Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Università di Calgary, sotto una nuova concessione start-up ricercatore al Dr. Ungrin.

NOTA: Piastre Elisa sono disponibili in diversi formati, a seconda dei risultati desiderati. Specifiche nonché le linee guida approssimativi per i numeri minimi e massimi di cellule che devono essere utilizzati con ogni formato sono mostrati nella Tabella 1. I pozzetti più piccoli cono di una punta acuminata, e quindi non vi è alcun limite di dimensione inferiore, anche se la variabilità tra sferoidi diventa più significativo a dimensioni più piccole. Produzione di routine di sferoidi da una media di appena 20 celle ciascuno è semplice 8. La dimensione micropozzetti più grande non è completamente rastremato, tenta quindi di formare sferoidi da un piccolo numero di cellule può causare diversi sferoidi più piccoli in ogni pozzetto. A causa di lievi differenze nelle proprietà di superficie, la preparazione con la soluzione di tensioattivo (punto 1.2) non è un optional quando si utilizza piastre AggreWell 400Ex. Questo protocollo si basa sull&#39;uso di AggreWell 400 piastre - per altri formati consult Tabella 1. Il numero di celle da caricare in ogni pozzetto viene determinato moltiplicando il numero di micropozzetti contiene dal numero di celle da cluster per ogni sferoide. Ad esempio, per generare sferoidi di 1000 cellule a testa, ogni pozzetto deve essere caricato con (1.200 sferoidi volte 1.000 celle ciascuna =) 1,2 x 10 6 cellule. Densità cellulare deve essere calcolata dal momento che le cellule saranno caricati in un volume di 0,4 ml. Quindi per l&#39;esempio di sferoidi formata da 1000 cellule ciascuno, 1,2 x 10 6 cellule in 0,4 ml traduce in una densità di 3 x 10 6 cellule per ml. 1. Micropozzetti prepararci a ricevere le celle <ol><li> Micropiastra sono sterili come previsto, e devono essere rimossi solo dalla confezione in un ambiente sterile come un armadio a flusso laminare biosicurezza. La sterilità deve essere mantenuta durante il protocollo. Sterilità dovrebbe essere compromessa, i pozzetti vengono risterilizzati utilizzando 70% di etanolo in acqua usando l&#39;seguendo passaggi facoltativi. <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% in ciascun pozzetto inutilizzato. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d&#39;aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio. </li><li> Mentre vapore etanolo dovrebbe permeare rapidamente eventuali bolle, se ci sono grandi numeri può essere desiderabile per rimuoverli. Centrifugare per 2 minuti a 2000 x g. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità. </li><li> Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. </li><li> Incubare per 5 min con il coperchio a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare etanolo. Piastra può essere lavato con acqua sterile o PBS per l&#39;uso immediato, o aria essiccata per la conservazione. </li></ol></li><li> Al fine di garantire che le cellule non interagiscono con la superficie dei pozzetti, può essere preparato usando un tensioattivo. In generale èconsiglia di eseguire questo passaggio inizialmente, e successivamente confrontare sferoidi generati con e senza tensioattivi pozzetti rivestite. <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di risciacquo ad ogni pozzetto. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d&#39;aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio. </li><li> Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità. </li><li> Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. </li><li> Incubare per almeno trenta minuti con il coperchio a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. Piastre possono essere conservate a quattro gradi con la soluzione di tensioattivo nei pozzetti fino a quando necessario se adeguatamente sigillato per prevenire l&#39;essiccazione. </li><li> Lavare la piastra con acqua sterile o PBS immediatamente prima dell&#39;uso. Non lasciare le piastread asciugare dopo il rivestimento. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di cellule NOTA: I dettagli della preparazione cellulare variano un po &#39;con il tipo cellulare specifico oggetto di studio. Tuttavia abbiamo osservato queste condizioni per essere efficace con una vasta gamma di cellule, comprese le linee qui discussi, così come le cellule staminali embrionali umane e murine (ESC), le cellule staminali umane pluripotenti indotte (IPSC), fibroblasti, putativo endoderma primitivo, e le cellule stromali. Altri gruppi hanno impiegato con successo questo sistema per una vasta gamma di applicazioni, tra condrogenesi da cellule staminali mesenchimali 9, generazione standardizzata dei precursori neurali da cellule staminali pluripotenti 10, analisi tossicologiche in epatociti 11 e valutazione della rigenerazione del midollo spinale in salamandre 12. Il protocollo specifico per lavorare con le cellule HT29 è mostrato qui. <ol><li> Iniziare con un pallone T75 di cellule HT29, coltivate in