Ringraziamo Angela Kralemann-Köhler per un eccellente supporto tecnico. Il lavoro sperimentale qui descritta è stata eseguita nel nostro laboratorio ed è stata sostenuta da sovvenzioni del Consiglio di ricerca tedesco (DFG) a CK e BK e una borsa di studio del ministero tedesco della Ricerca e dell&#39;Istruzione (BMBF) per BK.

Dichiarazione Etica Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le disposizioni della utilizzazione cura degli animali e del comitato governativo, LANUV dello stato del Nord Reno-Westfalia, (Düsseldorf, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal LANUV, Düsseldorf sotto il numero di licenza 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare lo stress e il numero di animali necessari per lo studio. 1. Animal Care and Housing <ol><li> Tutti gli animali impiegati nei protocolli qui descritti devono essere tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, come definito dalla Federazione europea Laboratory Animal Science Association (FELASA). </li><li> I topi dovrebbero essere tenuti in gabbie standard in temperatura e umidità controllata (22 ° C), camera in condizioni diurni (12 ore di luce / buio ciclo) con HEPA aria filtrata. </li><li> Cibo standardizzato e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Se / IkB / tTA e IkB - sono utilizzati topi di controllo, la genotipizzazione basato su PCR deve essere eseguita per ogni animale, come descritto in 7, 18. </li><li> I maschi con una differenza di età di meno di quattro giorni dovrebbe per essere utilizzati per ridurre la variabilità individuale. </li><li> (OPTIONAL): Per gli esperimenti di riattivazione NF-KB, doxiciclina deve essere somministrato in acqua potabile (2 mg / ml con il 2,5% di saccarosio) per almeno 14 giorni. </li></ol> 2. Spatial modello di separazione-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Tutti i test comportamentali dovrebbe essere effettuata secondo le linee guida internazionali e locali. </li><li> IMPORTANTE! Utilizzare solo topi maschi con una età di sei mesi o più. La differenza di età tra gli animali di una serie di test deve essere inferiore a quattro giorni. La prova deve essere eseguita dallo stesso operatore per ogni serie. I topi dovrebbe ricevere una dieta standard prima del test per aumentare ulteriormente la motivazione parzialmente guidata da comeweet ricompensa in cibo. </li><li> Impostare una piastra circolare bianco fatto da plastica dura (diametro 120 cm, vedi figura 5A) in un e umidità ambiente a temperatura controllata (22 ° C), illuminata con almeno 4 x 80 W e 3 x 215 W lampade fluorescenti al neon . IMPORTANTE! Garantire la corretta illuminazione è usata, come la motivazione dei topi per entrare nelle case di cibo è in parte guidato dalla loro avversione per luminose, luoghi esposti. </li><li> Impostare il sistema video-tracking. La telecamera deve essere posizionata 115 centimetri al di sopra del centro della piastra (vedi figura 5A). </li><li> Attaccare multicolore spunti extra-labirinto (EMC) per un panno di colore bianco in posizioni ben visibili per gli animali, circa 100 cm dal bordo della piastra (vedi figura 5A). </li><li> Pulire accuratamente la piastra con un rapido disinfettante che può rimuovere qualsiasi odore dal set-up sperimentale. </li><li> Posizionare sette identiche case gialle alimentari (12 cm x 7 cm x 8 centimetri, vedere Figura 5A </strong&gt;) sulla piastra bianca. Le posizioni dovrebbero essere inequivocabilmente contrassegnati (vedi figura 5A). </li><li> Posizionare dolci ricompense pellet cibo (un quarto di una casa Froot Loop / cibo Kellogs `s) all&#39;interno di tutte le case di cibo sulle posizioni definite (vedi Figura 5A) con una sola casa cibo definito essere liberamente accessibili per l&#39;animale (posizione F, si veda la Figura 5A ). Chiudere le case alimentari non bersaglio con un foglio trasparente. </li><li> Prima della prova, eseguire assuefazione (un giorno prima di iniziare l&#39;attività). Fai tutte le case alimentari liberamente accessibile e permettere ai topi di esplorare il labirinto liberamente e per recuperare una ricompensa pellet alimentare (10 min / animale). </li><li> Accendere il computer e la fotocamera e avviare il software di sistema di video-tracking. </li><li> Avviare la registrazione. </li><li> Posizionare l&#39;animale al punto iniziale definito sulla piastra circolare (Figura 5A, S: posizione iniziale) e permettere ai topi per cercare la casa cibo di destinazione per 10 min. </li><li> Stop video-tracking. </li><li> IMPORTANTE! Pulire la piastra circolare e le case alimentari dopo ogni prova con un rapido disinfettante. </li><li> Ripetere la prova giorno per sette giorni consecutivi (per