The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS) <ol><li> Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG. Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l&#39;adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente. </li><li> Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per preparare 1 ml del 12,8% (w / v) fase DEX acquosa. </li><li> Soluzioni Vortex entrambi per circa 1 minuto per sciogliere i polimeri nel mezzo. </li><li> Tenere entrambe le soluzioni in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 ora per assicurare dissoluzione e miscele omogenee. Tenere i tappi sopra il livello dell&#39;acqua per evitare la possibilità di contaminazione delle soluzioni dal bagnoacqua. </li><li> Caricare la soluzione fase PEG in una sterile, siringa di plastica e farla passare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron dimensione dei pori per rimuovere le impurità. Nota: Riempire la siringa con la soluzione di PEG, posizionarlo nell&#39;inserto del filtro sopra un tubo conico e usando la forza, spingere lentamente la soluzione attraverso il filtro. È normale che si verifichi resistenza contro il movimento dello stantuffo della siringa. Minor perdita della soluzione polimerica si verifica come parte della soluzione rimarrà nel filtro, ma la concentrazione di polimero non cambierà. </li><li> Pipettare 10 microlitri della soluzione di fase DEX e diluire a 10 ml di mezzo in un tubo separato per provocare 6,4% (w / v) di fase DEX. Aspirare 100 ml di soluzione di fase PEG e versare in una capsula di Petri. <ol><li> Pipettare 0,5 ml di 6,4% (w / v) di fase nella soluzione di DEX fase di PEG. Visivamente confermare successo formazione ATPS osservando una goccia DEX al microscopio. Il confine gocciadovrebbe rimanere visibile, indicando la presenza di due fasi, distinte acquose stabili. </li></ol></li><li> Conservare lo stock acquosa PEG e soluzioni di fase DEX a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: Si raccomanda di soluzioni polimeriche sono preparati freschi prima di ogni esperimento e utilizzati entro 24 ore di archiviazione. </li></ol> 2. Preparazione per la stampa di cancro Spheroids Cellulari <ol><li> Crescere le cellule tumorali di interesse (ad esempio, le cellule MDA-MB-157 cancro al seno) per un 90% -100% confluenti monostrato. Per MDA-MB-157 cellule, usare un mezzo costituito di DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% di antibiotici. <ol><li> Celle di raccolta con un tampone di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore) e caricare la sospensione in una conica da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 173,3 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura completo. </li></ol></li><li> Le celle di carico su un emocitometro e contare di calcolare il numero richiestodi cellule per una densità cellulare sferoidale desiderato. Un monostrato confluente di MDA-MB-157 cellule cresciute in un pallone T75 solito dà ~ 7 x 10 6 cellule. Nota:. Densità cellulare Richiesto per un volume di goccia per generare un singolo sferoide dipenderà dal tipo cellulare 22 Per esempio, una densità di 1,5 x 10 4 o maggiore per MDA-MB-157 cellule è raccomandato in 0,3 ml di fase DEX drop garantire la formazione di un unico sferoide. </li><li> Cellule di centrifugazione per una seconda volta per 5 minuti a 173,3 xg e risospendere in un volume adeguato di terreno di crescita per concentrare la sospensione ad una densità cellulare desiderata. Nota: Ad esempio, se sono state raccolte 7 x 10 6 cellule tumorali, il volume totale della sospensione cellulare richiesta per formare uno sferoide di densità di 1,5 x 10 4 cellule in 0,3 ml DEX fase goccia sarà di 140 microlitri. Tuttavia a causa della diluizione con soluzione di fase DEX nella fase successiva, utilizzare solo 70 ml di mezzo di coltura cellulare per risospendere le cellule. </li><li&gt; Aggiungere alla sospensione cellulare risultante un volume uguale del 12,8% (w / v) Soluzione acquosa fase DEX preparato in 1.2. Per l&#39;esempio di 1,5 x 10 4 cellule di densità sferoidale, 70 microlitri della soluzione di fase DEX viene aggiunto a 70 ml di sospensione cellulare. </li><li> Mescolare bene la sospensione cellulare per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e miscelazione di soluzione DEX. Pipettando su e giù dovrebbe essere fatto con delicatezza per evitare la formazione di bolle. </li></ol> 3. Preparazione per la stampa di Spheroids Co-coltura <ol><li> Crescere cellule tumorali (per esempio, MDA-MB-157 cellule di cancro al seno umano) e le cellule di supporto (ad esempio, fibroblasti umani) ad un 90% -100% confluenti monostrato. Raccogliere ogni tipo di cellula con un buffer di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore). <ol><li> Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media. Nota: Coloranti fluorescenti come calceina AM (macchia cellule vive) e coloranti nucleari (Hoechst) possono essere utilizzati per distinguere i due tipi di cellule. </li></ol></li><li> Caricare