La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (FP7/2007-2013) nell&#39;ambito di accordi di sovvenzione n. 228.334 e 241.526. Questo progetto di ricerca è stata sostenuta anche dalla borsa di ricerca Human Frontier Science Program (RGP0027/2009), e dal Ministero italiano dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università e della Ricerca nell&#39;ambito del Flagship Progetto Nanomax e dal Ministero della Salute italiano nel quadro della &quot;Cellule staminali Invito a presentare proposte&quot;. Questa ricerca è stata svolta nel quadro delle attività di ricerca del ICON fondazione supportate da &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Tissue Preparazione e conservazione <ol><li> Fix cervello di topo mediante perfusione transcardial serie 13 con 20 ml di 0,01 M tampone fosfato isotonico (PBS), seguita da 100 ml di paraformaldeide 4% in PBS 0,01 M. Regolare accuratamente il pH di entrambe le soluzioni a 7.6: valori leggermente inferiori del pH possono estinguere la fluorescenza EGFP. </li><li> Post-fissare i cervelli asportati durante la notte in paraformaldeide 4% a 4 ° C. </li><li> Risciacquare due volte (30 min ciascuna) in 0,01 M PBS e conservare in 0.01 M PBS a 4 ° C. </li></ol> 2. Disidratazione e Clearing Nota: il protocollo per la disidratazione e compensazione ricalca quella descritta da Becker et al 10. <ol><li> Per rimuovere perossidi dal solvente disidratazione (tetraidrofurano, THF), che quench fortemente XFP fluorescenza, filtro THF con ossido basico di alluminio attivato (grado di attività I Brockman, circa 250 g / L di THF) utilizzando un chromaTOGRAPHY colonna. Evitare la rottura della colonna, che ridurrebbe rimozione perossido. </li><li> Aggiungere stabilizzatore (butilidrossitoluolo, 250 mg / L) alla soluzione finale, anche se il THF è stato già stabilizzato prima della filtrazione. Stabilizzatore è infatti trattenuto da ossido di alluminio: THF senza stabilizzatore può sviluppare grandi quantità di perossidi e può essere esplosivo e pericoloso. </li><li> Disidratare l&#39;intero cervello di topo in una serie graduata di THF in acqua pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 ora ciascuno, poi 100% di notte. Posizionare il flaconcino con il campione su una ruota girevole. Per evitare l&#39;esposizione alla luce, avvolgere le fiale con un foglio di alluminio. </li><li> Filtrare il solvente di compensazione (dibenzil etere, DBE) con ossido di alluminio (attivato di base, grado di attività Brockman I, circa 250 g / L di DBE) usando un imbuto filtrante. </li><li> Cancellare il campione in 100% DBE. Cambiare la soluzione dopo 3 e 6 ore. </li></ol> 3. Specimen di montaggio <ol><li> Quando il cervello sembra trasparente dell&#39;occhio (tipicacamente 1 ora dopo la seconda modifica DBE), montato a fosfori capovolto da uno dei seguenti metodi: </li><li><ol><li> Montaggio diretto - immergersi delicatamente il campione su una delle punte (Figura 3a). </li><li> Disco agarosio - Immergere un disco fatto di 6% gel di agarosio sulle punte. Fissare delicatamente il campione sul disco agarosio con colla acrilica (Figura 3b). Attendere circa 1 min per la cura. </li><li> Bicchiere agarosio - Immergere un bicchiere fatto di 3% gel di agarosio sulle punte. Posizionare delicatamente il campione sul fondo del bicchiere (figura 3c). </li></ol></li></ol> Nota 1: montaggio in coppa agarosio dovrebbe essere preferito quando è importante l&#39;imaging del campione nel suo complesso, tuttavia, il gel di agarosio che circonda il campione dà luogo alla dispersione della luce supplementare che potrebbe essere dannosa per la qualità dell&#39;immagine. Se una piccola parte del campione potrebbe essere escluso dalle immagini, è preferibile montare la specImen sul disco agarosio o direttamente sulla punta. Il primo metodo è più adatto per mantenere il cervello orizzontale (escluso Dall&#39;imaging una porzione ventrale o dorsale del