Skidmore Faculté subvention de développement a financé la préparation et la publication de ce manuscrit.

Une. Les embryons de montage (à la fin de la sélection technique de visualisation, comme immunocytochimie, hybridation in situ, etc) <ol><li> Placez embryons dans un plat de 35 mm de Pétri remplie avec le tampon de choix (figure 1A). Le choix du tampon est basée sur la procédure d&#39;étiquetage. Typiquement, des tampons à base de PBS sont appropriés. </li><li> Sous un microscope de dissection, et l&#39;aide de pinces, fixez la tête avec une paire de pinces, tout en tirant le jaune loin avec l&#39;autre paire (figure 1B). Vous pouvez également utiliser une broche d&#39;insecte dans un porte-broche insecte de tirer doucement le jaune. </li><li> Utilisation du poker embryonnaire (de ligne de pêche (diamètre 0,41 mm) collée sur une ou l&#39;autre d&#39;un tube capillaire ou une pipette Pasteur) déplacer les embryons à une partie de la boîte de Petri qui ne possède pas une grande quantité de débris de jaune d&#39;oeuf (Figures 1C-D). </li><li> En utilisant une pipette Pasteur en verre, aspirer les embryons dans le moins de liquide possible, et gently les introduire à la pipette sur une lame (figure 1E). </li><li> Mèche doucement l&#39;excès de liquide à l&#39;aide d&#39;un laboratoire lingette. Eviter le contact avec les embryons. </li><li> Ajouter une goutte de milieu de montage pour les embryons. Pour les étiquettes fluorescentes, utiliser un réactif antifade de choix. Pour les signaux colorimétriques, 70% de glycerol peut être utilisé comme milieu de montage. </li><li> Utilisation du poker de l&#39;embryon, orienter les embryons sur leurs côtés dans les rangées (figure 1F). </li><li> Ajouter un &quot;tape&quot; de vaseline ou de graisse à vide poussé à chaque coin d&#39;une lamelle (figure 1G). Ceci empêche des dommages de l&#39;embryon de la compression excessive. </li><li> Placez la lamelle (côté de la vaseline en bas) sur des embryons (figure 1H). </li><li> Tapoter doucement la lamelle sur chaque coin jusqu&#39;à ce que le milieu de montage (70% de glycérol ou anti-fade réactif de montage) est en contact avec la lamelle (figure 1H). </li><li> Si nécessaire, ajouter plus de support de montage par aspiration juste à côté de la coverslip, à l&#39;aide d&#39;une pipette dans la plage de 20 à 200 ml. Il mèche sous. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un laboratoire essuyer, nettoyer complètement autour de la lamelle. Soyez certain de ne pas appliquer une pression sur la lamelle, car cela pourrait endommager les embryons. Cette zone doit être sec et n&#39;ont pas de gelée de pétrole ou de médias de fixation. </li><li> Utilisez le vernis à ongles pour sceller autour du bord de la lamelle (figure 1I). </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression.">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li><li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons.">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li><li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Aucun intérêt financier concurrentes existent pour l&#39;un des auteurs.