ciascun tipo di cellula separatamente su un emocitometro e contarli per calcolare il numero di ciascun tipo di cellula per un rapporto desiderato di cellule tumorali di cellule di supporto in sferoidi co-coltura. Monostrati confluenti di MDA-MB-157 cellule e fibroblasti coltivate in fiasche T75 solito danno ~ 7 x 10 6 e ~ 6 x 10 6 cellule, rispettivamente. </li><li> Aggiungere il volume corretto dalla sospensione di cellule di supporto alle cellule tumorali sospensione invia un rapporto desiderato del numero di due tipi di cellule. Ad esempio, utilizzare un rapporto di 50 cellule tumorali a 1 fibroblasti. </li><li> Centrifugare la conica contenente la sospensione cellulare mista per 5 min a 173,3 XG e risospendere le cellule in un volume adeguato al risultato della densità finale comprendente dei volumi uguali di mezzo di crescita e l&#39;12,8% (w / v) DEX acquosaSoluzione fase (preparato in 1.2). </li><li> Pipettare delicatamente la sospensione cellulare risultante su e giù per assicurare l&#39;omogeneità della sospensione. </li></ol> 4. La stampa di Spheroids tumorali in una piastra a 96 pozzetti <ol><li> Un giorno prima esperimenti, cappotto lastre non trattate, a fondo tondo da 96 pozzetti con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C per 24 ore. Questo rivestimento impedisce l&#39;adesione delle cellule durante il periodo della cultura. </li><li> Pipettare 50 ml di filtrato 5% (w / v) fase acquosa PEG in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (piastra di destinazione). </li><li> Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare (preparata al punto 2 o 3 step per mono e co-coltura, rispettivamente) e aggiungere 20 ml di sospensione di ogni altro bene da una colonna di una piastra 384 pozzetti (targa fonte) . </li><li> Accendere il gestore liquido e &quot;casa&quot; il capo di pipettaggio per registrare le coordinate. Quindi compilare un protocollo già definito (di seguito in 4.6) al fine di garantire da laboratorio e parametri sono definiti correttoly. Questo passo &quot;homing&quot; può essere diverso per i diversi gestori di liquidi. Nota: Il flusso del protocollo, mostrato passo-passo di seguito in 4.6, sarà simile a prescindere dal gestore liquido robotica utilizzato; Tuttavia, l&#39;interfaccia di programmazione può differire a causa dell&#39;uso di diversi software. </li><li> Posizionare la piastra di origine, la piastra di destinazione, e scatole di tip pipetta in posizioni definite sulla workstation del gestore liquido come mostrato in Figura 1. </li><li> Eseguire il protocollo che prevede le seguenti fasi: <ol><li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio del gestore liquido con miscelazione punte per pipette (8 punte) dalla stazione di lavoro (Figura 1). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare in pozzetti della piastra di sorgente (Figura 1). Selezionare un volume di miscelazione inferiore al volume di sospensione cellulare in pozzetti per evitare la formazione di bolle. </li><li> Espellere punte in una scatola discariche vuota (Figura 1). </li&gt; <li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio con 10 microlitri di erogazione punte per pipette (Figura 1). </li><li> Aspirare 0,3 ml di sospensione cellulare dalla piastra sorgente (Figura 1) in ciascuna punta della pipetta. </li><li> Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti di una colonna della piastra di destinazione (Figura 1). Utilizzare un&#39;altezza erogazione di 0,5 mm e una portata di erogazione inferiore a 1 ml / sec. </li><li> Ripetere i passaggi attraverso 4.6.1 4.6.6 finché la stampa di colonna per colonna nella intera piastra destinazione è completa. </li></ol></li><li> Rimuovere con cautela la piastra di destinazione dalla superficie workstation e collocarlo in un incubatore umido a 37 ° C e 5% di CO 2. Mantenere la piastra orizzontale durante il trasporto in incubatrice per evitare di interrompere di DEX gocce fase contenenti cellule. </li><li> Incubare la piastra per 24 ore per permettere l&#39;aggregazione di cellule in uno sferoide all&#39;interno della goccia fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Trattamento farmacologico della Cancer Spheroids Cellulari Si noti che il seguente protocollo è per un trattamento farmacologico 4 giorni e comprende un rinnovamento con farmaco fresco dopo giorno 2. Può essere modificato per altri periodi di trattamento. <ol><li> Confermare visivamente formazione sferoide in piastre da 96 pozzetti dopo 24 ore. Se necessario, pozzi di immagine per la misurazione di dimensioni di sferoidi dalla media dei diametri più piccoli e più grandi di ogni sferoide. </li><li> Preparare la soluzione madre di un farmaco desiderato sciogliendolo in un solvente raccomandato dal costruttore, ad una concentrazione di solubilità predeterminata. Ad esempio, sciogliere cisplatino in acqua a 2 mg / ml. Nota: Proteggere la soluzione madre del farmaco dalla luce, se il farmaco è sensibile alla luce. </li><li> Utilizzando la tecnica di diluizione in serie, preparare concentrazioni di farmaco diluito con mezzo di coltura cellulare dalla soluzione madre preparata nella fase precedente. Ogni diluizione dovrebbe essere fatta due volte la concentrazione desiderata. DilRapporti ution variano a seconda della concentrazione della partenza e desiderata concentrazione di lavoro. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione medicinale preparata nella fase precedente in ciascun pozzetto. Questo può essere fatto tramite macchina o pipettando manuale. Nota: Ogni concentrazione farmaco sarà diluito in mezzo alla concentrazione voluta dal 50 microlitri acquosa fase PEG già in ciascun pozzetto. <ol><li> Utilizzare sferoidi da due colonne di una piastra a 96 pozzetti (n = 16) per ciascuna concentrazione. </li><li> In pozzetti di controllo, aggiungere solo 50 ml di terreno di coltura fresco alle attuali 50 microlitri della fase acquosa PEG. </li></ol></li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li><li> Dopo 48 h di incubazione, preparare diluizioni fresche del farmaco, alle concentrazioni desiderate e rinnovare farmaco aggiungendo 50 ml di soluzione medicinale fresca a ciascun pozzetto. Nota: I pozzi contengono già la concentrazione del farmaco desiderato dal primo farmaco tRATTAMENTO. Pertanto in questa fase di rinnovo, ciascuna concentrazione viene preparata alla concentrazione desiderata in quanto si verificherà alcuna diluizione. </li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per un altro 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li></ol> 6. Analisi della Cellular Viabilità in Spheroids <ol><li> Dopo 48 ore di incubazione con rinnovata farmaco (cioè, il tempo totale del trattamento di sferoidi con un farmaco è 4 giorni), misurare il volume totale del mezzo in un pozzetto pipettando manuale. Nota: il volume tipico in un bene è ~ 140 microlitri (un piccolo calo si verifica a causa di evaporazione). </li><li> Calcolare il volume della cella di reagente vitalità (ad esempio, PrestoBlue) come concentrazione del 10% del volume totale bene. Aggiungere questo volume di reagente vitalità cellulare in ciascun pozzetto. Nota: Con un volume di supporto esistente di 140 microlitri in un pozzo, un volume di 15,6 microlitri è necessaria per ottenere una concentrazione del 10% del totale bene. Questo è calcolatodividendo il volume del supporto esistente 9 (140 ml / 9 = 15,6 ml). </li><li> Incubare la piastra con il reagente vitalità cellulare aggiunti a ciascun pozzetto per 6 ore a 37 ° C, al riparo dalla luce. </li><li> Porre la piastra in un lettore di micropiastra e leggere il segnale di fluorescenza a 560 nm e 590 nm di eccitazione e di emissione, rispettivamente. </li><li> Calcolare la vitalità percentuale di cellule in sferoidi normalizzando il segnale fluorescente da pozzi trattati a quella di pozzetti di controllo dopo la media dei valori delle stesse condizioni di trattamento. </li></ol>

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Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l&#39;efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L&#39;uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una...

Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l&#39;efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l&#39;aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l&#39;analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l&#39;efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l&#39;ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l&#39;ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8 Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l&#39;assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l&#39;incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso. Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l&#39;analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l&#39;incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni. Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L&#39;approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l&#39;analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l&#39;integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l&#39;efficienza (riduzione hands-on tempo). Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l&#39;approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L&#39;immagine mostra l&#39;uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L&#39;intera configurazione è alloggiato all&#39;interno di un armadio standard di sicurezza biolo...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Ricerca

Bioingegneria

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

Sistema di terapia robotica Specchio per il recupero funzionale di emiplegici Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generazione scalabile di sferoidi cellulari uniformi utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo di assemblaggio acustico senza scaffold per colture cellulari sferoidi 3D di alta qualità 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...