Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (Post-doctoral fellowship a AYS) e il National Institutes of Health (MH085499, EB003832 e OD006831 a DK). Ringraziamo Beth Friedman e Pablo Blinder per i commenti sul manoscritto.

1. Preparazione per la chirurgia i <ol><li> Pulire gli strumenti chirurgici dalla sonicazione in una miscela di latte Maxizyme e chirurgica in un pulitore ad ultrasuoni. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima di ogni esperimento. </li><li> Assicurarsi che tutti i reagenti necessari e monouso sono disponibili. Un elenco di reagenti e prodotti monouso è fornita in Tabella 2. Reagenti e monouso che vengono in contatto con il tessuto esposto deve essere sterile, quando possibile. </li><li> Indurre l&#39;anestesia. Anestetici tipici adatti per studi di sopravvivenza sono descritti nella Tabella 1. Garantire piano di anestesia chirurgica controllando per mancanza di reflex punta pizzico. L&#39;età ottimale del mouse è da 3 a 6 settimane di età. I crani di giovani topi sono più morbide e più difficili da sottili. Topi più anziani sono più spesse teschi che sanguinano di più durante la procedura di diradamento. </li><li> Fissare l&#39;animale in un frame stereotassico 1. Un elenco di apparecchi chirurgici è fornita in Tabella 2. </li><li> Mantenere la temperatura del corpotura a 37 ° C utilizzando una sonda rettale regolata feedback e cuscino termico. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per trattenere l&#39;umidità. </li><li> Shave il cuoio capelluto con un rasoio elettrico piccolo. </li><li> Pulire il cuoio capelluto con Betadine, seguita da tampone al 70% (v / v) alcool isopropilico. </li><li> Se lo si desidera, controllare che la frequenza cardiaca e la respirazione sono all&#39;interno di un range di normalità con un pulsossimetro. Per un mouse, questi numeri devono centro di circa 10 Hz e 2, rispettivamente. </li><li> Scaldare un&#39;aliquota di filtrata sterile artificiale fluido spinale cerebrale (ACSF) a 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4) (tutte le sostanze chimiche da Sigma) 2. </li></ol> 2. Montaggio di un frame testa <ol><li> Rimuovere il cuoio capelluto su tutta la superficie dorsale cranio con una coppia di pinze e forbici chirurgiche. Tagliare il pelle lateralmente ai bordi dei muscoli temporali su entrambi i lati del cranio e posterior ai muscoli del collo (Fig. 1A). </li><li> Utilizzare una lama di bisturi per rimuovere il periostio sottile dalla superficie del cranio. </li><li> Pulire il cranio con un applicatore con punta di cotone umido e asciugare la superficie del cranio con un flusso d&#39;aria da una polvere può. Quindi applicare un sottile strato di colla di cianoacrilato l&#39;intera superficie del cranio. Lasciare che la colla si asciughi completamente. Questo strato di colla è necessario per aderenza corretto del cemento dentale in fasi successive. La colla di cianoacrilato non deve essere sterilizzato. </li><li> Fissare un connettore metallico alla superficie del cranio, lontano dalla zona della finestra desiderata. Per i preparati anestetizzati, un dado piccolo può essere fissato al cranio con una piccola quantità di colla di cianoacrilato, che può essere successivamente avvitato nella configurazione di imaging mediante un bullone (Fig. 1B, 1L e 1N). Sigillare la parte posteriore del dado con nastro per garantire che la colla non inserire i fili durante l&#39;attacco al cranio. Il dado e nastro devono essere sterilizzati<html> in autoclave prima dell&#39;intervento. </li><li> Per i preparati di imaging svegli, collegare un connettore più rigido personalizzato con due punti di attacco (Fig. 1M e 1N). Praticare due fori nel cranio sopra l&#39;emisfero controlaterale corticale con un ½ mm trapano bava, e poi introdurre due # 000 viti autofilettanti. Queste viti aiuterà ancorare montare la testa al cranio. Applicare solo un giro completo della vite, in modo da evitare di applicare pressione alla corteccia