Skidmore Faculty Development Grant ha finanziato la preparazione e la pubblicazione di questo manoscritto.

1. Embrioni di montaggio (al completamento della tecnica di visualizzazione selezionato, quali immunocitochimica, ibridazione in situ, ecc) <ol><li> Posizionare embrioni in un piatto 35 millimetri Petri riempita con tampone di scelta (Figura 1A). La scelta del buffer è basata sulla procedura di etichettatura. Tipicamente buffer basati PBS sono adatti. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, e usando pinze, proteggere la testa con un paio di pinze mentre si tira il tuorlo via con l&#39;altra coppia (Figura 1B). In alternativa, utilizzare un perno insetto in un supporto del perno insetto per tirare delicatamente il tuorlo. </li><li> Utilizzando il poker embrione (lenza (diametro 0,41 millimetri) incollato, o un tubo capillare o una pipetta Pasteur) spostare gli embrioni ad una parte della piastra di Petri che non ha un sacco di tuorlo detriti (Figure 1C-D). </li><li> Usando una pipetta Pasteur di vetro, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile, e gdipendentemente loro pipetta su un vetrino (Figura 1E). </li><li> Favorire la delicatezza di distanza il liquido in eccesso con un laboratorio wipe. Evitare il contatto con gli embrioni. </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio agli embrioni. Per le etichette fluorescenti, usare un reagente antifade di scelta. Per segnali colorimetrici, 70% glicerolo può essere utilizzato come mezzo di montaggio. </li><li> Utilizzando il poker embrione, orientare gli embrioni sui loro lati a righe (Figura 1F). </li><li> Aggiungere un &quot;tocco&quot; di vaselina o grasso alto vuoto ad ogni angolo di un coprioggetto (Figura 1G). Questo previene i danni di embrione da eccessiva compressione. </li><li> Posizionare coprioggetto (lato vaselina basso) sulla parte superiore di embrioni (Figura 1H). </li><li> Battere delicatamente il vetrino in ogni angolo fino a quando il mezzo di montaggio (70% glicerolo o reagente di montaggio anti-fade) tocca il vetrino (Figura 1H). </li><li> Se necessario, aggiungere ulteriori supporti di montaggio pipettando proprio accanto alla coverslip, usando una pipetta nell&#39;intervallo 20-200 ml. Sarà dello stoppino sotto. </li><li> Utilizzando un laboratorio pulire, pulire completamente intorno al vetrino. Essere certi di non applicare pressione sul vetrino, in quanto questo potrebbe danneggiare gli embrioni. Questa area deve essere asciutta e non hanno alcun vaselina o supporti di montaggio su di esso. </li><li> Utilizzare smalto per sigillare intorno al bordo del vetrino (Figura 1I). </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression.">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li><li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons.">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li><li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. 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A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons.">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos.">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Non esistono interessi finanziari in competizione sia per autore.

