Con circa 100 milioni di cellule nel cervello del topo e dimensioni delle immagini con risoluzione cellulare dell'intero cervello che si avvicinano alla scala dei terabyte, sono necessari strumenti avanzati di analisi delle immagini per quantificare con precisione le cellule. La nostra pipeline computazionale può preelaborare le immagini e quantificare i nuclei all'interno della corteccia del topo, mantenendo un ragionevole compromesso tra accuratezza del rilevamento cellulare, tempo di imaging e risorse computazionali. A dimostrare la procedura saranno Felix Kyere e Ian Curtin, studenti laureati del mio laboratorio.
Per iniziare, montare il campione nel supporto della dimensione del campione corretto in modo che il campione sia orientato con la dimensione z non superiore a 5,2 millimetri di profondità a causa della distanza di lavoro nominale del microscopio UltraMicroscope II. Quindi inserire il supporto nella base del campione in modo che la vite del supporto sia inclinata di 45 gradi rispetto ai supporti della culla. Quindi, posizionare la culla in una posizione tale che il campione sia orientato perpendicolarmente al percorso della luce.
Successivamente, impostare il corpo dello zoom sul microscopio su un ingrandimento 4x o superiore, ottenendo 0,75 micrometri per pixel. Nel software Inspector Pro, selezionare un singolo foglio luminoso con un valore numerico di apertura di circa 0,08. Per garantire che la risoluzione assiale venga mantenuta lungo la larghezza dell'immagine, selezionare Messa a fuoco dinamica orizzontale e applicare il numero consigliato di passaggi a seconda della lunghezza d'onda del laser.
Quindi regolare la messa a fuoco fine per ciascun canale rispetto al canale di registrazione e la potenza laser per canale rispetto alle proprietà del canale. Quindi, regolare la larghezza del foglio luminoso a circa il 50% per garantire che la potenza del foglio sia distribuita in modo ottimale nella dimensione y per la dimensione del campione. Successivamente, impostare il numero di riquadri rispetto alle dimensioni del campione con una sovrapposizione consigliata del 15% tra i riquadri e acquisire immagini per ciascun canale in sequenza per ogni pila in una determinata posizione del riquadro.
Innanzitutto, scarica e installa il gestore dell'ambiente Conda per Linux e gli strumenti di elaborazione delle immagini NuMorph. Nella riga di comando, esegui matlab e NM_setup. m da NuMorph per scaricare e installare i pacchetti software di analisi delle immagini necessari per l'analisi.
Quindi specificare i nomi dei campioni, le directory di input e output, le informazioni sul canale e i parametri di imaging del foglio luminoso modificando il file NM_samples.m. Per la regolazione dell'intensità, in NMp_template, impostare la regolazione intensa su true e use_processed_images come false quando si lavora con un nuovo set di immagini. Quindi, imposta save_images e save_samples come true.
Quindi, impostare l'ombreggiatura delle piastrelle su base per applicare la correzione dell'ombreggiatura utilizzando l'algoritmo di base o manuale per applicare la correzione dell'ombreggiatura delle piastrelle utilizzando le misurazioni di UltraMicroscope II a specifiche larghezze del foglio di luce. Per l'allineamento del canale immagine, in NMp_template, impostare channel_alignment su true e alignment_method canale su traslazione o elastici. Quindi, impostare sift_refinement come true e il valore di sovrapposizione di 0,15 per far corrispondere le sovrapposizioni dei riquadri durante l'imaging.
Per eseguire le fasi di pre-elaborazione in MATLAB, specificare il nome del campione e impostare la configurazione su NM_config esempio di processo. Quindi eseguire uno dei passaggi di pre-elaborazione specificando NM_process punto di configurazione specificando lo stage utilizzando intensità, allineamento o punto e controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi. Inizia con un'immagine dell'Atlante 3D e un'immagine di annotazione associata che assegna ogni voxel a una particolare struttura.