DMEM+ 10% FBS </li><li> Aspirare il terreno di crescita dal pallone, e aggiungere 3 ml di tripsina. </li><li> Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. </li><li> Smettere di tripsina digestione con l&#39;aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Prelevare un&#39;aliquota per la conta cellulare e trasferire il resto in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Centrifugare per 5 min a 200 x g. </li><li> Mentre la centrifugazione è in corso, contare le celle. </li><li> Aspirare tripsina / medio impasto e sostituirlo con terreno di coltura fresco, volume determinato dalla densità cellulare richiesto calcolato sopra. </li><li> (OPTIONAL) Passare la sospensione cellulare attraverso un colino per eliminare eventuali grumi. NOTA: condizioni di raccolta delle cellule variano un po &#39;tra le righe. Se un protocollo di dissociazione per es passaging le cellule di interesse è disponibile, che deve essere utilizzato come punto di partenza. Con linee cellulari sensibili uso di tripsina può portare alla morte delle cellule eccessivo. In questi casi abbiamo osservato buoni risultati utilizzando TrypLE come dissociati alternativail reagente 8. Se le cellule diventano clumped durante dissociazione e perdono vitalità, aggiunta di DNAsi alla soluzione enzima può risolvere questo. Ridurre i tempi di dissociazione e impiegando una fase di triturazione per rompere grumi di cellule può anche aumentare la redditività. </li></ol> 3. Formazione Spheroid NOTA: Spheroids possono essere generati in una varietà di formulazioni medie, studi tuttavia iniziali devono essere effettuate utilizzando il mezzo in cui le cellule sono state coltivate, per distinguere conseguenze di transizione a un sistema di coltura 3-dimensionale dalle conseguenze di vestiario composizione media. <ol><li> Aggiungere 0,4 ml di terreno di coltura in ciascun pozzetto. </li><li> Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità prima della centrifugazione. </li><li> Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti. </li><li> Aggiungere 0,4 mlsospensione cellulare alla densità richiesta (calcolata sopra). Mescolare delicatamente pipettando su e giù, senza introdurre bolle d&#39;aria nei pozzetti. È importante garantire che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto, per ottenere sferoidi coerenti. </li><li> Centrifugare per 5 min a 200 x g. Se la piastra non a livello di sé durante la centrifugazione, correnti di convezione possono sorgere quel risultato in distribuzione irregolare delle cellule di tutti i pozzetti. Pertanto, la piastra deve essere bilanciato internamente che contro l&#39;altra piastra, in modo che il peso sia distribuito uniformemente su entrambi i lati della piastra portante. </li></ol> NOTA: Se la prova della distribuzione delle cellule irregolare è visto, può essere necessario applicare una piccola quantità di lubrificante ai punti di articolazione sul carrier plate - consultarsi con il produttore centrifuga per le istruzioni. NOTA: Una volta che le cellule sono state centrifugate nei pozzetti, sono ragionevolmente resistenzatante di dilavamento da movimenti minori della piastra. Movimenti bruschi che provocano sbattimento del mezzo dovrebbero essere evitati, ma il trasferimento della targa dal centrifuga al microscopio o incubatore non dovrebbero comportare lo spostamento delle cellule significativo. <ol start="6"><li> Utilizzando un microscopio invertito, verificare che le cellule hanno cluster all&#39;interno dei pozzetti, e che sono distribuiti uniformemente in tutto il bene. </li><li> Incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Utilizzando un microscopio invertito, osservare il processo di formazione sferoide. Alcune linee di cellule formeranno sferoidi compatti entro 24 ore, altri possono richiedere più tempo. La progressione da cluster per aggregare in cellule HT29 è mostrato in Figura 2. </li><li> Recuperare sferoidi dai pozzetti e trasferire alla cultura sospensione da parte loro getto delicatamente con una pipetta. In alternativa, mantenere sferoidi in situ con medio sostituzione 8 - la durata dipende dalla loro dimensione iniziale e il tasso di crescita, che define il tempo fino a quando non diventano troppo i pozzetti in cui sono stati formati. <ol><li> Per sostituire medio senza perdere sferoidi, medio aspirare al bordo del pozzetto con una pipetta Pasteur. Lentamente portare la punta verso il basso fino a quando non comincia a disegnare liquido dal menisco, e seguire il menisco giù come il prezzo scende. Poi aggiungere mezzo fresco contro il muro ben nello stesso luogo. Qualche sferoidi possono essere persi, se medium è sempre aspirato e sostituito nella stessa posizione, questo numero rimarrà piccolo in confronto ai grandi numeri nel pozzo. </li></ol></li></ol>

<ol>
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D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin ha un interesse finanziario nella tecnologia AggreWell come inventore.