Montaggio laterale di zebrafish embrioni aiuti visualizzazione fisso di sviluppo del midollo spinale. Attraverso la rimozione del pallone tuorlo, la distanza di lavoro richiesto per eccezionali immagini microscopiche è ridotta. I nostri risultati rappresentativi sono stati limitati alla fase 24 HPF, tuttavia, questa tecnica può essere usato già 18 HPF, sebbene embrioni anteriori sono più difficili da sezionare a causa delle dimensioni dell&#39;embrione e la fragilità del tessuto. Questa tecnica è applicabile agli embrioni di età superiore a 24 HPF anche. Aiutato dalla chiarezza ottica della zebrafish embrionale, la capacità di eseguire esami genetici avanti, genetica inversa, e gli approcci transgenici, diversi processi di sviluppo possano essere istruite. Questo include gli indici mitotici di progenitori neuronali con marcatori come BrdU e anti-fosfo-istone marzo 4-6 e patterning attraverso l&#39;espressione di marcatori progenitrici neuronali e gliali nella pax, NKX, dbx, e olig families 1,4-6. Reattivi che riportano la determinazione gliali e neuroni (come proteina gliale fibrillare acida (GFAP) e Huc / D) 1,4,5,10 può essere utilizzato. Differenziazione sottotipo neuronale può essere analizzata attraverso l&#39;espressione di isolotto, VSX, engrailed, ei geni gata 1,4-6. E, infine, l&#39;analisi di guida degli assoni è possibile attraverso anticorpi come tubulina anti-acetilata, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Anche se altri sistemi modello vertebrato (mouse e pulcino) vengono utilizzati per studiare lo sviluppo del midollo spinale, solo il permesso di zebrafish visualizzazione simultanea di tutti gli assi di sviluppo nell&#39;embrione intatto. La limitazione evidente di questo approccio è che gli embrioni sono fissi, che esclude l&#39;imaging dal vivo. Infatti, la rimozione di (o danni) i risultati tuorlo in rapida morte embrionale, quindi non è possibile ridurre la distanza di lavoro in embrioni vivi con questa tecnica. Tuttavia, alto ingrandimento co spinalerd immagini in embrioni vivi è possibile. Per conservare il tuorlo durante l&#39;imaging in tempo reale, gli embrioni possono essere posizionati in diapositive depressione, che forniscono uno spazio più grande tra il campione e il coprioggetto. In alternativa, più 22 mm x 22 millimetri coprioggetto possono essere incollati su entrambi diapositiva di un 3 x 1 in preparati al microscopio. I coprioggetti servono come &quot;ponte&quot; per il coprioggetto sovrastante. Se gli embrioni sono più vecchi di 18 HPF, tricaine viene utilizzato per anestetizzare gli embrioni per impedire il movimento. Mentre è necessaria una distanza di lavoro di 0,288 millimetri per embrioni deyolked a 24 HPF, quando si lavora con embrioni vivi incorporati in agarosio, con tuorli intatti, una lente microscopica con una distanza di lavoro di 3,3 mm sono sufficienti. In alternativa, le culture espianto derivate da embrioni deyolked possono essere visualizzati con un coagulo di plasma tecnica di immobilizzazione 13. Varie popolazioni di cellule possono essere osservati attraverso l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP, mCherry, o il photoconcolorante convertibili Kaede (per citarne alcuni). Inoltre, le cellule fluorescente all&#39;interno embrioni chimerici possono essere visualizzati anche con questo approccio 14. Una tecnica di montaggio coerente e stabile per mesi, è uno strumento fondamentale per i biologi dello sviluppo e cellulari. Questa tecnica semplice è riproducibile, che permette un facile confronto tra le diverse prove sperimentali. Inoltre, l&#39;allineamento di embrioni in righe permette facilmente l&#39;identificazione di embrioni specifici per una successiva analisi.

Visualizzazione del midollo spinale in zebrafish è inibita da una serie di fattori. Grazie allo spessore dei somiti sovrastanti e la posizione interna del midollo spinale, una distanza considerevolmente lungo lavoro è necessaria per alta risoluzione cellulare. La palla tuorlo (che è ancora presente durante le prime fasi di neurogenesi) aumenta ulteriormente la distanza di lavoro richiesto, ed è facilmente danneggiata da pressione da un vetrino. Inoltre, i detriti dal tuorlo danneggiato vieta chiara visualizzazione dei tessuti. Sebbene sezioni trasversali nelle (DV) asse dorso-ventrale sono possibili, non facilmente consentono la visualizzazione simultanea in antero-posteriore (AP) asse 1. Per superare questi ostacoli, embrioni vengono sezionati e montate su vetrini. Questa procedura offre diversi vantaggi. In primo luogo, embrioni di zebrafish facilmente si trovano con la parte laterale rivolta verso l&#39;alto, che facilita la visualizzazione asse AP. In secondo luogo, la rimozione del BAL tuorlol diminuisce la distanza di lavoro desiderata, e limita detriti. In terzo luogo, la procedura di montaggio consente sia a fluorescenza e microscopia in campo chiaro. Quarto, embrioni montati sono stabili per mesi a 4 ° C, consentendo la visualizzazione campione prolungato. Infine, la progressione di sviluppo si verifica in quanto segmenti anteriori sono più maturo di segmenti posteriori. Al fine di garantire che allestite hemisegments spinali abbinati sono confrontati tra embrioni, sovrastante tessuto somite viene utilizzato come guida. Ad esempio, il decimo somite più posteriore sovrappone il hemisegment midollo decimo, che è evolutivamente equivalente in embrioni fase corrispondenza. Questa procedura di montaggio degli embrioni intatti permette una facile identificazione dei somiti. Usiamo la genetica e le tecnologie gene knock-basso per studiare i meccanismi di orientamento degli assoni in via di sviluppo midollo spinale. In particolare, abbiamo determinato che robo2, ROBO3 e DCC sono necessari per commissurale primaria Asceending (COPA) assone pathfinding. Utilizzando la procedura di montaggio descritta qui, siamo stati in grado di esaminare la crescita ventrale, attraversamento linea mediana, larghezza commissure, dorsale ed anteriore 2,3 crescita. Questa procedura di montaggio può essere applicata anche a DV o AP patterning del midollo spinale. Abbiamo utilizzato questa procedura per determinare ruoli disparati valle effettori Wnt in DV patterning del midollo spinale. Usando questo montaggio, siamo riusciti a ottenere la risoluzione di marcatori DV a livello di singola cellula, e determinare spostamenti patterning minute a seguito della ricezione del segnale alterato Wnt 4,5. Questa procedura di montaggio consente anche di calcolo dell&#39;indice mitotico attraverso anti-phosphohistone 3 o etichettatura BrdU (progenitore proliferazione) differenziamento 5.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