Montage latéral fixe des embryons de poissons zèbres aides visualisation du développement de la moelle épinière. Grâce à l&#39;élimination de la bille de jaune d&#39;oeuf, la distance de travail nécessaire à l&#39;imagerie microscopique exceptionnelle est réduite. Nos résultats représentatifs ont été limitées à l&#39;étape 24 hpf, cependant, cette technique peut être utilisée aussi tôt que 18 hpf, bien que les embryons antérieurs sont plus difficiles à disséquer raison de la taille de l&#39;embryon et de la fragilité du tissu. Cette technique est également applicable à des embryons âgés de plus de 24 hpf. Aidé par la clarté optique du poisson zèbre embryonnaire, la capacité d&#39;effectuer des cribles génétiques à terme, la génétique inverse, et les approches transgéniques, plusieurs processus de développement peuvent être étudiées. Ceci inclut des indices mitotiques de progéniteurs neuronaux avec des marqueurs tels que BrdU et anti-phospho-histone H3 4-6 et un motif à travers l&#39;expression de marqueurs progénitrices neuronales et gliales dans la pax, NKX, dbx, et olig families 1,4-6. Les réactifs qui signalent détermination neuronale et gliale (telle que la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) et HuC / D) 1,4,5,10 peuvent être utilisés. Différenciation neuronale sous-type peut être analysée à travers l&#39;expression de l&#39;îlot, VSX, engrailed, et les gènes de gata 1,4-6. Et enfin, l&#39;analyse de guidage axonal est possible grâce à des anticorps tels que la tubuline anti-acétyle, 3A10, et ZNP-1 2,11,12. Bien que d&#39;autres systèmes de modèles vertébrés (souris et poussin) sont utilisés pour étudier le développement de la moelle épinière, seul le permis de poisson zèbre visualisation simultanée de tous les axes de développement de l&#39;embryon intact. La limitation évidente de cette approche est que les embryons sont fixes, ce qui exclut l&#39;imagerie en direct. En fait, l&#39;élimination du (ou des dommages à) les résultats de jaune d&#39;oeuf dans la mort embryonnaire rapide, il n&#39;est donc pas possible de réduire la distance de travail dans les embryons vivants en utilisant cette technique. Cependant, fort grossissement co moellee imagerie embryons vivants est possible. Afin de préserver le jaune au cours de l&#39;imagerie en temps réel, les embryons peuvent être placés dans des glissières de dépression, qui donnent un plus grand espace entre l&#39;échantillon et la lamelle couvre-objet. Sinon, plusieurs 22 mm x 22 mm lamelles peuvent être collées sur chaque diapositive d&#39;un 3 po x 1 po lame de microscope. Les lamelles servent de &quot;pont&quot; pour la lamelle de recouvrement. Si les embryons sont âgés de plus de 18 HPF, tricaine est utilisé pour anesthésier les embryons pour éviter tout mouvement. Bien qu&#39;une distance de travail de 0,288 mm est nécessaire pour les embryons deyolked à 24 hpf, lorsque l&#39;on travaille avec des embryons vivants noyées dans l&#39;agarose, les jaunes intactes avec une lentille microscopique avec une distance de travail de 3,3 mm, est suffisante. En variante, les cultures d&#39;explants provenant d&#39;embryons deyolked peuvent être visualisées en utilisant une technique d&#39;immobilisation d&#39;un caillot de plasma 13. Différentes populations de cellules peuvent être observées grâce à l&#39;utilisation de protéines fluorescentes codées génétiquement telles que GFP, mCherry, ou le photoconcolorant convertibles Kaede (pour n&#39;en nommer que quelques-uns). En outre, les cellules marquées par fluorescence dans des embryons chimériques peuvent également être visualisés à cette approche 14. Une technique de montage cohérent qui est stable pendant des mois est un outil essentiel pour les biologistes du développement et de cellules. Cette technique simple est reproductible, permettant une comparaison facile entre les différents essais expérimentaux. En outre, l&#39;alignement des embryons dans les rangées permet facilement l&#39;identification des embryons spécifiques pour une analyse ultérieure.

La visualisation de la moelle épinière chez le poisson zèbre est inhibé par un certain nombre de facteurs. En raison de l&#39;épaisseur des somites sus-jacentes et l&#39;emplacement interne de la moelle épinière, d&#39;une distance de travail de la longueur considérable est requis pour une résolution cellulaire élevée. La balle de jaune d&#39;oeuf (qui est toujours présent pendant les premiers stades de la neurogenèse) augmente encore la distance de travail requise, et est facilement endommagé par une pression à partir d&#39;une lamelle couvre-objet. En outre, les débris de jaune endommagé interdit visualisation claire des tissus. Bien que les sections transversales dans les (DV) axe dorso-ventral sont possibles, elles ne permettent pas facilement la visualisation simultanée dans l&#39;axe 1 antéro-postérieur (AP). Pour surmonter ces obstacles, les embryons sont disséqués et montés sur des lames. Cette procédure présente plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, embryons de poisson zèbre se trouvent facilement avec le côté latéral vers le haut, ce qui facilite la visualisation AP axe. En second lieu, le retrait de la BAL du jaune d&#39;oeufl diminue la distance de travail nécessaire et limite les débris. Troisièmement, cette procédure de montage permet à la fois fluorescent et la microscopie en fond clair. Quatrièmement, les embryons sont montés stable pendant des mois à 4 ° C, ce qui permet spécimen prolongée visualisation. Enfin, la progression du développement se produit en ce que les segments antérieurs sont plus matures que les segments postérieurs. Afin de veiller à ce que la colonne vertébrale étagées hemisegments appariés sont comparées entre les embryons, recouvrant le tissu somite est utilisé en tant que guide. Par exemple, le dixième somites plus postérieure recouvre la moelle hemisegment dixième, ce qui est équivalent de développement dans des embryons au stade appariés. Cette procédure de montage d&#39;embryons intacts permet d&#39;identifier facilement les somites. Nous utilisons la génétique et de technologies géniques knock-down pour étudier les mécanismes de guidage axonal dans la moelle épinière en développement. En particulier, nous avons déterminé que robo2, ROBO3 et DCC sont nécessaires pour Commissural Asce primairending (COPA) des axones. En utilisant la procédure de montage décrit ici, nous avons pu examiner la croissance ventrale, la ligne médiane de passage, la largeur de la commissure, dorsale et 2,3 de croissance antérieure. Cette procédure de montage peut également être appliquée à DV ou AP structuration de la moelle épinière. Nous avons utilisé cette procédure pour déterminer les rôles disparates d&#39;effecteurs Wnt en aval DV structuration de la moelle épinière. L&#39;utilisation de ce montage, nous avons réussi à obtenir une résolution de marqueurs DV au niveau de la cellule unique, et déterminer les changements de mise en forme de minutes à la suite d&#39;altération de la réception du signal Wnt 4,5. Cette procédure de montage permet également de calcul de l&#39;indice mitotique par anti-phosphohistone 3 ou marquage BrdU (ancêtre de la prolifération) de différenciation 5.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

