Questa metodologia combina il miglioramento del protocollo di clearing con la capacità oculare di sezionamento ottico della tecnologia PIM Mesos permettendoci di eseguire ricostruzioni meso scopiche a risoluzione micrometrica. Offre la possibilità di visualizzare tessuti cardiaci massicci o interi cuori di topo intera soluzione in un'unica scansione senza perdere l'organizzazione tridimensionale originale del tessuto. Dopo che il cuore è stato incannulato mediante aorta prossimale lavata in soluzione di tiro e fissata in aldeide paraforme al 4% in PBS molare 0,01 è pronto per iniziare il protocollo di pulizia.
Lavare il cuore tre volte in 0,01 molare PBS a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS e 0,01% azide di sodio a quattro gradi Celsius per diversi mesi. Incubare il cuore in 20 millilitri di soluzione di idrogel in condizioni di agitazione a 15 RPM per tre giorni a quattro gradi Celsius.
Degassare il campione a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore, una pompa per vuoto e un sistema di tubi che collega l'essiccatore sia alla banda della pompa che alla tubazione dell'azoto. Introdurre il campione nell'essiccatore e aprire il flaconcino mantenendo il tappo su di esso. Chiudere l'essiccatore e rimuovere l'ossigeno dal tubo aprendo la tubazione dell'azoto.
Accendere la pompa per vuoto per rimuovere l'ossigeno dall'essiccatore per 10 minuti. Spegnere la pompa e aprire la manopola dell'essiccatore alla tubazione dell'azoto. Quindi aprire il rubinetto dell'azoto.
Una volta che la pressione è uguale alla pressione atmosferica, aprire con attenzione l'essiccatore e chiudere rapidamente il flaconcino. Mantenere il cuore nella soluzione di idrogel degasato a 37 gradi Celsius per circa tre ore a riposo. Quando l'idrogel è correttamente polimerizzato e appare interamente gelatinoso, rimuovere con cura il cuore da esso e metterlo in una soluzione di compensazione nella fiala con soluzione di pulizia.
Cambiare la soluzione di pulizia nel flaconcino una volta ogni tre giorni per accelerare la procedura di chiarificazione. Una volta che il cuore appare completamente chiarito, rimuoverlo dalla fiala e lavarlo in 50 millilitri di PBS riscaldato per 24 ore in condizioni di agitazione. Lavare nuovamente in 50 millilitri di un X PBS T per 24 ore in condizioni di agitazione.
Incubare il campione in 0,01 milligrammi per millilitri di germe di grano aglutinina Alexa piano 633 in tre millilitri di un X PBS T in condizioni di agitazione a 50 RPM a temperatura ambiente per sette giorni. Dopo l'incubazione di sette giorni, lavare il campione in 50 millilitri di un X PBS T a temperatura ambiente agitando per 24 ore. Incubare il campione in 4% PFA per 15 minuti e poi lavarlo tre volte in 0,01 molare PBS per cinque minuti ciascuno.
Incubare il cuore successivamente in 20 e 47% TDE in 0,01 molare PBS per otto ore ciascuno. E infine al 68% TDE in 0,01 molari PBS per fornire l'indice di rifrazione richiesto di 1,46. Riempire delicatamente circa l'80% del quvet di quarzo esterno con il mezzo dell'indice di rifrazione.
Riempire il quvet di quarzo interno con lo stesso mezzo di indice di rifrazione. Immergere il campione all'interno del quvet interno. Spostare delicatamente il campione sul fondo del quvet usando una pinzetta sottile e disporre il cuore con il suo asse longitudinale parallelo all'asse principale del quvet per ridurre al minimo il percorso della luce di eccitazione attraverso il tessuto durante la scansione.
Fissare con cura il tappo su misura sopra il quvet interno con due viti. Montare il campione sullo stadio del microscopio usando i magneti. Traslare manualmente lo stadio di campionamento verticale per immergere il quvet interno in quello esterno.
Accendere la sorgente luminosa di eccitazione con una lunghezza d'onda di 638 nanometri e impostarla a bassa potenza nell'ordine di tre milliwatt. Spostare il campione utilizzando il traduttore motorizzato per illuminare una piastra interna del tessuto. Accendere il software della telecamera live dell'immagine HC e impostare il trigger della telecamera sulla modalità foglio luminoso del trigger del bordo esterno per pilotare il trigger di acquisizione della telecamera tramite il software personalizzato che controlla l'intera configurazione.
Abilitare il salvataggio automatico nel software della fotocamera e impostare la cartella di output in cui è necessario salvare le immagini. Regolare manualmente la posizione del campione nel piano X Y con i traslatori lineari per spostare il campione al centro del campo visivo del sensore della fotocamera. Spostare il campione lungo l'asse Z utilizzando il traduttore motorizzato lineare per identificare i bordi del cuore per la ricostruzione tomografica.
Aumentare la potenza del laser a circa 20 milliwatt prima di iniziare la sessione di imaging. Avviare l'acquisizione tomografica facendo clic sul pulsante Start nel pannello di acquisizione del software di imaging e allo stesso tempo iniziare a spostare il campione lungo l'asse Z alla velocità costante di sei micrometri al secondo utilizzando il traduttore motorizzato. La combinazione della metodologia di chiarezza con TDE come mezzo di indice di rifrazione non modifica significativamente il volume finale del campione né porta a una deformazione isotropa del campione.
L'ottica di eccitazione ha prodotto un foglio luminoso con uno spreco minimo di circa sei micrometri che divergeva fino a 175 micrometri ai margini del campo visivo. La sincronizzazione della telecamera rolling shutter con la scansione assiale degli scarti del foglio luminoso ha permesso di raccogliere il segnale di emissione solo nella porzione di campione eccitata con lo scarto del foglio luminoso risultando in una media F W H M di circa 6,7 micrometri lungo tutto il campo visivo. La funzione di diffusione del punto Z del microscopio è stata stimata anche da una ricostruzione tomografica della nanosfera fluorescente e un F W H M di 6,4 micrometri è stato stimato dal fit.
È stata inoltre confermata la potenzialità del sistema di risolvere singole membrane cellulari in tre dimensioni con un sufficiente rapporto segnale/rumore nell'intero organo. La procedura di degassamento è la fase più critica del protocollo. Se non viene eseguito correttamente, il tessuto potrebbe subire danni durante l'incubazione in una soluzione detergente.
Il protocollo presentato può essere combinato con un protocollo multi colorazione per ottenere una ricostruzione dell'intero organo integrando diverse strutture biologiche e può essere applicato allo studio di modelli patologici.