Abbiamo stabilito un sistema in cui un gran numero di sferoidi uniformi possono essere generati da molteplici linee cellulari provenienti da fonti diverse. Dobbiamo ancora incontrare una linea di cellule aderenti, che non costituisce sferoidi in queste condizioni. Abbiamo già osservato perdita di cellule in popolazioni soggette a anoikis 5,8, ma ad oggi il problema non è sorto con le linee tumorali. Il sistema è arbitrariamente scalabile con la superficie, con un comportamento coerente in tutti i pozzetti a 24 pozzetti e il formato 6-bene, così come bioreattori prototipi contenenti 50.000 pozzetti ciascuna attualmente in fase di sviluppo. Dovrebbe sferoide asimmetria essere una preoccupazione, il tempo di incubazione nella fase 4.8 può essere aumentata a due o tre giorni. Sferoidi possono essere incubate per un periodo dopo l&#39;estrazione dai micropozzetti per aumentare simmetria, tuttavia in questo caso deve essere presa cura di mantenere sufficientemente bassa densità di coltura, come sferoidi in contatto tra loro will spesso fondersi in strutture più grandi. Per questo motivo, abbiamo precedentemente mantenuto culture dei pozzetti in cui sono formati gli aggregati, con la limitazione principale è la dimensione dello sferoide. Questo a sua volta è funzione sia del tasso di crescita e dimensione iniziale 8, e se è prevista cultura estesa all&#39;interno della micropiastra, questo dovrebbe essere considerato in anticipo. Opzioni per prevenire la crescita eccessiva, se dovesse verificarsi, comprendono o che iniziano con sferoidi più piccoli, o che utilizzano le più grandi pozzetti della piastra AggreWell 800. In caso di sferoidi riuscire ad aumentare in modo coerente nel corso del tempo, una possibile causa potrebbe essere la morte delle cellule. Soprattutto in grandi aggregati di cellule altamente metabolicamente attive, limitazioni di trasporto di massa sulla fornitura di ossigeno e nutrienti essenziali può produrre un core necrotico 2 - quindi uno sferoide non coesivo può semplicemente essere una conseguenza di morte cellulare eccessivo. In alternativa, le misurazioni della coesione meccanicasione di sferoidi sono stati utilizzati per valutare forze di legame intercellulari, in rapporto al potenziale metastatico di una determinata linea cellulare 13. Sarebbe interessante indagare il rapporto tra forma sferoidale e il potenziale metastatico, magari utilizzando parametri morfometrici come la rotondità e il perimetro di rapporto tra le aree. Oltre a istruire le proprietà meccaniche e morfometrici di sferoidi, il montaggio del sistema micropozzetti permette produzione su larga scala di sferoidi mista composizione, costituito da combinazioni di tipi di cellule e / o biomateriali 6,7. Le interazioni delle cellule tumorali con altri tipi di cellule sono importanti per modellare più da vicino il comportamento dei tumori in vivo 14, in tal modo può essere di interesse per generare sferoidi da cellule tumorali in combinazione con fibroblasti e cellule endoteliali, per esempio. Microparticelle di vari biomateriali possono anche essere incorporati, e possono influenzare SPHproprietà eroid sia direttamente attraverso la loro interazione con le cellule 7,15, e anche come serbatoi per il rilascio controllato di fattori di crescita e citochine nell&#39;interno dello sferoide 16. Se non vi è alcuna preoccupazione per sterilità, ad esempio quando si lavora con una micropiastra in cui sono stati precedentemente utilizzati alcuni pozzi, che possono aver trascorso qualche tempo in un incubatore come parte di un precedente esperimento, i pozzetti possono essere risterilizzati con etanolo al 70% in acqua. Una volta che sono state formate sferoidi, possono anche essere separato dalle cellule non costituite residue passando il sospeso su un colino cellula. Le singole celle passeranno attraverso, mentre verranno mantenuti i sferoidi. Se lo sferoide è sospettato di spargimento cellule metastatiche potenzialmente nel corso della coltura, può essere desiderabile eseguire questa operazione più volte - inizialmente per rimuovere le cellule non registrate, e successivamente per isolare purified popolazioni delle cellule ceduto dai sferoidi.