animale). </li><li> Analizzare i risultati (latenza, distanza percorsa e errori) utilizzando il software di statistiche adeguate. Definire gli errori come avvicinarsi alla casa cibo sbagliato e / o contatto con l&#39;apposita casella senza entrare e recuperare la ricompensa pellet cibo. Per l&#39;analisi raggruppati utilizzare ANOVA a due vie con il test di Bonferroni post-hoc. </li><li> (FACOLTATIVO) Sacrifica i topi e analizzare il dell&#39;ippocampo come descritto di seguito. </li></ol> 3. BrdU Etichettatura <ol><li> Iniettare per via intraperitoneale 50 mg / kg ip BrdU una volta al giorno per 3 giorni (analisi di differenziazione e integrazione) o ip 200 mg / kg per una singola iniezione (analisi della proliferazione). </li><li> Sacrificare gli animali, sezionare l&#39;ippocampo e preparare 40 sezioni micron come descritto di seguito. </li><li> Denaturate l&#39;sezioni con 2 M HCl per 10 min e incubare in 0,1 M tampone borato per 10 min. </li><li> Etichettare una serie uno su dodici di 40 sezioni micron (240 micron a parte) da ciascun animale immunoistochimiche, come descritto di seguito utilizzando anticorpi diretti contro BrdU. </li><li> Quantificare le cellule marcate mediante analisi al microscopio confocale in tutta l&#39;estensione rostrocaudale dello strato di cellule dei granuli e la zona subgranular. Moltiplicare i numeri risultanti per 12 per ottenere il numero totale stimato di cellule BrdU marcato per ippocampo e dividere per due per ottenere il numero totale di cellule marcate per DG. </li></ol> 4. La rimozione dei cervelli e preparazione di criosezioni da Nonperfused Animali <ol><li> Osservare le procedure approvate a livello locale per eutanasia degli animali. I topi possono essere eutanasia direttamente da dislocazione cervicale. </li><li> (OPTIONAL) Gli animali possono essere anestetizzati prima euthanization secondo le linee guida locali e internazionali, ad esempio inje intraperitonealection di 0,8 ml Avertin per un mouse 33 g (appena fatto mescolando 150 ml di soluzione fatta di 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol in 1 ml di etanolo isoamyl con 1,85 ml di soluzione fisiologica o tampone fisiologico). </li><li> Sterilizzare la testa con Betadine (10% povidone-iodio)-garza imbevuta e tampone, successivamente con una garza imbevuta di etanolo al 70%. </li><li> Decapitare l&#39;animale utilizzando opportuni forbici chirurgiche e tirare la pelle da parte. </li><li> (OPZIONE) fissatori possono essere adottate per evitare di ripiegamento della pelle ritardato. </li><li> Effettuare una incisione mediana nel cranio e tirare con attenzione i frammenti di cranio da parte. </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;intero cervello con uno strumento chirurgico adeguato (ad es Moria Spoon). </li><li> Preraffreddare 25 ml di 2-metilbutano in un becher da 50 ml (ad es Schott Duran) a -30 a -40 ° C in ghiaccio secco. Nota: Per la colorazione libera fluttuazione delle sezioni &quot;spesse&quot;, che sono ideali per microscopio confocale a scansione laser, rimuovere il cervello, lavare 3volte in tampone e conservare a 4 ° C in tampone fosfato soluzione di saccarosio al 30% in 50 ml di tubo fino al cervello ha affondato giù alla parte inferiore (tipicamente durante la notte). </li><li> Posizionare con cura il cervello su un pezzo di Nescofilm (Parafilm) e coprire con grande quantità di composto TissueTek ottobre, congelare il Nescofilm in 2-metilbutano, conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: Per la conservazione a lungo tempo a -20 ° C in negozio il 9% di saccarosio, 7 MgCl 2 mM, 50 mM tampone fosfato, 44% glicerolo. </li><li> Tagliare il cervello in 10-12 micron di spessore sezioni su appropriate cryomicrotome. Nota: Per spessore, sezioni free-floating, congelare cervello su cryotome fase di un&#39;adeguata cryotome (es. Reichert Jung, Frigomobil.) E tagliare 40 micron sezioni orizzontali a -20 ° a - 25 ° C. Raccogliere sezioni da coltello con pennello fine e raccogliere in tampone o mantenere in soluzione di storage (punto 4.9) a -20 ° C per la conservazione a lungo tempo. </li><li> Montare con cautela due fette su vetrini da microscopio singoli. Il use di vetrini Superfrost UltraPlus è altamente consigliato per massimizzare l&#39;adesione delle sezioni. </li><li> Essiccare i vetrini per 5 min a temperatura ambiente. I vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 5. Preparazione di sezioni da irrorati Animali <ol><li> Anestetizzare gli animali come descritto sopra (passo 4.2). </li><li> Profumato con attenzione l&#39;animale transcardially con tampone fosfato (PBS) contenente eparina (0,025 g/100 ml PBS) e procaina (0,5 g/100 ml PBS) per 2-4 min, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min . Perfusione viene eseguita in modo ottimale mediante perfusione attraverso il ventricolo sinistro e l&#39;apertura dell&#39;atrio destro utilizzando una pressione idrostatica di circa 1,2-1,4 m o utilizzando una pompa peristaltica impostato a circa 15 ml / min. Risultati di perfusione ottimale in un cervello bianco pallido, con vasi sanguigni rossi essere visibile. </li><li> Sezionare e post-fissare i cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Cryoproteggere i cervelli in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per almeno 24 ore. </li><li> Congelare il cervello sul palco cryotome. </li><li> Preparare 40 micron sezioni orizzontali di intere forebrains utilizzando un cryotome appropriato. </li><li> I vetrini possono essere conservati in soluzione crioprotettore (tampone fosfato 0,1 M, 50% glicerolo, 0,14% MgCl 2, 8,6% di saccarosio) a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 6. L&#39;immunoistochimica di sezioni di cervello di Nonperfused Animali <ol><li> Post-fissare le criosezioni, preparate come sopra descritto, utilizzando -20 ° C metanolo freddo per 10 min. </li><li> Bloccare con siero normale 5% contenente 0,3% Triton-X (dalla specie che è stato utilizzato per sollevare l&#39;anticorpo secondario) per una notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi primari notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per un&#39;ora. </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Counterstain la sezione di DNA utilizzando Sytox verde, o DAPI (o un colorante DNA alternativo). </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento. </li><li> Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per almeno 48 ore. </li></ol> 7. L&#39;immunoistochimica di sezioni di cervello di perfusione Animali <ol><li> Blocca come descritto nel passaggio 6.2 e successivamente incubare le sezioni di cervello fisse in soluzione di anticorpo primario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (fluttuante) notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS 1x e incubare in soluzione di anticorpo secondario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (liberamente fluttuante) a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Sciacquare 3x con 1x PBS </li><li> Controcolorare la sezione di DNA utilizzando Sytox verde o DAPI (o un colorante DNA alternativo). </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x </li><li> Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento. </li><li> Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per unt almeno 48 ore. </li></ol> 8. Indagine su Mossy fibra Proiezioni <ol><li> Sacrificare gli animali, preparare 40 micron sezioni coronali come descritto sopra e macchiare la sezione dell&#39;ippocampo utilizzando un anticorpo per neurofilament M. </li><li> Scansione delle sezioni alla lunghezza d&#39;onda appropriata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser per visualizzarne le fibre coperte di muschio e nuclei. Avviare la scansione a basso ingrandimento. </li><li> Utilizzare le immagini a basso ingrandimento per l&#39;orientamento e indirizzare l&#39;ippocampo con le proiezioni in fibra di muschio. </li><li> Scansione delle sezioni (z-sezionamento) ad alta risoluzione e alto ingrandimento. </li><li> Analizzare l&#39;aspetto morfologico e la connettività delle fibre muschio visualizzate tramite colorazione per NF-M. </li><li> (OPTIONAL) Analizzare le dimensioni e il volume di lame dell&#39;ippocampo. Utilizzare il segnale DNA per le misurazioni. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (neuronale morte cellulare) <ol><li> Sacrificare gli animali, sezionare il hippocAmpus, e preparare 12 sezioni micron come descritto sopra. </li><li> Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Fissare le sezioni in PFA 4% per 40 min a temperatura ambiente. </li><li> Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Incubare le sezioni con permanganato di potassio 0,06% (KMnO 4) per 10 min in continuo, agitando delicatamente. </li><li> Lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Incubare le sezioni con 0,002% di soluzione Fluoro-Jade C per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> (Opzionale) per colorazioni nucleari simultanee, una soluzione 0,002% Fluoro-Jade C può essere completato con 10 mg / ml DAPI. </li><li> Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH 2 O. </li><li> Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le sezioni con xilene (1 min) </li><li> Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene (DPX). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l&#39;inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei d...