La moelle épinière poisson zèbre est un modèle d&#39;enquête efficace pour la recherche sur le système nerveux pour plusieurs raisons. Tout d&#39;abord, génétique, gènes transgéniques et des approches de knockdown peuvent être utilisés pour examiner les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement du système nerveux. Deuxièmement, les grandes griffes d&#39;embryons de développement synchronisés fournissent de grandes tailles d&#39;échantillons expérimentaux. Troisièmement, la clarté optique de l&#39;embryon de poisson zèbre permet aux chercheurs de visualiser ancêtre, gliales, et populations neuronales. Bien que les embryons de poisson zèbre sont transparentes, épaisseur de l&#39;échantillon peut gêner la visualisation microscopique efficace. Une raison à cela est la mise en tandem de la moelle épinière et le tissu recouvrant somites. Une autre raison est la grande bille de jaune d&#39;oeuf, qui est toujours présente dans les périodes de début de la neurogenèse. Dans cet article, nous démontrons microdissection et le retrait du jaune dans les embryons fixes, qui permet la visualisation microscopique tout en préservant les tissus environnants somites. Nous also démontrer montage semi-permanent de embryons de poisson zèbre. Ceci permet l&#39;observation de développement neurologique dans les axes dorso-ventral et antéro-postérieure, comme il préserve le caractère tridimensionnel de tissu.

