecolare. Come controllo negativo, l&#39;immagine non-tinto campione e verificare che non è fluorescente. Sebbene questo passaggio non è essenziale specificamente per FLIM, è buona in generale e aiuta a verificare che il campione è quello che si pensa che sia. </li><li> Passa alla modalità FLIM - questo è facilmente eseguita spostando uno specchio di fuori del percorso fluorescenza fascio di rilevamento (&quot;esterno detector&quot; Cliccare su &quot;percorso del raggio setting&quot; sul pannello di controllo del software Leica TCS SP2 di acquisizione). Un filtro appropriato emissione di fluorescenza a bloccare qualsiasi luce eccitante di raggiungere il rivelatore deve essere in beampath rivelazione della fluorescenza. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Figura 1. Disposizione sperimentale per dominio del tempo utilizzando FLIM aclaser onfocal microscopio a scansione. <ol start="3"><li> Eseguire la scansione del campione e verificare, sul computer che controlla l&#39;acquisizione FLIM, che il tasso di conteggio del rivelatore (barra nera etichettato CFD sul software di controllo acquisizione del Becker &amp; Hickl SPC 830 a bordo) non più di circa l&#39;1% del tasso di ripetizione del laser ( barra verde etichettato software di acquisizione di controllo SYNC). Se è, ridurre l&#39;intensità di eccitazione laser, ad esempio inserendo un filtro a densità neutra nel percorso del raggio laser, per evitare di raccogliere pile-up curve distorte decadimento della fluorescenza. </li><li> Acquisire un&#39;immagine FLIM, tipicamente per 3-5 minuti, fermare la scansione e salvare i dati grezzi (un 3D di dati &quot;cubo&quot; composto da coordinate spaziali x e y, e il tempo). </li><li> Aprire i dati grezzi del pacchetto software di analisi di fluorescenza di decadimento, per esempio TRI-2 14 o software commerciale, per visualizzare l&#39;immagine intensità di fluorescenza. Questo è semplicemente il decadimento fluorescenza integrato, cioè l&#39;area sotto la curva di decadimento di fluorescenza, in ciascunpixel. </li><li> Selezionare un pixel tipica posizionando il cursore su di esso, e controllare il decadimento di fluorescenza in quel pixel. Se il conteggio di picco è inferiore a 100, utilizzare binning spaziale di pixel. I conteggi di pixel adiacenti (ad esempio 3x3 o 5x5) vengono aggiunti nel pixel centrale, in modo che un numero maggiore di picco è ottenuto. Ciò fornisce una maggiore precisione statistica per il passaggio successivo. In alternativa, la misurazione può essere ripetuta per un più lungo tempo di acquisizione (fase 5). Per i 30-50min, un conteggio di circa 10 volte superiore di picco (e conte totali) viene ottenuto, ma questa è troppo lungo un tempo di acquisizione per la maggior parte dei campioni biologici per il pericolo di introdurre artefatti dovuti al movimento del campione, la deriva microscopio, fototossicità e photobleaching. </li><li> Selezionare un valore di soglia globale pixel (sopra la quale il decadimento in un pixel è montato) e applicare un accoppiamento unico decadimento esponenziale all&#39;immagine. Il risultato produce una vita di fluorescenza per ciascun pixel sopra la soglia, che viene poi codificato incolore. Ogni pixel viene colorato con il risultato della misura, e una mappa FLIM si ottiene. Controllare i ridotti valori di chi-quadrato per vari pixels - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui corrispondenti, che dovrebbero essere distribuiti casualmente intorno allo zero. </li><li> La fluorescenza durata istogramma la frequenza con cui si verificano determinati tempi di vita di fluorescenza contro la vita stessa di fluorescenza. Regolare la gamma di colori in modo tale che la distribuzione durata della fluorescenza si inserisce nella gamma di colori. </li><li> Se un accoppiamento monoesponenziale non produce un valore di chi-quadrato di circa 1 (e fino a 1,3), e vi è una deviazione sistematica dei residui da zero, un modello più sofisticato è richiesto. Ad esempio, vai a montare un modello a doppio esponenziale per i decadimenti fluorescenza, per tenere conto di due diversi ambienti la sonda può essere poll L&#39;adattamento anche dare i pre-esponenziali fattori o ampiezze che danno un&#39;indicazione della quantità relativa di colorante in uno ambientemento o l&#39;altro. In alternativa, una funzione esponenziale allungato può essere opportuno rappresentano una distribuzione di vite fluorescenza. </li><li> I risultati per le durate di fluorescenza, pre-esponenziali fattori, e il rapporto di vita e la pre-esponenziale rapporto fattore per ciascun pixel può essere codificato a colori. Ogni pixel è colorato in base al suo valore, e il contrasto a causa di tempi di vita di fluorescenza, pre-esponenziale dei fattori e dei loro rapporti si ottiene. Anche in questo caso, controllare i ridotti valori di chi-quadrato (che può anche essere codificati a colori e visualizzati sotto forma di immagine) - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui, che devono essere distribuiti casualmente intorno allo zero. </li><li> Istogrammi durata della fluorescenza deve accompagnare tutte le immagini per una visualizzazione semplice dei valori medi di durata della fluorescenza, la distribuzione e la durata della fluorescenza. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Decadimenti di fluorescenza misuratail rotore fluorescente molecolare ad aumentare la viscosità in metanolo / glicerolo miscele sono mostrati nella fig. 2. I decade fluorescenza sono monoesponenziale, e la vita di fluorescenza varia sensibilmente in funzione della viscosità. Aumenta da circa 300 ps in metanolo (0,6 viscosità cP) a 3,4 ns nel 95% glicerolo (viscosità 950 cP). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Profili decadimento Figura 2. Fluorescenza per BODIPY-C 12 in metanolo / glicerolo miscele di viscosità varia 6. Il diagramma di taratura logaritmica della durata della fluorescenza rispetto a τ viscosità η per il rotore fluorescente molecolare è mostrato in fig. 3. Si tratta di una linea retta come richiesto dall&#39;equazione Förster Hoffman 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove k è 0 la radiativvelocità e costante, e Z e X sono costanti, con 0 &lt;x &lt;1. Prendendo il logaritmo su entrambi i lati rese <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> dove x è la pendenza della retta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Figura 3. Un grafico di log fluorescenza viscosità log vs vita per BODIPY C-12 produce una linea retta secondo la Förster-Hoffmann equazione 6. Dopo l&#39;incubazione delle cellule viventi con il rotore fluorescente molecolare una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. FLIM immagini di cellule HeLa incubate con un colorante meso-sostituito BODIPY sono mostrati nella fig. 4. I decade di fluorescenza in ogni pixel dell&#39;immagine può essere adeguatamente montate con un unico modello di decadimento esponenziale. Figura 4. (A) L&#39;intensità della fluorescenza e (b) FLIM immagini di cellule HeLa colorati con BODIPY-C 12. Le luminose regioni puntuate mostrano una vita più breve rispetto ad altre regioni. Questo liftime inferiore corrisponde ad una viscosità più bassa nel puncta, goccioline lipidiche probabilmente, secondo la Förster-Hoffmann equazione. Riportando i tempi di vita estratti da ogni pixel, si ottiene un istogramma di fluorescenza vita dell&#39;intera immagine come mostrato in fig. 5. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Figura 5. Istogrammi di vite fluorescenza da immagini FLIM di cellule HeLa colorati con meso-sostituiti BODIPY rotori molecolari.

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	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

FLIM offre alcuni vantaggi chiave rispetto intensità-based imaging di fluorescenza. Esso può riferire eventi fotofisiche che sono difficili o impossibili da osservare da imaging intensità di fluorescenza, perché può separarli da effetti concentrazione del fluoroforo. Ciò è particolarmente utile per mappare viscosità intracellulare di imaging rotori fluorescenti molecolare. La durata della fluorescenza può essere facilmente convertito in una viscosità utilizzando una curva di taratura, come mostrato in fig. 3, indipendente dalla concentrazione di fluorescenti rotori molecolari. In FLIM ci possono essere artefatti che possono complicare l&#39;interpretazione dei dati. A 10 artefatti strumentali includono luce diffusa, che verrà visualizzato come un picco sopra l&#39;inizio del decadimento di fluorescenza e può essere confuso con un tempo di decadimento breve, o un piccolo picco dopo l&#39; IRF che può essere causato dai riflessi all&#39;interno del microscopio. Questi manufatti leggeri sparsi possono essere identificati come taliperché possono essere distinti con la discriminazione spettrale - sono sempre alla stessa lunghezza d&#39;onda della luce eccitante. Ricordando che in aria, la luce viaggia a 30 cm in 1 nanosecondo aiuta a individuare l&#39;origine di riflessioni. Filtro o di vetro a fluorescenza potrebbe anche causare un artefatto, soprattutto in fluorescenza del campione bassa, ma questo può essere facilmente identificata da prendere una misura in assenza del campione: se un decadimento si ottiene in queste circostanze, è dovuta allo strumento e non ha niente a che fare con il campione! D&#39;altra parte, notare che autofluorescenza campione può inoltre contribuire ad un decadimento fluorescenza. In tempo-correlata conteggio di singolo fotone (TCSPC), tempo-per-ampiezza convertitore (TAC) non linearità può causare convulsioni poveri, ma può essere identificato bloccando l&#39;eccitazione e lucente luce ambientale, ad esempio dalla sorgente di luce trasmessa sul campione e misurando la temporizzazione. Uno sfondo costante deve essereottenuto in ciascun pixel dell&#39;immagine. Regioni in cui deviazioni da uno sfondo costante verificarsi, non cederà mai una buona e dovrebbe essere evitato per la misura, se non può essere eliminato regolando i parametri per la scheda TCSPC. Un artefatto è infame in TCSPC fotone pile-up, che è causato da un tasso troppo alto di rilevamento fotone. 