sottostante. Quindi, fissare il costume traversa di metallo con una goccia di colla cianoacrilato sul cervelletto. Lasciare che il collante cianoacrilato asciugare completamente. Questo connettore metallo riduce notevolmente i gradi di libertà e semplifica trasferimento del campo dell&#39;imaging stesso in studi longitudinali. Una traversa gamma dà ampio spazio per il posizionamento degli elettrodi e la stimolazione di vibrisse. Piani dettagliati per la generazione del supporto personalizzato testa e dispositivo di fissaggio sono disponibili online (SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Le viti e la barra trasversale devono essere sterilizzati in autoclave prima dell&#39;intervento. </li><li> Coprire l&#39;intera superficie del cranio, escludendo la posizione della finestra, con uno strato di cemento dentale (Fig. 1C e 1D). Assicurarsi che tutti i bordi esposte della cute, sono coperti da cemento. I componenti del cemento dentale non devono essere sterilizzati. </li></ol> 3. La generazione di un lucido e rafforzato Assottigliato-cranio (porte) Window <ol><li> Assicurarsi che bave trapano sono taglienti ed evitare di riutilizzarli. Utilizzando un basso numero di giri sul trapano dentistico, sottile di 2 mm per 2 mm rispetto alla regione di corteccia somatosensoriale con una bava ½ mm. Alternate tra bagnare il cranio con ACSF e poi asciugare la superficie del cranio con un leggero getto d&#39;aria da un panno gas; umido per il raffreddamento, e secco per la diluizione. Ciò richiede assottigliamento attraverso lo strato spongioso del cranio, che possono sanguinare, ma può essere controlled sciacquando con ACSF (Fig. 1E). Il cranio inizia a flettersi sotto la leggera pressione del trapano quando è circa 50 um, ed i vasi piale deve essere visibile attraverso l&#39;osso umido (Fig. 1F). A questo spessore, piccole macchie bianche all&#39;interno dell&#39;osso diventano visibili per alcuni secondi immediatamente dopo che la superficie del cranio asciutta viene umidificato. </li><li> A questo punto, il sottile osso ulteriormente. Utilizzare una velocità di punta più lento, vale a dire, 1000 rpm, che si rade la superficie del cranio con solo un leggero tocco. Con movimenti controllati mantenendo la punta di una penna e solo applicare una forza nella direzione laterale. L&#39;osso deve essere ~~~V 10 a 15 um Nella spessore finale (Fig. 1G). Quando l&#39;osso è sufficientemente sottile, le piccole macchie bianche nelle ossa non saranno più visibili quando la superficie del cranio secco inumidito. </li><li> Lucidare la regione della finestra con la polvere di ossido di stagno. Collegare un pre-made punta che è stato immerso in silicone sigillante acquario e condisegnato, lasciando una frusta rastremata (inserto, fig. 1H). La frusta silicone deve essere preparato almeno un giorno prima della chirurgia, e sterilizzata con 70% di isopropanolo prima dell&#39;uso. Inserire una piccola presa di polvere sulla finestra con una goccia di ACSF (Fig. 1H). Agitare il slurry sulla finestra fino a dieci minuti sfiorando la punta della frusta mobile alla superficie del cranio. Lavare via la polvere di ossido di stagno accuratamente dalla finestra utilizzando ACSF e asciugare accuratamente l&#39;osso con un leggero getto d&#39;aria. Irregolarità della superficie e frammenti ossei aderenti hanno lasciato foratura nelle fasi precedenti devono essere rimossi dopo la lucidatura (Fig. 1H e 1I). La polvere di ossido di stagno non deve essere sterilizzato. </li><li> Tagliare pezzi quadrati di no. 0 vetro di copertura leggermente inferiore alla dimensione della finestra. Utilizzare uno scriba di segnare delicatamente separate le linee orizzontali e verticali in coprioggetto utilizzando un regolo. Quindi mettere il vetrino in una capsula di Petri e knock il piatto contro un bordo tabella per separare i pezzi di vetro. L&#39;intera piastra di Petri possono essere sterilizzati in autoclave per garantire la sterilità. </li><li> Inserire un vetro di copertura di dimensioni adeguate nei pressi della finestra secca. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato sopra la finestra con la punta di un applicatore di legno rotta cotton-fioc, e rapidamente spingere il pezzo pretagliato di vetro di copertura sopra la colla. Evitare di creare bolle sotto il vetro di copertura. Spingere delicatamente il vetro di copertura contro la superficie del cranio, e tenere premuto per alcuni secondi (Fig. 1J e 1O). Lasciare che la colla si asciughi completamente nell&#39;arco di 15 minuti. L&#39;eccesso di colla di cianoacrilato può essere rimosso dalla superficie superiore del vetro di copertura con una lama di bisturi dopo che viene essiccato. Sigillare i bordi del vetro di copertura con cemento dentale e formano una leggermente sollevata e per contenere l&#39;acqua per immersione della lente (Fig. 1K e 1O). </li></ol> 4. Recupero <ol><li> Mettete l&#39;animale in un intervento chirurgico temperatura in gabbia. Monitorare ilanimale periodicamente fino al completo recupero dall&#39;anestesia. </li><li> Se il preparato è destinato a sopravvivere per più di un giorno, fornire buprenorfina (0,03 pg per roditori g) per analgesia. Abbiamo tipicamente immagine dell&#39;animale almeno un giorno dopo l&#39;impianto iniziale. </li></ol> 5. Imaging Preparazione <ol><li> Stabilizzare l&#39;animale su una basetta per l&#39;imaging ottico, utilizzando la cornice come supporto per la testa (Fig. 1L e 1M). Un dispositivo di ritenuta può essere costituito da componenti optomechanical commercialmente disponibile da Qioptiq o Thorlabs. Il nostro piatto a parte può essere trasportato tra le suite di imaging chirurgici e due fotoni con l&#39;animale e tutti i dispositivi di monitoraggio fisiologico assemblati come una sola unità 3. </li><li> Se il flusso sanguigno immagini si desidera, iniettare 0,05 mL del 5% (w / v) fluorescente-destrano colorante disciolto in soluzione fisiologica sterile attraverso la vena della coda o vena infraorbitale per etichettare il siero del sangue (Fig. 2A e 2C a 2H </strong&gt;) 4-7. Questo deve essere fatto in anestesia generale. Amministrazione vena infraorbitale può essere più facile per i principianti, come soluzioni di destrano sono più viscoso. La vena della coda può essere difficile individuare in topi di colore scuro, e la vena tende a collassare dopo una iniezione fallito. Per l&#39;imaging vascolare con il verde delle emissioni, usare un isotiocianato di fluorescina destrano. Per emissione rossa, utilizzare un Texas Red destrano. Con alto peso molecolare destrani, il colorante rimane in circolazione per diverse ore. In alternativa, gli animali con endogeni etichette fluorescenti possono essere esposte direttamente al momento opportuno a due fotoni di lunghezza d&#39;onda di eccitazione. La soluzione destrano può essere congelato in aliquote per uso futuro. </li><li> Pulire delicatamente la superficie della finestra con un applicatore con punta di cotone umido. </li><li> Per l&#39;imaging prolungata delle preparazioni anestetizzati, iniettare per via intraperitoneale soluzione sterile di Ringer lattato presso un volume di 3 pl per grammo ogni 2 ore per mantenere i fluidi corporei ei requisiti energetici. &lt;/ Li&gt; <li> Quando gli animali di imaging in stato di veglia, limitare poggiatesta per poche ore alla volta per ridurre i livelli di stress. Rispedire l&#39;animale verso la gabbia a casa tra le sessioni di imaging per il cibo e l&#39;acqua. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Una finestra corretta vi permetterà di imaging profondità fino a 250 micron sotto la superficie piale per diversi mesi. Questo metodo è stato utilizzato per studiare in vivo flusso sanguigno capillare 4, 8, attivazione della microglia 8, 9, e all&#39;interno della struttura dendritica corticale parenchima 8. In un esempio, si usa due fotoni imaging per mostrare la vascolatura corticale di una anestetizzato Thy1-giallo proteina fluorescente (YFP) topo, dopo il siero del sangue è etichettato mediante iniezione endovenosa di Texas Red destrano (Fig. 2A). Vasi durali sono spesso visibili leggermente al di sopra della superficie corticale della dura madre (Fig. 2C, freccia). Grandi piale arteriole e venule lie sulla superficie corticale (Fig. 2D). Penetrante ramo navi da questa rete di superficie e immergersi nella corteccia dove si ramificano in un letto denso capillare che alimenta il tessuto corticale (Fig. 2E a 2H). Pergole dendritiche di YFP profonda esprimere i neuroni corticali, una endogena di segnale a questa linea di topi, possono essere esposte contemporaneamente in un secondo canale 10 (Fig. 2B a 2H). Il segnale di seconda armonica della osso è stato raccolto in un terzo canale, e può essere utilizzato per misurare lo spessore del cranio assottigliata dopo il prelievo di pile di immagine (Fig. 2A a 2C). Corticali dinamiche vascolari sono profondamente colpiti da anestetici 11. In un secondo esempio, mostriamo un video di vasoactivity spontanei raccolti da microscopia a due fotoni da un topo abituata sveglio. Oscillazioni vasomotorie rilievo del diametro del lume sono visti con una arteriola piale, ma non con un venule vicina. Questogamma basale di vasoactivity è diminuita con 4 uretano anestesia. Per quantificare i cambiamenti spontanea ed evocata nel flusso sanguigno, usiamo tecniche adeguate linee di scansione per catturare sia il diametro vascolare e la velocità dei globuli rossi dei singoli pescherecci. Informazioni più dettagliate sulle immagini quantitativa del flusso sanguigno tramite microscopia a due fotoni sono disponibili 3, 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Figura 1. Procedura per una finestra Porte. (Dalla A alla K) Immagini di passi sequenziali nella procedura per la generazione di una finestra porte. Vedere il testo per le istruzioni dettagliate. β = bregma e λ = lambda. (L) del sistema di dadi e bulloni per il fissaggio della testa durante l&#39;imaging di preparati anestetizzati. (M) Custom lavorati croce mount testa bar per la preparazione svegli. In questo esempio, un connettore stato impiantato anche per registrazioni electrocorticogram ripetuti. (N)Diagramma schematico che mostra vista dorsale del supporto testa e la posizione dei vari componenti. Il dado utilizzato in L pannello è inteso come alternativa alla traversa con pannello in M. Two # 000 viti autofilettanti sono aggiunti con la traversa di montaggio per una maggiore stabilità con preparazioni di imaging svegli. (O) Schema che illustra la sezione trasversale di una finestra Porte. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Figura 2. Imaging a due fotoni della struttura vascolare e neuronale nel topo corteccia. Tutte le immagini sono state raccolte attraverso una finestra porte in un Thy1-YFP del mouse a 2 giorni dopo l&#39;impianto finestra 10. Sporgenza massima oltre 150 micron di tessuto nell&#39;orientamento coronale mostra il cranio diluito in relazione al sistema vascolare (A) e dendriti (B). L&#39;osso (blu) è stato rilevato raccogliendo la seconda armonica fluorescenza a 450 nm di emissione di 900 nm di eccitazione <sup&gt; 8. Il sistema vascolare (rosso) è stata iniettata per via endovenosa etichettati da 70 kDa Texas Red destrano 6. I campi dendritiche dei neuroni (verde) sono endogeni al Thy1-YFP linea di topi transgenici. (CH) proiezioni massime oltre 50 micron di tessuto in orientamento orizzontale a diverse profondità al di sotto della pia. I dati sono dalla pila stessa immagine mostrata in pannelli A e B. navi Dural può essere visibile appena sopra la superficie corticale (freccia in C). Abbreviazioni ACSF = artificiale liquido cerebrospinale PORTI = finestra lucidato e rinforzato cranio diluito YFP = proteina fluorescente gialla mi assicuro che le procedure descritte sono approvati cura del Suo locale Animal istituzionale e Usa comitato.

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Niente da rivelare.