Allineare sia l'immagine dell'Atlante che il file di annotazione per assicurarsi che corrispondano correttamente con il giusto orientamento. Dopo l'allineamento, elaborare i file in NuMorph per specificare gli input come descritto nel manoscritto eseguendo il comando. In NMa_template, imposta resample_images su true e resample_resolution in modo che corrispondano all'Atlante.
Quindi specificare il numero del canale da ricampionare utilizzando resample_channels. Successivamente, impostare register_images su true, specificare il atlas_file che deve corrispondere al file nella directory Atlas e impostare registration_parameters come predefinito. Quindi impostare save_registered_images su true.
Per il rilevamento dei nuclei, il conteggio delle cellule e la classificazione, impostare sia count_nuclei che classify_cells come true. Quindi impostare il count_method su 3dunet e min_intensity per definire una soglia minima di intensità per gli oggetti rilevati. Successivamente, impostare classify_method su una soglia basata su un'intensità di fluorescenza non supervisionata nelle posizioni del centroide, o SVM che modella un classificatore di macchine vettoriali a supporto lineare supervisionato.
Per eseguire i passi di analisi in MATLAB, specificare il nome del campione e impostare la configurazione per NM_config analizzare il campione. Quindi, eseguire uno qualsiasi dei passaggi di analisi specificando NM_analyze fase di configurazione specificando la fase utilizzando il ricampionamento, il registro, il conteggio o la classificazione e controllare la directory di output per i file di output per ciascuna fase. In NMe_template, imposta update su true e compare_structures_by su entrambi gli indici.
Quindi impostare il file modello e la tabella della struttura che specifica tutti i possibili indici di struttura e strutture da valutare specificando il conteggio delle celle e la classificazione del tipo di cella. La pulizia dei tessuti utilizzando il protocollo iDISCO + e marcatori nucleici specifici dello strato neuronale ha portato a gruppi cellulari chiaramente definiti di neuroni dello strato superiore e inferiore nell'isocorteccia. Il conteggio delle celle utilizzando NuMorph dipendeva dal successo delle fasi di pre-elaborazione che coinvolgevano la regolazione dell'intensità, l'allineamento dei canali e lo stitching.
Tuttavia, gli errori nelle fasi di pre-elaborazione potrebbero causare cuciture improprie, con conseguente allineamento e cucitura impropri e, quindi, ottenere immagini con motivo a fuoco e fuori fuoco. Per contare i nuclei di specifiche regioni del cervello, le immagini cucite saranno annotate utilizzando Atlas, consentendo di sovrapporre annotazioni alle regioni del cervello. I centroidi dei nuclei sono stati rilevati con un modello U-Net 3D addestrato in NuMorph con circa 12 milioni di nuclei totali che erano TO-PRO-3-positivi nell'isocorteccia con circa 2,6 milioni di nuclei cerebrali-due positivi e 1,6 milioni CTIP2-positivi.
Sono stati rilevati rispettivamente circa 3,7 e 2,9 milioni di nuclei totali TO-PRO-3-positivi nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale. Tuttavia, le cellule cerebrali due positive rilevate in queste due regioni cerebrali erano trascurabili e solo circa 1,5 in meno di un milione di cellule CTIP2-positive sono state rilevate ciascuna nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale. Eseguire controlli di qualità visiva durante l'acquisizione per ottenere una buona segmentazione.
E impostare correttamente l'ambiente Conda per garantire che non si verifichino errori in un'analisi a valle. Oltre al conteggio delle cellule, questa pipeline consente l'integrazione con altri strumenti di segmentazione che misurano le dimensioni e la forma delle cellule che possono quindi essere confrontate tra i gruppi di genotipi. Con la nostra pipeline, possiamo identificare come l'anatomia del cervello cambia alla risoluzione cellulare, portando all'identificazione di tipi di cellule e regioni cerebrali importanti per il rischio di malattia.