11,12 Questo porta solo al primo fotone che è stato misurato, ignorando qualsiasi fotoni successivi, perché l&#39;elettronica sono i tempi occupati e l&#39;elaborazione del primo fotone. Pile-up porta a un accorciamento della durata di fluorescenza, e il modo migliore per evitare questo è di mantenere il tasso di conteggio di fotoni a circa l&#39;1% del tasso di ripetizione laser. Prospettiva Esistono diverse implementazioni di FLIM, e, a seconda dell&#39;applicazione, ciascuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. 13 Il microscopio a fluorescenza ideale sarebbe acquisire l&#39;intera multidimensionale fluorescenza emission contorno di intensità, posizione, durata, lunghezza d&#39;onda e la polarizzazione in una singola misura, con sensibilità al singolo fotone, la massima risoluzione spaziale e tempo di acquisizione minimo. Non vi è attualmente nessuna tecnologia con questa combinazione unica di caratteristiche, e per costruire uno rimane una sfida per gli sviluppatori di strumentazione. L&#39;applicazione di nuove tecniche fisiche per problemi importanti in biologia cellulare è spesso il percorso di scoperte inattese, e vi è una lunga strada da percorrere prima che siamo vicini a saturare le capacità di imaging di fluorescenza per la biologia cellulare. Infatti, imaging parametri di fluorescenza come durata, spettro e polarizzazione, nonché immagini più rapidamente in 3D a più alta risoluzione spaziale, sono determinate a rivelare nuovi aspetti della biologia cellulare.

Campione con rotori molecolari fluorescenti Hardware: invertito Leica TCS SP2 microscopio confocale a scansione Coherent Mira 900 Ti: Sapphire laser a femtosecondi con un V6 Verdi pompa laser o Hamamatsu PLP-10 470 picosecondo sorgenti pulsate di diodi laser di eccitazione Becker &amp; Hickl SPC 830 bordo in 3GHz, Pentium IV, 1 GB di RAM del computer con Windows XP testa fredda Becker &amp; Hickl PMC100-01 rivelatore basato sulla Hamamatsu H5773P-01 fotomoltiplicatori, montati sulla porta X1 microscopio, o rivelatori ibridi DCC 100 rivelatore di modulo di controllo Software: TRI-2 14 o SPCImage 2,8 da Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

Diffusion è spesso un importante fattore limitante in reazioni chimiche o processi biologici e gioca un ruolo in una vasta gamma di eventi intracellulari. Viscosità è uno dei parametri fondamentali che riguardano la diffusione delle molecole e proteine, e le variazioni di viscosità sono state collegate a malattie e malfunzionamenti a livello cellulare. 1-3 Mentre i metodi per misurare la viscosità bulk sono ben sviluppati, microviscosità immagini ancora una sfida . Mappe di viscosità di oggetti microscopici, come le cellule singole, fino ad oggi sono difficili da ottenere. Viscosità Mapping con tecniche di fluorescenza è vantaggioso perché, simile ad altre tecniche ottiche, è minimamente invasivo, non distruttivo e può essere applicata alle cellule e tessuti viventi. Fluorescenti rotori molecolari vite presentano fluorescenza e rese quantiche che sono una funzione della viscosità del loro microambiente. 4,5 torsione o intramolecolarela rotazione porta al decadimento non-radiativo dal retro stato eccitato allo stato fondamentale. Un ambiente viscoso rallenta la rotazione o torsione, limitare l&#39;accesso a questa non-radiative percorso di decadimento. Questo porta ad un aumento della resa quantica di fluorescenza e la durata della fluorescenza. Imaging vita di fluorescenza (FLIM) di coloranti modificati BODIPY idrofobiche che agiscono come fluorescenti rotori molecolari mostrano che la vita di fluorescenza di queste sonde è una funzione della microviscosità del loro ambiente. 6-8 Un grafico logaritmico della durata della fluorescenza contro le rese viscosità solvente una linea retta che obbedisce l&#39;equazione Förster Hoffman. 9 Questa trama serve anche come un grafico di taratura per convertire vita di fluorescenza in viscosità. Dopo l&#39;incubazione delle cellule viventi con il rotore modificato BODIPY fluorescente molecolare, una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. Il valore di viscosità ottenuto in the puncta in cellule vive è di circa 100 volte superiore a quello dell&#39;acqua e del citoplasma cellulare. 6,7 Time-ha deliberato misure di anisotropia di fluorescenza di correlazione cedere tempi di rotazione in accordo con questi valori microviscosità di grandi dimensioni. Mapping la durata della fluorescenza è indipendente dell&#39;intensità di fluorescenza, e consente così la separazione di concentrazione sonda e effetti di viscosità. In sintesi, abbiamo sviluppato un approccio pratico e versatile per mappare la microviscosità in celle in base a FLIM di rotori molecolari fluorescenti.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l&#39;immagine l&#39;ambiente e l&#39;interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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24.8K Views.  King's College London. Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l'immagine l'ambiente e l'interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...