Il midollo spinale zebrafish è un modello di indagine efficace per la ricerca del sistema nervoso per diverse ragioni. In primo luogo, gli approcci atterramento genetica, transgenici e geni possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. In secondo luogo, i grandi innesti di embrioni evolutivamente sincronizzati prevedono grandi misure sperimentali del campione. In terzo luogo, la chiarezza ottica dell&#39;embrione zebrafish permette ai ricercatori di visualizzare progenitore, gliali e popolazioni neuronali. Anche se embrioni di zebrafish sono trasparenti, spessore del provino può impedire efficace visualizzazione microscopica. Una ragione di ciò è lo sviluppo tandem del midollo spinale e tessuto somite sovrastante. Un altro motivo è la grande palla tuorlo, che è ancora presente durante i periodi di precoce neurogenesi. In questo articolo, dimostriamo microdissezione e la rimozione del tuorlo di embrioni fisse, che permette la visualizzazione microscopica preservando il tessuto circostante somite. Noi also dimostrare montaggio semipermanente di embrioni di zebrafish. Questo permette l&#39;osservazione dei neurodevelopment negli assi dorso-ventrale e antero-posteriore, in quanto conserva la tridimensionalità del tessuto.

Quando chiarire i meccanismi che sottendono vari eventi sviluppo come patterning cellulare, la differenziazione, e guida degli assoni, è importante essere in grado di visualizzare le cellule nel contesto della loro tessuto. Difetti patterning dorsoventral tipicamente presenti come uno spostamento ventrale o dorsale nel dominio espressione dei fattori di trascrizione nella pax, NKX, o famiglie dbx 4. A volte, i cambiamenti possono essere sottili, comprendente solo pochi diametri cellulari 4. Analisi della sezione trasversale consente questo tipo di analisi. Tuttavia, i reagenti con segnali più deboli, o sezioni trasversali che non sono perpendicolari all&#39;asse AP possono limitare interpretazione. Inoltre, l&#39;analisi in sezione trasversale non facilmente prendere in considerazione se le modifiche persistono nell&#39;asse AP, e si basa sulla disponibilità di un criostato. Questa limitazione viene aggirata da una vista laterale del midollo spinale. Come si vede nella Figura 2B, nkx6.1 mRNA è distributed in circa la metà ventrale del midollo spinale a 24 ore post-fecondazione (HPF), all&#39;interno del dominio progenitore. Cellule progenitrici sono distinguibili da cellule post mitotiche dovuti alla presenza della piastra, che si trova nella parte mediale del midollo spinale. Visto con ottica DIC, le singole celle sono chiaramente distinguibili, e un confine definito tra esprimere e nonexpressing cellule è evidente. Uscita dal ciclo delle cellule progenitrici è accompagnata da cambiamenti nell&#39;espressione genica. Ad esempio, tutti i neuroni post-mitotici esprimono Huc / D che è rilevabile con immunocitochimica 1,5. sonde mRNA per isolotto, gata, e le famiglie VSX etichettare specifici neuroni post-mitotici di posizione coerente e il numero all&#39;interno di ogni hemisegment del midollo spinale 6. Inoltre, recettori orientamento assone come quelli della famiglia robo sono espressi in popolazioni ristrette di neuroni post-mitotici (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montaggio laterale di embrioni permette conteggi accurati di neuroni post-mitotici. Allo stesso modo, progenitori che continuano a dividere possono essere quantificati con anti-fosfo-istone 3 immunocitochimica così come