We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafish sono stati mantenuti nella struttura pesci dell&#39;Istituto di Tossicologia e Genetica (ITG) a Karlsruhe Institute of Technology (KIT). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme di protezione degli animali tedeschi e sono stati approvati dal governo del Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Germania (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Generazione di una coltellata nel Telencefalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Per preparare una soluzione stock di tricaine (3-ammino benzoico etile, chiamato anche etil 3-amminobenzoato) utilizzano 400 mg di polvere tricaine e dissolverlo in 97,9 ml di acqua e 2,1 ml di 1 M Tris / HCl (pH 9). Regolare il pH a 7. Fai aliquote di 5 ml e conservare a -20 ° C fino al loro utilizzo. </li><li> Trasferire un numero adeguato di 0,5-1 anni zebrafish dai loro carri armati in gabbie di plastica del mouse. Nota: Il cranio di un zebrafish adulto a circa 12mesi di età è ancora relativamente morbido e verranno perforati facilmente con un ago (vedere la sezione 1.2.3 e Figura 1A). </li><li> Per anestetizzare il zebrafish adulto, unire 5 tricaine ml (soluzione) in una gabbia incrocio di plastica con ~ 100 ml di acqua acquario pulita (concentrazione finale del tricaine 0,02% (w / v) tricaine). </li><li> Incubare il pesce in anestetici fino a che non si muovono più (45-60 sec). </li></ol></li><li> Telencefalo Injury <ol><li> Inserire individuo anestetizzato zebrafish in una fessura in un blocco di schiuma tricaine-impregnati. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione con luce dall&#39;alto tenere delicatamente il pesce con una mano e orientarlo in modo tale da consentire l&#39;accesso alla testa dall&#39;alto. </li><li> Con l&#39;altra mano spingere una siringa da 30 G (siringa da insulina con ago integrato) verticalmente attraverso il cranio nella regione mediale di un emisfero telencefalico (Figure 1A-1B). Gli emisferi del telencefalo unnuovamente visibile attraverso il cranio. Assicurarsi che la lesione introdotta non è più profondo di 2 millimetri (Figura 1C). Nota: Si raccomanda di introdurre la lesione sempre nello stesso emisfero per facilitare l&#39;identificazione del sito di lesione quando sezionare il cervello dal cranio. </li><li> Dopo aver introdotto l&#39;infortunio telencefalica, mettere il pesce in acqua il pesce fresco. Continuate a 10 pesci in una gabbia 2 L del mouse riempito d&#39;acqua i pesci per il recupero e collegare la gabbia del mouse ad un sistema di flusso d&#39;acqua. Nota: Il tasso di sopravvivenza è di solito ~ 97% se i pesci sono sani e non altri esperimenti sono stati effettuati con il pesce prima. L&#39;aggiunta di antibiotici all&#39;acqua pesce non è necessario. Dopo il recupero, i pesci si comportano normalmente: nuotano, mangimi, e il compagno. </li></ol></li></ol> 2. Analizzando l&#39;effetto di telencefaliche Injury <ol><li> Cervello Dissection e Fixation <ol><li> Re-anestetizzare il pesce recuperato a tempi diversi dopo la lesione (typically, 1, 3, 5, e 14 giorni dopo lesione (dpl)) con 0,02% (w / v) tricaine come sopra e li eutanasia mettendoli in acqua e ghiaccio per 5 min. </li><li> Mettere il pesce su un fazzoletto di carta imbevuta di tampone fosfato salino (PBS) e separare la testa dal corpo tagliando dietro le branchie con una forbice affilata. </li><li> Conservare le teste in 1x PBS per 5 minuti per consentire sanguinamento. Nota: Questo drena il sangue dal tessuto, che può turbare ulteriori passi nel protocollo. </li><li> Fissare le teste notte a 4 ° C in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS o 4 ore a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare teste fisse due volte con PBS 1x in una capsula di Petri. </li><li> Sezionare il cervello con cura in 1x PBS sotto un microscopio da dissezione 23. La lesione è di solito visibile sotto il microscopio da dissezione. Brains senza una lesione visibile devono essere eliminati. </li><li> Trasferire il cervello in 2 provette ml riempiti con 