Ontologicamente, l&#39;ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E &#39;responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l&#39;orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l&#39;ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le cosiddette fibre di muschio (assoni delle cellule granulari). Fino alla fine del secolo scorso, il cervello dei mammiferi adulti è stato creduto di essere un organo statico privo di plasticità e neurogenesi cellulare. Tuttavia, durante gli ultimi due decenni, una crescente quantità di prove dimostra chiaramente neurogenesi adulta si svolgono in almenodue regioni del cervello, la zona subventricolare (SVZ) e la zona subgranulare dell&#39;ippocampo. I nostri studi precedenti, e quelli di altri gruppi, hanno dimostrato che il fattore di trascrizione NF-kB è uno dei regolatori molecolari cruciali della neurogenesi adulta, e che i suoi risultati de-regolazione di gravi difetti strutturali dell&#39;ippocampo e menomazioni cognitive 1-6. NF-kB è il nome generico di un fattore di trascrizione inducibile composto da diverse combinazioni dimeriche di cinque-DNA-binding subunità: P50, P52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), gli ultimi tre dei quali hanno domini di transattivazione. All&#39;interno del cervello, la forma più abbondante nel citoplasma è un eterodimero di p50 e p65, che viene mantenuto in una forma inattiva da inibitore di kappa B (IkB)-proteine. Per studiare e manipolare direttamente neurogenesi NF-kB-driven, usiamo modelli di topi transgenici per consentire semplice inibizione di tutti i subun NF-kBsua, specificamente nel proencefalo 7 (vedi figura 1). A questo scopo, abbiamo Incrocio le seguenti linee di topo transgenico, IkB / - e -/tTA. Il transgenico IkB / - linea è stata generata utilizzando un mutante negativo trans-dominante di NF-kB-inibitore IκBa (super-repressore IκBa-AA1) 8. In contrasto con il wild-type IκBα, IκBα-AA1 è dotato di due residui di serina mutati di alanina (V32 e V36), che ostacolano la fosforilazione e la successiva degradazione del proteasoma dell&#39;inibitore. Per prosencefalo espressione di specifici neuroni del IκBa-AA1-transgene, IkB / - topi sono stati incrociati con i topi ospitare una chinasi calcio-calmodulina-dipendente IIα (CAMKIIα)-promotore che può essere guidato da tetraciclina trans-attivatore (AS) 9. p65 topi knock-out hanno un fenotipo letale embrionale, a causa della massiccia apoptosi fegato 10, quindi l&#39;approccio qui illustrato fornisce un metodo eleganteper indagare il ruolo di NF-kB in postnatale e neurogenesi adulta. Il test classico comportamentale per studiare l&#39;apprendimento spaziale e la memoria è stata descritta nel 1980 da Richard Morris, un test noto come Morris water-maze (MWM) 11. In questo open-campo di acqua-labirinto, animali imparano a fuggire da acqua opaca su una piattaforma nascosta basata su orientamento ed extra-labirinto spunti. Una variante secca MWM è il cosiddetto labirinto Barnes (BM) 12. Questo test utilizza una piastra circolare con 20 fori circolari disposti al confine di un piatto, con un foro definito come una scatola di fuga, e visivi spunti extra-labirinto per l&#39;orientamento. Entrambi i paradigmi sperimentali si basano sul comportamento in volo indotto da un roditore `s avversione per l&#39;acqua, o spazi aperti e luminosi illuminati. Entrambi i test permettono un&#39;indagine di orientamento spaziale, e le prestazioni della memoria correlati. Sebbene l&#39;ippocampo gioca un ruolo generale ed essenziale nella formazione della memoria spaziale, l&#39;ippocampo rEGIONI coinvolti variano a seconda del test applicato. La memoria testato in BM deriva da attività neuronale tra la corteccia enthorinal (CE) ei neuroni piramidali situate nella regione CA1 dell&#39;ippocampo senza il contributo della DG 13-16. In particolare, il classico BM si basa principalmente sulla navigazione tramite temporo-ammonico percorso monosinaptico da CE III CA1 CE V. È importante sottolineare che il DG è cruciale coinvolto nella cosiddetta pattern recognition spaziale 17, che non solo comporta il trattamento dei informazioni visive e spaziali, ma anche la trasformazione di rappresentazioni o di ricordi simili in rappresentazioni dissimili, non sovrapposti. Questo compito richiede un circuito tri-sinaptica funzionale da CE II alla DG per CA3 a CA1 e CE VI, che non può essere provato nel BM 15. Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato SPS-BM come test comportamentali per verificare specificamente le prestazioni giro-dipendente dentate cognitive in collaborazioneanimali ntrol, e nel modello super-repressore IkB / tTA seguente inibizione di NF-kB. È importante sottolineare che, in contrasto con la MWM o la BM, il SPS-BM può rivelare sottili deficit comportamentali derivanti dal deterioramento della neurogenesi. Poiché spaziale-modello-separazione è strettamente dipendente da un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, questo test è altamente sensibile a potenziali cambiamenti di neurogenesi, modifiche del percorso fibra di muschio o alterazioni dell&#39;omeostasi del tessuto all&#39;interno del DG. Tecnicamente, il set-up del nostro test si basa sullo studio da Clelland et al., In cui il modello di separazione spaziale è stato testato utilizzando un legno 8-braccio braccio radiale labirinto (RAM) 19. Nel nostro modificata set-up, le otto bracci sono stati sostituiti da sette identici alimento case gialle. In sintesi, i metodi qui riportate, compresa l&#39;analisi dei DCX (+), le cellule-doublecortin esprimono all&#39;interno dell&#39;ippocampo, le proiezioni in fibra di muschio, neuronale delle cellule death e in particolare la SPS-BM qui presentato, può essere applicato a ricerche di altri modelli del mouse incorporano transgeni che hanno un impatto sulla neurogenesi adulta. Ulteriori applicazioni possono comprendere lo studio di agenti farmacologici e misurare il loro impatto sulla separazione modello DG e spaziale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Moria MC17 Perforated Spoon&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td style="width:132px;">10370-18</td>