Lorsque la compréhension des mécanismes qui sous-tendent divers événements de développement tels que la structuration cellulaire, la différenciation et le guidage axonal, il est important d&#39;être en mesure de visualiser les cellules dans le contexte de leur tissu. Défauts dorso-ventral de motifs généralement présents comme un changement ventrale ou dorsale dans le domaine de l&#39;expression des facteurs de transcription dans la pax, NKX, ou familles dbx 4. Parfois, les changements peuvent être subtils, comprenant seulement quelques diamètres de cellules 4. Analyse transversale permet ce type d&#39;analyse. Toutefois, des réactifs avec des signaux plus faibles, ou des sections transversales qui ne sont pas perpendiculaires à l&#39;axe AP peuvent limiter l&#39;interprétation. En outre, une analyse transversale ne facilement prend pas en compte le fait que les changements persistent dans l&#39;axe AP, et repose sur la disponibilité d&#39;un cryostat. Cette limitation est contournée par des vues latérales de la moelle épinière. Comme on le voit sur ​​la figure 2B, Nkx6.1 ARNm est distributed à peu près la moitié ventrale de la moelle épinière à 24 h après la fécondation (HPF), dans le domaine de l&#39;ancêtre. Les cellules progénitrices peuvent être distinguées des cellules post mitotiques en raison de la présence de la plaque de fond, qui se trouve dans la partie médiane de la moelle épinière. Vu avec optique DIC, les cellules individuelles sont nettement distinctes et une limite définie entre l&#39;expression et nonexpressing cellules est évidente. sortie du cycle de cellules progénitrices est accompagné par des changements dans l&#39;expression génique. Par exemple, tous les neurones post-mitotiques expriment HuC / D qui est détectable par immunohistochimie 1,5. sondes d&#39;ARNm de l&#39;îlot, gata, et les familles de VSX étiqueter les neurones post-mitotiques spécifiques de la position constante et le nombre de chaque cordon hemisegment moelle 6. En outre, les récepteurs de guidage axonal, tels que ceux de la famille de robo sont exprimés dans les populations de neurones post-mitotiques restreintes (Figure 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montage latéral d&#39;embryons permet des comptages précis de neurones post-mitotiques. De même, les progéniteurs qui continuent à diviser peuvent être quantifiés avec anti-phospho-histone 3 immunocytochimie ainsi que marquage BrdU. De plus, la mort cellulaire peut être évaluée par marquage TUNEL 6.4. À 24 HPF, les axones des neurones post-mitotiques suivantes peuvent être visualisées avec différentes méthodes, et se distinguent au niveau de la cellule unique: Dorsale latéral ascendant (LRPC), Commissural Croissant primaire (COPA), Commissural secondaire croissant (CSR), ventrale longitudinale décroissant (plaine), Kolmer-Agdur (KA), Commissural bifurcation / longitudinales (CoB / L), circonférentielle Croissant (CIA), circonférentielle Descendant (CID), et unipolaire Commissural Descendant (UCOD), Rohon-Barbe (RB), les motoneurones ( M) 9. Axones s&#39;étendent de ces neurones dans la dorsale, ventrale, antérieure et postérieure directions. Ils branche, croisent la ligne médiane, et sortent à la fois la dorsaleet la moelle épinière ventrale. Lorsqu&#39;il est couplé avec la microscopie confocale à balayage laser, ces comportements cellulaires variées sont évidents dans les embryons montés latéralement, en utilisant des protéines fluorescentes et immunocytochimie codés génétiquement telles que GFP 2. Dans la figure 2D, ZNP-1 immunocytochimie a été utilisé pour étiqueter les motoneurones en développement. Motoneurones quittent la moelle épinière ventrale pour innerver les muscles entourant le développement. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Dissection et latéral monter des embryons de poisson zèbre. (A) Après le traitement pour l&#39;immunofluorescence, hybridation in situ, etc, les embryons sont placés dans une boîte de Petri 35 mm rempli de PBT (PBS avec 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS avec 0,1% de Tween-20). Le jaune d&#39;oeufballe (YB) est évident. (B) Le jaune est éliminé par fixation de la tête de l&#39;embryon suivie par dissection minutieuse. (C) Un poker d&#39;embryon (la ligne de pêche collé sur une pipette Pasteur) est utilisé pour séparer les embryons et les débris de jaune d&#39;oeuf (D). Embryons nettoyés sont déposés à la pipette sur une lame de microscope (E) et alignés (F). Gelée (G) des hydrocarbures est appliquée sur les coins de la lamelle couvre-objet. (H) La lamelle est placée légèrement au-dessus des embryons dans un milieu de montage. (I) Le vernis à ongles est utilisé pour sceller les bords de la lamelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figure 2. L&#39;analyse des profils d&#39;expression des gènes et des axones en monté latéralement embryons de poisson zèbre. (A) Dessin d&#39;un embryon de poisson zèbre à 24 HPF. En BD, environ quatre hemisegments-dessus de la prolongation de la vésicule ombilicale sont visualisées (zone encadrée). (B) Nkx6.1 est exprimé dans la moelle épinière ventrale, y compris la plaque de base (FP). (C) ROBO3 est exprimé dans les neurones post-mitotiques (PMN). La zone de la plaque de sol et progénitrices n&#39;est pas évidente dans ce plan focal plus latérale. En B, C, la moelle épinière est délimitée par un support sur ​​le côté gauche de l&#39;image. (D) La microscopie confocale a été utilisée pour l&#39;image ZNP-1 immunofluorescence, qui marque les axones moteurs qui sortent de la moelle épinière ventrale. Dans toutes les images, est antérieure à la gauche et dorsale est écoulé. Une longue distance de travail 40X, immersion dans l&#39;eau (NA 0,8) lentille a été utilisé (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vues.  Skidmore College.  Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements. 

Vidéo: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurosciences

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...