1,5 ml di metanolo 100% (MeOH) e invertire i tubi 5x prima incubazioneli a -20 ° C per almeno 16 ore. Nota: I cervelli possono essere conservati per alcuni mesi in MeOH a -20 ° C fino al momento della immunoistochimica o ibridazione in situ. </li></ol></li><li> Preparazione di tessuto per immunoistochimica <ol><li> Reidratare il cervello attraverso una serie di metanolo discendente in 2 ml di tubi di plastica (sequenza 75% MeOH (1x PBS, 0.1% Tween-20 = PTW). MeOH 50%, 25% MeOH Incubare il cervello (15 cervella / 2 ml tubi di reazione ) per 5 min in ciascuna soluzione. </li><li> Lavare i cervelli in PTW per 5 min. Ripetere 4x con fresco PTW. </li></ol></li><li> Incorporare le Brains per il sezionamento <ol><li> Per incorporare, trasferire i cervelli dal tubo da 2 ml in PTW nelle cavità di un vassoio tazza stampaggio di polietilene con una pipetta di trasferimento (5 mm di diametro). </li><li> Preparare 2% agarosio (grado DNA) in 1x PBS in una beuta. Riscaldare nel forno a microonde a 600 W fino a quando l&#39;agarosio è disciolto completamente. Preparare 50 ml per 10 cervelli. Lasciate the raffreddare rivolto verso il basso per 3 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Mantenere l&#39;agarosio su una piastra riscaldante pre-riscaldato (60 ° C) mentre incorporamento cervello per evitare la solidificazione. </li><li> Rimuovere la PBS 1x dallo stampo contenente un cervello utilizzando una pipetta Pasteur (diametro 1 mm). Fare attenzione a non danneggiare il cervello. </li><li> Versare agarosio nello stampo e riempirlo del tutto. Quindi utilizzare un ago dissezione a turbinare il cervello in agarosio per lavare via il PTW rendendo più facile incorporare il cervello. </li><li> Orientare il cervello nella parte ventrale dello stampo verso il basso, lato dorsale e posizionarlo dritto. </li><li> Lasciare che il agarosio raffreddare. Per il raffreddamento più veloce, posizionare lo stampo sul ghiaccio. Ripetere i passaggi. </li><li> Ripetere 2.3.3-2.3.6 per tutti i cervelli. </li></ol></li><li> Taglio del agarosio Block <ol><li> Utilizzando un ago dissezione, estrarre il blocco di agarosio. </li><li> Con una lama di rasoio affilata, tagliare l&#39;agarosio alla fine posteriore del cervello. Assicurarsi che questo piano è parallelo al TElencephalon. </li><li> Tagliare il agarosio al termine anteriore del cervello. Poi capovolgere il blocco in modo che si erge sul piano posteriore. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di agarosio tagliando in parallelo alla dorsale del cervello e lati ventrali. Poi capovolgere il cervello indietro in modo che giaccia sul suo lato ventrale. </li><li> Tagliare il blocco di un triangolo troncato in cui telencefalo si trova in corrispondenza del piano inferiore (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparazione del Vibratome per il sezionamento <ol><li> Preparare il vibratome secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una nuova lama di rasoio e sostituirlo dopo 10 cervelli. </li><li> Riempire la vasca tampone con PBS 1x a un livello che raggiunge solo la parte inferiore della lama. </li><li> Collocare un piccolo punto di colla sulla parte superiore del disco esemplare di vibratome. </li><li> Posizionare accuratamente il piano che si trova posteriormente al cervello sulla colla. La colla si indurisce appena è a contatto con il PBS 1x inla vasca del buffer vibratome. </li><li> Inserire il disco campione con il campione nel cassetto buffer utilizzando il manipolatore del microtomo. </li><li> Utilizzare il manipolatore per ruotare il disco di preparato nella posizione desiderata. Orientare il blocco nel bagno buffer in modo che individua telencefalo appena sotto la superficie, con la parte dorsale del cervello di fronte alla lama. Quindi serrare il SCRW con una chiave a brugola 3 mm e rimuovere il manipolatore. Nota: La vite di serraggio o uno dei dispositivi di fissaggio non devono trovarsi sul buco nel disco di preparato; in queste posizioni di bloccaggio del disco di preparato non è possibile. </li></ol></li><li> Sezionato il cervello <ol><li> Preparare una piastra da 24 pozzetti per raccogliere le sezioni. Per cervello da sezionare, riempire un pozzetto di 1 ml di tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) di siero albumina bovina (BSA), 1% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) in PBS). </li><li> Inizia sezionamento a 50 micron di spessore, velocità di 1 mm / sec e 70 Hzutilizzando un microtomo vibrante. </li><li> Utilizzare un pennello sintetico (1 mm) per raccogliere le fettine di agarosio come vengono fuori la lama e li raccolgono nella piastra da 24 pozzetti. </li></ol></li><li> Immunoistochimica su vibratome Sezioni <ol><li> Bloccare non specifici siti di legame per 1 ora a RT in tampone di bloccaggio (0.1% (v / v) 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO in PBS). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 250 microlitri di anticorpo diluito in tampone di bloccaggio notte a 4 ° C. In alternativa, incubare l&#39;anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: Per la colorazione PCNA utilizzare una diluizione 1:400 (topo anti-PCNA Per i dettagli si veda tabella dei materiali.). Anticorpi primari multipli possono essere incubate allo stesso tempo. </li><li> Incubare le sezioni anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente poi lavare 3x per 10 min a PTW. Nota: 1:1000 diluizione in PTW, per i dettagli vedere la tabella dei materiali. Anticorpi secondari multipli possono essere incubate allo stesso tempo. </li><li&gt; Opzionale: I migliori risultati si osservano quando le sezioni sono tenuti in PTW notte a 4 ° C per consentire il lavaggio di anticorpi secondari non specificatamente legato. In questo caso, sostituire il PTW ancora una volta prima del montaggio. </li></ol></li><li> Adulto RNA Cervello in situ ibridazione (in alternativa a immunoistochimica) <ol><li> Cervello Dissection e Fixation (stessa procedura per immunoistochimica): <ol><li> Ibridazione di sonda. </li><li> Reidratare il cervello in 2 provette ml come descritto per immunoistochimica. </li><li> Incubare cervelli in proteinasi K (ProtK;. 10 ug / ml conc finale) in PTW per 30 min. Dopo il periodo di incubazione rimuovere ProtK / PTW e fissare di nuovo il cervello per 20 minuti in BT-Fix (4% PFA, 4% di saccarosio, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> Lavare cervelli 5x per 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> Rimuovere PTW e sciacquare il cervello in 500 microlitriTampone HYB (50% (v / v) formammide deionizzata, 5x SSC, 500 ug / ml tRNA di lievito, 50 ug / ml di eparina, 0.1% Tween-20, 9 mM citricacid). Attendere fino cervelli depositano sul fondo della provetta poi scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone HYB pulito e incubare a 65-70 ° C per 3-4 ore. </li><li> Diluire la sonda di RNA a 1:200 o 1:400 (in base alla sonda) in volume finale di 400 microlitri di tampone HYB. Riscaldare la sonda RNA diluito a 70 ° C per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante dal cervello e aggiungere la sonda RNA, incubare a 65-70 ° C (O / N). Tutte le soluzioni tampone di lavaggio devono essere preriscaldata e mantenuti a 70 ° C. </li></ol></li><li> Etichettatura <ol><li> Lavare il cervello a 65-70 ° C (durante tutte le 4 fasi di lavaggio) con 500 ml di tampone di lavaggio 1 (50% formammide, 1x SSC, 0,05% Tween 20) due volte per 30 min. Sostituire tampone 1 di tampone 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), e incubare per 15 min. Rimuovere il tampone 2 e lavare il cervello in tampone 3 (0.2x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 min, ripetere questa operazione due volte. Sostituire il tampone 3 da buffer di 4 (SSC 0.1x, 0.05% Tween 20 in PTW), incubare per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare per 5 minuti in 500 ml di PTW a RT. </li><li> Cervelli incorporare nel 2% agarosio (in 1x PBS) e tagliare vibratome sezioni (50-100 micron), come descritto per immunoistochimica. </li><li> Lavare 1x per 5 min in 500 microlitri di tampone bloccante (1x PBS, 0.1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) di DMSO). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 300 microlitri anti-Dig anticorpo AP-coupled diluito 1:4,000 in tampone di bloccaggio. </li><li> Incubare o / n a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP colorazione <ol><li> Lavare 5x per 15 min con tampone PTW a RT. </li><li> Sciacquare 1x in tampone colorazione. Lavare due volte 5 min in tampone colorazione (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20). </li><li> Rimuovere il surnatante e macchia con 500 μl soluzione colorante (3,5 ml di 4-Nitroblue cloruro tetrazolio (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) per 1 ml di tampone colorazione). </li><li> Smettere di colorazione risciacquando 3x a 5x con PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montaggio delle sezioni <ol><li> Montare le sezioni su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio non fluorescente solubile in acqua (vedere la tabella dei materiali). </li><li> Conservare i vetrini in frigorifero a 4 ° C. Nota: La colorazione è stabile per diverse settimane o addirittura mesi. </li><li> Analizzare le diapositive sotto un composto o microscopio confocale. </li></ol></li></ol>

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J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo qui un metodo per indurre una lesione telencefalico premendo un ago attraverso il cranio del zebrafish adulti, e per analizzare la reazione cellulare e molecolare di questa lesione mediante immunoistochimica e ibridazione in situ. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti è la sua semplicità, velocità ed economicità. Pertanto, questa tecnica, che permette la produzione di molti cervelli feriti in breve tempo, può essere facilmente combinato con una grande scala in schermo ibridazione in situ per identificare geni con un ruolo nella rigenerazione e neurogenesi. L&#39;età del zebrafish adulti su cui viene eseguita la lesione è cruciale. Se i pesci sono più vecchi di 1,5 anni, il cranio è troppo duro ed è possibile che il cranio viene spinto verso il basso o fratturato anziché pulito forata. Al contrario, in esemplari più giovani (di età inferiore ai 4 mesi), c&#39;è ancora un sacco di neurogenesi in corso, che potrebbe lead di risultati falsi positivi per quanto riguarda la neurogenesi reattiva. Un altro passo fondamentale in questo approccio è quello di verificare l&#39;efficienza del coltellata e di escludere che entrambi gli emisferi sono feriti. Questo può essere monitorato mediante colorazione delle sezioni con l&#39;anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata in uno solo degli emisferi. È importante tenere presente che il danno meccanico indotto una serie di effetti collaterali come l&#39;ablazione non specifica delle cellule, aumento della morte cellulare a causa della degenerazione secondaria, infiammazione e distruzione della barriera emato-encefalica, e danni di zona ventricolare e come una possibile conseguenza flusso del fluido cerebrospinale nel parenchima cerebrale. Tuttavia, i pesci feriti sembrano soffrire molto poco dall&#39;infortunio. Entro 2 minuti sono di nuovo nuoto libero e normale comportamento alimentare viene ripristinato nel giro di circa 4 ore. Dopo 3 settimane l&#39;injury non è morfologicamente più visibili. Nelle nostre mani, da diverse centinaia di interventi chirurgici non abbiamo perso un solo pesce, nonostante il fatto che abbiamo avuto un tasso di infortuni al 100% come valutato dal istologia a 5 giorni dopo la lesione. Negli ultimi anni sono state sviluppate altre tecniche come approcci transgenici in zebrafish per produrre tessuti o tipo cellulare ablazione specifico 2. Sebbene queste tecniche sono molto eleganti e minimamente invasiva si basano sulla generazione di complessi costrutti di DNA e la creazione di diverse linee transgeniche zebrafish stabili che possono essere molto noioso e che richiede tempo. Pertanto, semplici approcci meccanici quali il test descritto in questo protocollo restano uno strumento importante studiare adulto neurogenesi cervello e rigenerazione.