Vi è un numero crescente di elementi che le cellule tumorali si comportano in modo diverso in tre culture dimensionali di quanto non facciano quando coltivate su plastica, e che gli agenti terapeutici individuati su piattaforme tessuto-coltura convenzionali possono perdere efficacia quando la transizione a un sistema più fisiologicamente rilevanti 1. È pertanto auspicabile studiare il comportamento delle cellule tumorali in queste condizioni, sia per acquisire conoscenze in loro biologia sottostante, e anche per aumentare il tasso di successo di transizione nuovi agenti terapeutici dalla struttura di screening alla clinica. Un sistema modello utile con una lunga storia impiega cluster tridimensionali di cellule tumorali conosciute come sferoidi tumorali 1,2. Idealmente, le tecniche di formazione sferoide consentirebbero produzione di un gran numero di sferoidi uniformi le cui dimensioni e la composizione sono controllati dallo sperimentatore. Mentre si avvicina hanging-drop e ben piastra 3,4 sono in grado di soddisfare alcune di queste rerequisiti, il throughput è generalmente limitata, e la generazione di un gran numero di sferoidi diventa un&#39;attività ad alta intensità di manodopera. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema per risolvere le sfide simili nel campo della medicina rigenerativa 5. Impiegando aggregazione forzata all&#39;interno di una serie di pozzi densamente micron scala (vedi Figura 1), questo approccio consente la generazione di sferoidi da un numero arbitrario di cellule, comprese le miscele di diversi tipi di cellule 6, così come l&#39;integrazione di vari biomateriali 7. Sferoidi sono formate in gran numero - migliaia a centinaia di migliaia o più - e possono essere estratti immediatamente o mantenuti in micropozzetti in cui è stata formata con cambio medio per almeno un 8 a due (osservazioni non pubblicate) settimane. Questo sistema è quindi adatto per la generazione di grandi quantità di uniforme e sferoidi tumorali riproducibili per la valutazione della effectiveness di nuovi agenti antitumorali o indagini biologiche di base.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Sferoidi tumorali sono sempre più riconosciuti come un importante modello in vitro per il comportamento delle cellule tumorali in tre dimensioni. Più fisiologicamente rilevanti di culture aderente fogli convenzionali, ricapitolano più accuratamente la complessità e interazioni presenti nei tumori reali. Per sfruttare questo modello per valutare meglio la biologia del tumore, o l&#39;efficacia di nuovi agenti terapeutici, è necessario essere in grado di generare sferoidi riproducibile, in modo controllato ed in numero significativo. Il sistema AggreWell costituito da un array ad alta densità di micropozzetti a forma di piramide, in cui viene centrifugato una sospensione di cellule singole. I numeri di cellule raggrupparsi a fondo di ciascun pozzetto, e il numero e il rapporto di tipi cellulari distinti coinvolti dipendere solo dalle proprietà della sospensione introdotta dallo sperimentatore. Quindi, siamo in grado di generare sferoidi tumorali di dimensione arbitraria e composizione conle necessità di modificare la tecnologia della piattaforma sottostante. Le centinaia di pozzetti per centimetro quadrato di superficie cultura a sua volta assicurare che i livelli di produzione estremamente elevati possono essere raggiunti attraverso un semplice processo ad alta intensità di nonlabor. Ci aspettiamo quindi che questo protocollo sarà ampiamente utile ai ricercatori nel campo sferoide tumore.