Two-photon immagini attraverso una finestra Porte richiede la trasmissione attraverso l&#39;osso assottigliata e la dura madre, che attenua la luce laser e aggiunge aberrazioni ottiche a maggiori profondità 8. Tuttavia, nonostante questo inconveniente, profondità di imaging fino a 250 um sotto la superficie piale può essere ottenuto con eccitazione 900 nm. Profondità maggiori di imaging possono in linea di principio essere possibile con lunghezze d&#39;onda di eccitazione più 13. Un importante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agente </td><td> Via di consegna </td><td> Dose per il mouse </td><td> Durata </td><td> Note </td><td> Fonte </td><td> Rif. Rif. </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 ug / g </td><td> 15-60 min </td><td> Margine di sicurezza stretta. Lavorare fino a giusta dose di anestesia lentamente. Supplemento 10% della dose di induzione come richiesto. </td><td> 036093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Ketamina (Ketaset) miscelato con Xylazina (Anased) </td><td> IP </td><td> 60 mcg / g (K) 10 pg / g (X) (in miscela stessa siringa) </td><td> 20-30 min </td><td> Xilazina è co-iniettata come un rilassante muscolare e analgesico. Supplemento solo ketamina al 50% della dose di induzione come richiesto. </td><td> (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isoflurano (Isothesia) </td><td> Inalazione </td><td> 4% concentrazione media alveolare (MAC) per l&#39;induzione; 1-2% MAC per la manutenzione </td><td> 4-6 h. </td><td> Purché in miscela di 70% di ossigeno e il 30% di ossido di azoto. L&#39;anestesia prolungata porta a rallentare il recupero. </td><td> 029403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Consigliato agenti anestetici per gli studi di sopravvivenza. <table border="1"><tbody><tr><td> VOCE </td><td> AZIENDA </td><td><strong&gt; CATALOGO # / MODEL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Isotiocianato di fluorescina destrano, 2 MDa peso molecolare </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> Alcol isopropilico </td><td> Pescatore </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Soluzione di Ringer lattato </td><td> Butler Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocaina soluzione, 2% (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Salino </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Milk chirurgico </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014.325 </td></tr><tr><td> Texas Red destrano, 70 kDa peso molecolare </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> MONOUSO </td></tr><tr><td> Carbide sbavature, ugello di dimensioni 1/2 mm </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Applicatori punta la foglia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Vetro di copertura, no. 0 spessore </td><td> Thomas Scientific </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Colla di cianoacrilato </td><td> ND Industries </td><td> H04308 31428 </td></tr><tr><td> Gas duster </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Grip di cemento in polvere </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Grip cemento solvente </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Insulina siringa, 0,3 mL di volume con il 29,5 gauge </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Dado e bullone per fissare la testa </td><td> Digikey </td><td> Dado, H723-ND, bullone, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Unguento oftalmico </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Lame di bisturi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Viti, autofilettante # 000 </td><td> JI Morris Azienda </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Silicone sigillante acquario </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Tin polvere di ossido di </td><td> Mama Minerals </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Glass scriba </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI FC-1 </td></tr><tr><td> Trapano elettrico alimentato </td><td> Foredom o Osada </td><td> K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Rasoio elettrico </td><td> Wahl </td><td> Serie 8900 </td></tr><tr><td> Pinza, Dumont no. 55 </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Commenti pad termico regolamentato </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (termistore rettale, 40-90-5D-02; hmangiare pad, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Vaporizzatore isoflurano </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Pulsossimetro </td><td> Starr Life Sciences </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Cacciavite miniatura </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Telaio stereotassico </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modello 900 (con maschera del mouse l&#39;anestesia e non rottura barre di auricolari) </td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche, fine blunt </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Pulitore ad ultrasuoni </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei reagenti specifici e le attrezzature, i materiali monouso.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

In vivo imaging della funzione corticale richiede l&#39;accesso ottico al cervello senza interruzioni dell&#39;ambiente intracranica. Vi presentiamo un metodo per formare un cranio lucido e rinforzato diluito (porte) finestra nel cranio del mouse che si estende su parecchi millimetri di diametro ed è stabile per mesi. Il cranio è diluito a 10 a 15 pm di spessore con una mano trapano per ottenere chiarezza ottica, e viene poi ricoperto con colla di cianoacrilato e un vetro di copertura a: 1) fornire rigidità, 2) inibiscono la ricrescita ossea e 3) ridurre la dispersione della luce da irregolarità sulla superficie dell&#39;osso. Dal momento che il cranio non è violato, qualsiasi infiammazione che potrebbe influenzare il processo in fase di studio è notevolmente ridotto. Imaging profondità fino a 250 um sotto la superficie corticale può essere realizzato utilizzando due fotoni microscopia a scansione laser. Questa finestra è particolarmente adatta a studiare il flusso ematico cerebrale e la funzione cellulare in preparazioni sia anestetizzati e sveglio. Offre inoltre l&#39;opportunità di manipolare l&#39;attività delle cellule utilizzando optogenetics o per interrompere il flusso di sangue nei vasi destinatari irradiazione di circolazione fotosensibilizzanti.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K Views.  University of California, San Diego. Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formazione estinzione durante la finestra di riconsolidamento impedisce il recupero della paura

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...