cervello), quest&#39;ultimo per mantenere il cervello verticale (escludendo Dall&#39;imaging una parte di bulbi olfattivi o del midollo spinale). Nota 2: il gel di agarosio deve essere preparata in acqua, poi disidratato con THF (50% e 100% 4 ore ciascuno) e controllata in DBE 100% per 4 ore o fino a quando appare chiaramente trasparente. <ol start="3"><li> Dopo il montaggio del campione seguendo uno dei metodi precedenti, posizionare la piastra di imaging nella camera campione usando pinzette. Riempire la camera di compensazione soluzione. </li></ol> 4. Tomografia Preparazione <ol><li> Rimuovere la fessura di raccogliere più fluorescenza possibile. </li><li> Illuminare il campione con potenza del laser basso per evitare photobleaching. </li><li> Spostare il campione in tre direzioni utilizzando il microposiziona syste software-drivenm. Identificare per ciascuna direzione minimi e massimi coordinate per cui il campione è illuminato ed è all&#39;interno del campo visivo della telecamera (figura 4a). </li><li> Inserire le coordinate di cui sopra come parametri per la subroutine &#39;Pre-tomografia&#39;. Specificare anche la distanza tra le pile adiacenti da utilizzare nella tomografia, e il passo di campionamento pre-tomografia in direzione z. </li><li> Avviare il pre-tomografia, che raccoglie le immagini di ogni pila con il campionamento z specificato (4.4). </li></ol> Nota: Le immagini raccolte sono utilizzati da un programma per preparare una mappa approssimativa di forma e posizione del campione (figura 4b), che permette di restringere acquisizione tomografia solo al volume effettivamente occupato dal campione, riducendo il tempo di imaging e photobleaching così. 5. Tomografia Acquisition <ol><li> Spostare il campione di fuori del foglio leggero utilizzando il sistema microposiziona. </li><li> Incpotenza del laser rease e fermare il movimento di tutti i sistemi di scansione, in modo da illuminare solo una linea fissa al centro del campo visivo. </li><li> Montare la fessura e allinearlo con segnale di autofluorescenza dalla soluzione di compensazione. Si dovrebbe vedere chiaramente la linea fessura al centro del campo visivo. </li><li> Riattivare il sistema di scansione, riducendo la potenza del laser e spostare il campione all&#39;interno del foglio leggero utilizzando il sistema microposiziona. Si noti che la potenza del laser utilizzato con la fessura sarà superiore a quello utilizzato senza di essa, poiché i blocchi filtro spaziale una frazione non trascurabile della luce. </li><li> Regolare l&#39;ampiezza e l&#39;offset dei sistemi di scansione e di de-scansione con il software di controllo, fino a quando le immagini sembrano chiare e luminose. </li><li> Eseguire il software di acquisizione tomografia, dopo aver impostato il passo z appropriato per l&#39;esperimento. Il volume sarà ripreso in molti parallelo, parzialmente pile sovrapposte (Figura 5a), e le immagini verranno salvate inuna struttura di cartelle gerarchiche. </li></ol> 6. Cuciture e visualizzazione <ol><li> Completa il volume acquisito con le immagini in bianco sintetici (cioè immagini dello stesso tipo e le dimensioni dei raccolti quelli-, ma con intensità pari a zero) utilizzando un software automatizzato (Figura 4c). Questo passo è obbligatorio in modo che il software cuciture per affrontare un volume cubico completo. </li><li> Avviare il software Vaa3D (scaricabile gratuitamente da <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) con i plugin TeraStitcher e TeraManager installati. </li><li> Caricare il plugin TeraStitcher. Selezionare la directory che contiene il volume illustrato, indicare i relativi orientamenti degli assi (rispetto ad un riferimento di mano destra sistema di coordinate) e le dimensioni voxel. </li><li> Avviare la prima parte della cucitura. Il software calcolerà lo spostamento relativo tra le coppie di pile e trovare una collocam ottimale globaleent per tutte le pile insieme (Figura 5b). </li><li> Selezionare per salvare il volume cucita in single-risoluzione o in formato multi-risoluzione. Quest&#39;ultimo consente per la visualizzazione multi-risoluzione con il plugin TeraManager. In entrambi i casi, se l&#39;immagine è più grande risoluzione maggiore di qualche gigabyte, seleziona anche multi-stack Language modalità e specificare la dimensione dei singoli substacks. Ciò consentirà un accesso efficiente ai dati memorizzati. </li><li> Lanciare la seconda parte della cucitura. Il software unire le pile allineate, e salvarli in modalità-stack multi-singola o (Figure 5c e 5d). Alla fine chiudere il plugin TeraStitcher. </li><li> Caricare il plugin TeraManager. Selezionare la cartella con il volume multi-risoluzione multi-stacked, e indicano le dimensioni voxel e assi orientamenti. Il volume viene caricato ad una risoluzione minima. </li><li> Per eseguire lo zoom di una risoluzione più alta, selezionare un punto di riferimento con il pulsante destro del mouse modality di Vaa3D, poi zoomare usando mouse. In alternativa è possibile selezionare direttamente il ROI per zoomare con il tasto destro del mouse, o specificare le coordinate del volume di interesse. </li><li> Per ripristinare risoluzione più bassa, è sufficiente utilizzare lo scroll del mouse. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

CLSM accoppiato con compensazione chimica rappresenta un potente strumento per studiare la neuroanatomia di interi cervelli di topo marcate con sonde fluorescenti, sia proteine ​​o coloranti sintetici. Dato che la luce emessa al di fuori del piano focale è bloccato da un filtro spaziale fisica, imaging a contrasto elevato è possibile anche in campioni di spessore, mantenendo gli elevati tassi di frame tipici dell&#39;architettura foglio leggero. Il problema principale da affrontare quando usando i metodi descritti è la massimizzazione del contrasto. Infatti, il segnale disponibile è ridotto sia da fattori chimici e ottici. Dal punto di vista chimico, le procedure di compensazione sulla base solvente organico possono saziare emissione da proteine ​​fluorescenti ed altri coloranti fluorescenti 7. Filtrazione del solvente per rimuovere perossidi, come descritto da Becker et al. 10, consente di mantenere un buon livello di fluorescenza anche in tessuti solvente eliminato. PubblicareED all&#39;acqua metodi di compensazione 14 non riducono l&#39;efficienza di fluorescenza, ma causare un deterioramento della trasparenza quando si tratta di interi cervelli murini, almeno con tecniche ottiche lineari. D&#39;altra parte, al momento non sono presenti obiettivi commerciali con lunga distanza di lavoro corretti per l&#39;elevato indice di rifrazione (n ≈ 1,56) compensazione soluzioni utilizzate. Pertanto, la mancata corrispondenza tra indice di rifrazione del mezzo in cui il campione viene immerso e la progettazione uno degli obiettivi consente una forte aberrazioni sferiche. Oltre a ridurre la risoluzione del microscopio, tali aberrazioni determinano una goccia di intensità dell&#39;immagine e contrasto, poiché la luce viene diffusa su un&#39;area più ampia. Le possibili soluzioni a questo problema includono l&#39;uso di ottiche adattive 15 e / o correttori asferiche statiche. Qualsiasi miglioramento del contrasto dell&#39;immagine e l&#39;intensità colpisce facilmente anche velocità di esposizione, da una breve neitempo grazione per immagine può essere scelto. Al momento CLSM può permettersi una velocità di esposizione di circa 10 6 micron 3 / sec, con un tempo di esposizione di fotocamera 100 msec 9. A questa velocità richiede da 1-3 giorni a immagine di un intero cervello di topo, a seconda delle dimensioni del campione. Anche se nessun degrado significativo della qualità dell&#39;immagine è osservato nel corso di tale lunga sessione di imaging, soprattutto a causa della bassa photobleaching intrinseca della luce di illuminazione foglio 6, il tempo necessario