			<td style="width:167px;">removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi SV8</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SuperFrost Slides</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td align="right">1879</td>
			<td>slides for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">TissueTek OCT compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:132px;">1004200018</td>
			<td>embedding of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">005-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Rabbit Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">011-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">017-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Neurofilament-M antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>2H3</td>
			<td>IHC, Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-doublecortin&#160;antibody</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>IHC, Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-GFP antibody</td>
			<td>ab290</td>
			<td>abcam</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td>OBT0030G</td>
			<td>Accurate Chemicals</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Fluoro Jade-C</td>
			<td>FJ-C</td>
			<td>HistoChem</td>
			<td>Determination of neuronal cell death</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Betadine</td>
			<td style="width:127px;">&#160;MUNDIPHARMA</td>
			<td>D08AG02&#160;</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>preparation of brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3393</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)</td>
			<td style="width:127px;">lab made</td>
			<td style="width:132px;">none</td>
			<td>plate for SPS-BM, diameter 120cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buraton rapid disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sch&#252;lke &#38; Mayr</td>
			<td style="width:132px;">113 911</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2</td>
			<td>tse systems</td>
			<td style="width:132px;">302050-SW-KIT</td>
			<td>tracking and analysis of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>permeabilisation/IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">cryotome</td>
			<td style="width:127px;">Reichert&#160; Jung/Leica</td>
			<td style="width:132px;">Frigomobil 1206</td>
			<td>preparation of 40&#181;m brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth&#160;</td>
			<td>Art.-Nr. 0713</td>
			<td>embedding of the slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SYTOX green</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Food pellets (Kellog`s Froot Loops)</td>
			<td>Kellog`s</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:447px;">Prism, Version 3.0</td>
			<td style="width:127px;">Graph Pad Software, San Diego, USA&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Statistical evaluation of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Zen 2008 or Zen 2011 Software</td>
			<td style="width:127px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Software (Confocal microscope)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">D.P.X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">317616</td>
			<td>mounting medium for Fluoro Jade C staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the modulation and analysis of nf-&#954;b-dependent adult neurogenesis

L&#39;ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l&#39;ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell&#39;ippocampo è un&#39;area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l&#39;inibizione neuronale specifico proencefalo dell&#39;attività di NF-kB può essere utilizzato. In questo studio, sono descritti metodi per l&#39;analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l&#39;uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l&#39;influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.

Incroci delle IkB / - linee topo transgenico e tTA porta all&#39;inibizione condizionale dell&#39;attività di NF-kB nell&#39;ippocampo. Per studiare l&#39;espressione del IκBα-AA1-transgene nel doppio topo transgenico (Figura 1A), i cervelli sono stati isolati, cryosectioned e colorazione con un anticorpo contro GFP (green fluorescent protein). Microscopio confocale a scansione laser rivelato alta espressione del transgene nelle regioni CA1 e CA3, e nella...

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Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Sono descritti metodi per la manipolazione e l&#39;analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

14.2K Views.  University of Bielefeld.  Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali. 

Video: Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Casting cerebrovascolare del topo adulto per l&#39;imaging 3D e analisi morfologica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Il Hindbrain Mouse come modello di studio della neurogenesi embrionale

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...