Sferoidi da più linee tumorali di origine anatomiche differenti possono essere facilmente generati e estratti in coltura in sospensione. Figura 3 illustra il controllo di dimensione coerente ottenibile mediante questo metodo, con popolazioni sferoidali altamente uniformi in ciascuna condizione. Evidenti differenze tra linea nel comportamento sono anche visibili, con le cellule tumorali del colon HT29 e le cellule di cancro esofageo TE6 formano sferoidi densamente con confini ben definiti, mentre le cellule tumorali della prostata LNCaP hanno dato luogo a sferoidi meno coerenti con confini irregolari (vedi la discussione per motivi possibili ). Le forze interne più forti degli aggregati più coerenti anche comportato il collasso ad una forma più simmetrica, anche mentre ancora nei pozzetti in cui sono stati formati, mentre gli aggregati LNCaP, in particolare nella dimensione più grande, visibilmente mantengono la geometria quadrato-piramidale della micropozzetti. Il rapporto tra il numero di cellule di ingresso e dei Phys<html> dimensione ical dello sferoide risultante dipenderà da un numero di variabili. Volumi teorici basati sul prodotto del volume per cella e il numero di cellule impiegate possono essere ridotti perdita di cellule, che a sua volta può includere perdita di cellule durante la fase di cella singola sospensione, così come la perdita da eccessivamente piccoli aggregati causa numero insufficiente di vicini di casa, e da troppo grandi aggregati dovuti al trasporto limitazioni e necrosi nel nucleo. Dimensione sarà anche influenzato da qualsiasi proliferazione che possono verificarsi durante il processo di aggregazione. Poiché questi parametri variano da linea cellulare di linea cellulare, se si desiderano sferoidi di specifiche dimensioni fisiche del numero corretto di cellule per introdurre deve essere determinato sperimentalmente. In prima approssimazione, diametro sferoide dovrebbe aumentare con la radice cubo del numero di cellule incorporati - ad esempio un aumento di 8 volte in numero di celle deve comportare un raddoppio del diametro sferoide. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di produzione sferoide. Micropozzetti Il sistema è costituito da una matrice di micropozzetti quadrati-piramidale, serrato (625 per cm 2 per il 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m dimensione), in cui le cellule possono essere centrifugati. Le cellule sono riuniti da pareti laterali inclinate, e le dimensioni dello sferoide risultante è controllata variando la densità della sospensione cellulare impiegata. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Assemblaggio di celle raggruppate in sferoidi. Spheroids sono formate da settecento HT29 cellule ciascuno. Subito dopo centrifugazione (A), le cellule sono liberamente raggruppati nel fondo di ciascun pozzetto. Si noti che i cluster sono uniformemente assorbiti verso il basso a destra in questo caso. Questo è accettabile a condizione dimensioni dei cluster rimangono coerenti attraverso l&#39;array. Se differenze di dimensioni di cluster significativi sono visti da un lato della matrice all&#39;altro, vedi nota nel passaggio 3.5. Dopo incubazione per 24 ore (B), le forze adesive intercellulari hanno causato i cluster di aggregare e formare sferoidi coerenti, che possono poi essere estratti (C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figura 3. Sferoidi generati in micropiastra. Spheroids sono formate da settecento (A, C, E) o millecinquecento (B, D, F), le cellule tumorali del colon HT29 (A, B), le cellule tumorali della prostata LNCaP (C, D) o cellule di cancro esofageo TE6 (E, F). Notare la coerenza di sferoidi entro un preparato, e anche la variazione tra linee cellulari - in particolare gli aggregati LNCaP sciolti, rispetto al HT29 più densamente e cellule TE6. Barra della scala rappresenta 200 micron. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Formato Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Larghezza Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Micropozzetti per cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Micropozzetti per bene </td><td> 1.200 </td><td> 4.700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Cellule minimi per micropozzetti * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Cellule massime per micropozzetti * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Cellule minimi per bene * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Cellule massime per bene * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - il 70% del volume di etanolo (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Risciacquo volume della soluzione (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Volume medio precarico (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - volume di cella di carico (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Numero di cellule per micropozzetti sono solo una approssimazione in quanto questo valore varia a seconda della dimensione delle cellule specifiche utilizzate, e deve essere determinata empiricamente </td></tr></tbody></table> Tabella 1. AggreWell opzioni e modifiche del protocollo.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Vi presentiamo un protocollo per la generazione di numeri di grandi dimensioni (migliaia a centinaia di migliaia) di taglia e sferoidi tumorali uniformi di composizione controllata, utilizzando micropiastra disponibili in commercio.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K Views.  University of Calgary.  Vi presentiamo un protocollo per la generazione di numeri di grandi dimensioni (migliaia a centinaia di migliaia) di taglia e sferoidi tumorali uniformi di composizione controllata, utilizzando micropiastra disponibili in commercio. 

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Ricerca

Bioingegneria

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all&#39;interno di una piattaforma di array Microwell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Produzione di sostanze chimiche da parte di<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Uso di idrolizzato di bambù come alimentazione

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Fabbricazione di microgel di chitosano-genipina a grandezza controllata e priva di emulsioni per applicazioni di ingegneria tissutale

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...