per una singola immagine di cervello di topo potrebbe in pratica ridurre l&#39;applicabilità del CLSM. Un aumento di 10 volte in efficienza del sistema, accoppiato con l&#39;uso di una telecamera ad alta velocità per il rilevamento, ridurrà tempi imaging per diverse ore, consentendo un uso di routine del protocollo descritto. Nonostante tutti i limiti sopra indicati, CLSM immagini accoppiato alla compensazione chimica di tessuti permette di ricostruire interi cervelli di topi con risoluzione micron scala in meno di unsettimana. Altri metodi ottici per tutta imaging cerebrale permettersi risoluzione superiore rispetto CLSM, ma al prezzo di preparazione e / o al tempo di imaging 2-4, o di un z campionamento ridotto 5. I metodi descritti in questo articolo possono essere utilizzati in combinazione con diverse strategie per l&#39;etichettatura fluorescente: animali transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in sottogruppi selezionati neuronali, trasfezione virale, iniezione colorante intraparenchimale, ecc In pratica, tutte le strategie di colorazione precedenti sacrificio animale sono compatibili con CLSM . Infatti, marcatura fluorescente post-mortem di intere cervello di topo non è stata dimostrata fino ad ora, in ogni caso, se tale genere di colorazione sarebbe possibile in un prossimo futuro, il numero di campioni che possono essere ricostruite con CLSM diventerà molto più grande, potenzialmente comprese tessuto cerebrale umano. In conclusione, la microscopia confocale foglio leggero usato in combinazione con tiscompensazione Sue e la gestione dei dati multi-risoluzione possono consentire ai ricercatori di ricostruire e analizzare campioni macroscopici con una risoluzione nella scala micron, con gli sforzi tecnologici che sono ben al lato della maggior parte dei laboratori. Le applicazioni potenziali di CLSM sono naturalmente non limitato alle neuroscienze, ma si estende tutti i campi di ricerca in cui è già stato utilizzato la microscopia foglio leggero, come l&#39;embriogenesi 16,17 e anatomia degli animali di piccola taglia 18.

Rispetto alla nostra comprensione della funzione del cervello sottostante meccanismi molecolari e cellulari, la nostra conoscenza della neuroanatomia ammenda appare ancora nella sua infanzia 1. In realtà, ci manca ancora mappe complete della posizione di somata neuronale o di proiezioni a lungo raggio in tutto il cervello. In realtà, molti sforzi tecnologici sono dedicati a ricostruire il cervello di topo con una risoluzione microscopica. Metodi ottici basati sulla sezionamento seriale di campioni di resina-embedded, come la scansione Knife-Edge Microscopy (KESM) 2, Micro-Ottica Sezioni Tomografia (MOST) 3 e fluorescenza-MOST (fMOST) 4, in grado di fornire sub-micron di risoluzione tridimensionale immagini di interi cervelli del mouse. Tuttavia, il tempo totale necessario per la preparazione e l&#39;imaging di un singolo campione è dell&#39;ordine di diverse settimane, limitando l&#39;applicazione pratica di tali metodi. Un&#39;altra tecnica basata sulla sezionamento seriale (ma senza resina incasso), Serial Two-Fotone tomografia (STP) 5, permette alta risoluzione imaging tridimensionale. Tuttavia, questa tecnica è stata dimostrata in tutto il cervello di topo solo con un campionamento molto scarsa, la raccolta di 1 punto ogni 50 micron 5, e la nostra conoscenza STP non hanno ancora prodotto una ricostruzione completa campionamento di un cervello murino. Un metodo ottico all&#39;avanguardia per ricostruire esemplari interi in tre dimensioni ad alta velocità è luce microscopia foglio 6. In questo schema ottico il campione viene illuminato con un sottile foglio di luce e l&#39;emissione di fluorescenza viene raccolto lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione. In questo modo solo i fluorofori a fuoco sono eccitati ed è possibile raggiungere sezionamento ottico in configurazione a grande campo, garantendo elevati