l&#39;etichettatura BrdU. Inoltre, la morte cellulare può essere valutata con etichettatura TUNEL 4-6. Al 24 hpf, gli assoni dei neuroni seguenti postmitotici possono essere visualizzati con vari metodi, e sono distinguibili a livello di singola cellula: dorsale laterale Crescente (dola), commissurali primaria Crescente (COPA), commissurali secondaria Crescente (COSA), ventrale longitudinale Descending (Veld), Kolmer-Agdur (KA), commissurali biforcano / longitudinali (COB / L), circonferenza Ascendente (CIA), circonferenziale Discendente (CID), e unipolare commissurali Discendente (UCoD), ROHON-Barba (RB), motoneuroni ( M) 9. Gli assoni si estendono da questi neuroni nella dorsale, ventrale, anteriore, posteriore e le indicazioni. Essi ramo, attraversano la linea mediana, e uscire sia la dorsalee ventrale del midollo spinale. Quando accoppiato con microscopio confocale a scansione laser, questi comportamenti cellulari vari sono evidenti in embrioni montati lateralmente, mediante immunocitochimica e proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP 2. Nella Figura 2D, ZNP-1 immunocitochimica è stato usato per etichettare motoneuroni in via di sviluppo. Motoneuroni escono dal midollo spinale ventrale per innervare la muscolatura circostante in via di sviluppo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissezione e laterale montare di embrioni di zebrafish. (A) previa trasformazione per immunofluorescenza, ibridazione in situ, ecc, gli embrioni sono posti in un piatto 35 millimetri Petri riempite con PBT (PBS con 0,5% Triton X-100) o PTW (PBS con 0.1% Tween-20). Il tuorlosfera (YB) è evidente. (B) Il tuorlo viene rimosso dal fissaggio della testa dell&#39;embrione successiva accurata dissezione. (C) Un poker embrione (lenza incollato ad una pipetta Pasteur) è usato per embrioni distinti e detriti tuorlo (D). Puliti gli embrioni sono pipettati su un vetrino da microscopio (E) e allineate (F). (G) Vaselina viene applicata agli angoli del coprioggetto. (H) Il vetrino viene posizionato delicatamente sulla sommità degli embrioni mezzo di montaggio. (I) Smalto viene utilizzato per sigillare i bordi del coprioggetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Analisi del pattern di espressione genica e assone pathfinding in laterale montato embrioni di zebrafish. (A) Disegno di un embrione di pesce zebra a 24 HPF. In BD, circa quattro hemisegments sopra l&#39;estensione del sacco vitellino vengono visualizzate (zona in scatola). (B) nkx6.1 è espressa nel midollo spinale ventrale, compresa la piastra (FP). (C) ROBO3 è espresso nei neuroni post-mitotici (PMN). La zona pavimento piatto e progenitore non è evidente in questo piano focale più laterale. In B, C, il midollo spinale è delimitata da una staffa sul lato sinistro dell&#39;immagine. (D) microscopio confocale è stato utilizzato per l&#39;immagine ZNP-1 immunofluorescenza, che le etichette assoni motori che escono dal midollo spinale ventrale. In tutte le immagini, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Una lunga distanza di lavoro 40X, immersione in acqua (NA 0,8) lente è stata usata (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  Skidmore College.  Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neuroscienze

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissezione e Cultura della gangliari Chick Statoacoustic Espianti e del midollo spinale in gel di collagene per saggi crescita dei neuriti

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...