frame rate. Quando accoppiato alla compensazione protocolli basati sulla sostituzione di acqua con un indice di rifrazione corrispondente liquido 7, microscopia foglio leggero è stato applicato aI campioni macroscopici, come interi del mouse cervelli 8. Tuttavia, campione indotta dispersione della luce che colpisce esemplari anche eliminato, degrada il foglio leggero porta alla eccitazione di out-of-focus fluorofori che aggiunge una generale sfocatura alle immagini acquisite. Per raccogliere in modo selettivo solo i fotoni in-focus, abbiamo recentemente accoppiati luce di illuminazione foglio ad una schema di rilevamento confocale 9. In confocale microscopia ottica foglio (CLSM), out-of-focus e fotoni dispersi sono respinti da un filtro spaziale lineare (fessura) prima rilevazione (Figura 1). Per ottenere un funzionamento confocale in architettura foglio leggero, l&#39;illuminazione è prodotta per mezzo di una linea di scansione, e un sistema di de-scansione nel percorso di rilevamento crea un&#39;immagine statica della linea di scansione di eccitazione nella posizione della fessura. Un terzo sistema di scansione ricostruisce una immagine bidimensionale sul sensore fotocamera. CLSM offre un miglioramento del contrasto al 100% nel topo eliminatocervelli rispetto alla microscopia convenzionale foglio leggero, pur mantenendo una frequenza 10 Hz telaio. Con CLSM è possibile ricostruire interi cervelli di topi con risoluzione di 2 micron di XY e 9 micron di Z, e con un contrasto sufficiente per discernere neuroni singolo fluorescente. In questo articolo descriviamo il gasdotto sperimentale per ricostruire un cervello di topo con CLSM. Mouse cervello aldeide-fisso sono disidratati in una serie graduata di tetraidrofurano senza perossido e successivamente abilitati senza perossido dibenzil etere (Figura 2), seguendo il protocollo sviluppato da Becker et al. 10 Il campione viene poi accuratamente eliminato montato su un capovolto piatto e posizionato nella camera di imaging di un microscopio confocale foglio leggero su misura. Il campione può essere montato direttamente immergendolo su una punta della piastra (figura 3a), in alternativa può essere incollato su un disco di gel di agarosio eliminato (Figura3b) o posto nella cavità di un becher in gel di agarosio eliminato (figura 3c). Viene quindi eseguita una tomografia ottica dell&#39;intero cervello, come molti stack paralleli adiacenti sono acquisiti a coprire tutto il volume del cervello (Figura 4). Un campione pre-tomografia, che produce una mappa approssimativa del posto del campione e la forma, garantisce che l&#39;imaging viene eseguita solo nel volume occupato dal campione. Gli stack di tomografia vengono successivamente cuciti insieme con un software su misura e salvati in un multi-risoluzione schema gerarchico 11. Cervelli del mouse possono eventualmente essere esplorate con prototipale software multi-risoluzione di visualizzazione di Google Maps-like. Entrambi questi strumenti software sono integrati come plugin nella piattaforma open-source Vaa3D 12. Mostriamo infine immagini rappresentative di cervello di topo per dimostrare le capacità del gasdotto sperimentale descritto nello studio di multa neuroanatom murinoy.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Capire l&#39;architettura del cervello dei mammiferi a risoluzione singola cellula è uno dei temi chiave delle neuroscienze. Tuttavia, la mappatura soma neuronale e proiezioni in tutto il cervello è ancora difficile per le tecnologie di imaging e gestione dei dati. Infatti, i volumi macroscopici devono essere ricostruito con alta risoluzione e contrasto in un tempo ragionevole, producendo set di dati della gamma TeraByte. Abbiamo recentemente dimostrato un metodo ottico (microscopio confocale foglio leggero, CLSM) in grado di ottenere la ricostruzione micron scala di interi cervelli di topo marcate con la proteina fluorescente verde (EGFP). La combinazione di illuminazione foglio leggero e rilevazione confocale, CLSM permette l&#39;imaging in profondità esemplari eliminato macroscopiche con elevato contrasto e velocità. Qui si descrive il gasdotto sperimentale completa per ottenere immagini complete e leggibili di interi cervelli di topo marcate con proteine ​​fluorescenti. La compensazione e il p di montaggioROCEDURE sono descritte, insieme con la procedura per eseguire una tomografia ottica su tutto il suo volume acquisendo molti stack paralleli adiacenti. Abbiamo mostrato l&#39;utilizzo di open-source strumenti software personalizzati che consentono cuciture dei più stack e la navigazione dei dati multi-risoluzione. Infine, abbiamo illustrato alcuni esempi di mappe cerebrali: il cervelletto di un topo transgenico L7-GFP, in cui tutte le cellule di Purkinje sono selettivamente etichettati, e tutto il cervello di un topo Thy1-GFP-M, caratterizzato da un casuale etichettatura neuronale sparse.

Il protocollo descritto può essere utilizzato per ricostruire con micron scala risoluzione sia interi cervelli del mouse o parti asportate, senza la necessità di sezionamento fisico. Come risultato rappresentativo, in figura 6 è mostrato l&#39;intero cervelletto di un mouse L7-GFP (giorno postnatale 10). In questo animale tutti i neuroni di Purkinje sono etichettati con EGFP. Se si ingrandisce, la tipica struttura lamellare della corteccia cerebellare può essere visto (Figura 7). Ulteriore zoom consente di distinguere chiaramente ogni soma delle cellule di Purkinje (Figura 8). Il protocollo descritto può quindi essere usata per selezionare organizzazione spaziale neuronale in vari studi sviluppo neurologico. Come secondo risultato rappresentativo, vi presentiamo le immagini dal cervello non sezionato di un adulto Thy1-GFP-M mouse. In questo animale transgenico EGFP è espresso in un sottoinsieme casuale neuronale sparse. La metà destra del cervello viene mostrato nella Figura 9. Come noizoom-in ulteriormente e in seguito (figure 10 e 11), processi neuronali diventano distinguibili. Questo risultato dimostra che il protocollo descritto permette la risoluzione micron scala imaging intere cervello di topo adulto, aprendo la possibilità di studiare anatomia tutto il cervello a risoluzione cellulare in modelli murini di malattie neurodegenerative. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figura 1. Schema ottico del microscopio confocale luce foglio (CLSM). (A) Vista superiore dell&#39;apparecchio, mostrando il percorso di eccitazione. Emissione laser da uno stato solido (DPSS) laser a diodo pompato 488 nm, dopo l&#39;espansione e la collimazione da un primo telescopio, entra in un filtro accordabile acustoottico (AOTF) che regola l&#39;intensità del fascio. Poi, un secondo telescopio espande ulteriormente il fascio. Uno specchio galvo verticale (lungo y) esegue la scansione sia<html> am, che viene focalizzata da una lente all&#39;interno della camera campione. (b) vista laterale dell&#39;apparecchiatura, che mostra il percorso di rilevamento. Luce raccolta dall&#39;obiettivo rilevamento è verticalmente descanned da uno specchio galvo e focalizzata da una lente, producendo un&#39;immagine fissa della linea di eccitazione movimento. Alla posizione dell&#39;immagine fissa un filtro spaziale lineare (fessura) è collocato. Dopo la fessura, uno specchio galvo posta all&#39;interno di un sistema di lenti 4f ricostruisce un&#39;immagine 2-dimensionale sul chip di un dispositivo ad accoppiamento di carica-elettroni moltiplicando (EM-CCD). Un filtro passa-banda fluorescenza rimuovere tutta la luce di eccitazione diffusa prima del rilevamento. I raggi rappresentativi di eccitazione, rilevazione e luce di rilevamento banda passante filtrata sono raffigurati dai, raggi di luce blu e verde blu, rispettivamente. Sono indicate le lunghezze focali di tutti gli obiettivi effettivamente utilizzati nel microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figura 2. Compensazione dei campioni. Cervelli del mouse formaldeide-fisso, che sono memorizzati in PBS 0,1 M a 4 ° C (a), sono disidratati in una serie graduata di tetraidrofurano (THF, b) e successivamente controllata in 100% dibenzil etere (DBE , c). La fase di disidratazione provoca anche qualche restringimento dei tessuti. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figura 3. Montaggio del campione per l&#39;imaging CLSM. Il cervello azzerato può essere immerso direttamente sulla piastra di montaggio capovolto (a), incollato su un disco agarosio eliminato (b), o inserita in un becher eliminato agarosio (c). Figura 4. Acquisizione tomografia. I pre-tomografia campioni di routine un parallelepipedo contenente il cervello (a) definire il numero e la lunghezza delle pile adiacenti paralleli necessari per vedere tutto il campione (b). Dopo tomografia, immagini nere vengono generate per completare il volume virtuale acquisito ad un parallelepipedo (c). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figura 5. Volume cuciture. L&#39;immagine raccolti impila sovrappongono parzialmente tra loro (a), permettendo loro allineamento preciso con il plug TeraStitcher (b). Il plugin poi unisce le pile allineate in un unico stack (c) o multi-stacked (d) la rappresentazione multi-risoluzione. <img alt="Figura 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figura 6. Tutta cervelletto di un topo P10 L7-GFP, in cui tutti i neuroni di Purkinje sono etichettati con EGFP. Bar Scala, 1 mm. <img alt="Figura 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figura 7. Zoom-in di una porzione del cervelletto mostrato in Figura 6, che mostra la tipica struttura lamellare della corteccia cerebellare. Bar Scale, 500 pm. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figura 8. Ulteriore zoom-in di una porzione del cervelletto mostrato in Figura 6. Purkinje cellule soma può essere chiaramente distinguereed. Barra della scala, 200 micron. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figura 9. La metà destra del cervello di un topo adulto Thy1-GFP-M, caratterizzato da una scarsa aspecifica etichettatura EGFP neuronale. Bar Scala, 1 mm. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figura 10. Zoom-in di una porzione del mezzo cervello mostrato in Figura 9, che mostra parte dell&#39;ippocampo e della corteccia. Bar Scale, 200 micron. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figura 11. Ulteriori zoom-in di una porzione del mezzo cervello illustrato nella Figura 9. Diversi neuriti nella corteccia possono essere chiaramente distinti. Barra della scala, 50 pm.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

In questo articolo descriviamo la procedura sperimentale piena di ricostruire, con alta risoluzione, l&#39;anatomia del cervello multa di cervello di topo fluorescente. Il protocollo descritto prevede la preparazione del campione e di compensazione, il campione di montaggio per l&#39;imaging, i dati post-processing e la visualizzazione multi-scala.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Views.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  In questo articolo descriviamo la procedura sperimentale piena di ricostruire, con alta risoluzione, l'anatomia del cervello multa di cervello di topo fluorescente. Il protocollo descritto prevede la preparazione del campione e di compensazione, il campione di montaggio per l'imaging, i dati post-processing e la visualizzazione multi-scala. 

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Ricerca

Neuroscienze

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Allineamento del fibrogramma OCT della retina del topo con immagini confocali

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autore in primo piano: Progressi nell'imaging retinico in vivo ed ex vivo per migliorare la diagnosi e il trattamento del glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...