I mammiferi hanno una capacità molto limitata di generare nuovi neuroni durante la vita adulta, e la neurogenesi adulta nel cervello è in gran parte limitato a due regioni telencefalici situate nella zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali, e la zona subgranulare (SGZ) del dentate circonvoluzione nell&#39;ippocampo 1. Mammiferi inoltre, non può riparare i danni del cervello causata da malattie neurodegenerative, ictus o lesioni, in modo efficiente. Neuroni persi non vengono sostituiti e invece proliferazione di differenti tipi di cellule gliali, compresi astrociti, microglia, oligodendrociti e, si osserva. Come conseguenza di questo processo proliferativo chiamato gliosi reattiva, il tessuto cerebrale danneggiato è isolata ermeticamente dalla formazione di una cicatrice gliale, che inibisce neuronale e rigenerazione assonale 2-4. A differenza di mammiferi, pesci teleostei come il pesce zebra formare nuovi neuroni abbondantemente in stadi adulti e hanno una rigenerante elevato e proliferative potenziale per riparare lesioni del sistema nervoso centrale 2,5-7. Il cervello adulto zebrafish contiene 16 distinte nicchie staminali neurali che generano un gran numero di nuovi neuroni durante tutta la vita 8-11. I neuroni nati in queste specifiche zone di proliferazione del cervello zebrafish adulto migrano le loro aree di destinazione, dove potranno maturare e integrare nelle reti neuronali esistenti 8,10,12-15. Tra le zone progenitrici identificati in zebrafish adulti, la zona ventricolare telencefalico è una delle nicchie staminali neuronali più studiati. Le cellule in questo progenitore di nicchia possono essere classificate in tre tipi distinti quanto riguarda la loro morfologia, il tasso di divisione e di espressione di gliali diversa o marcatori neuronali. Tipo I e le cellule di tipo II sono gliali radiali come le cellule che hanno processi lunghi. Essi esprimono cellule staminali marcatori tra cui GFAP, nestin, e S100β. Tipo I le cellule non proliferano, mentre le cellule di tipo II proliferate lentamente, come dimostra la loro espressione di marcatori di proliferazione, quali proliferazione cellulare antigene nucleare (PCNA) e l&#39;incorporazione di analoghi desoxythymidine. Le celle di tipo III sono in rapida divisione delle cellule che si sono impegnati a diventare progenitori neurali ed esprimere geni marcatori neurali, come il PSA-NCAM 5,16. Anche se le capacità rigenerative dei pesci teleostei sono ben documentati, solo poche pubblicazioni hanno descritto e studiato in dettaglio i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella rigenerazione neuronale nel telencefalo adulti in risposta al danno 15,17-22. Per decifrare i meccanismi implicati nella zebrafish adulto centro di rigenerazione del sistema nervoso e la riparazione e per comprendere le somiglianze e le differenze tra neurogenesi costitutivo e rigenerativa, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. Qui, descriveremo visivamente come generare un infortunio in uno dei hemisph telencefalicaeres con l&#39;aiuto di un ago di siringa, mantenendo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno. Mostreremo anche come monitorare i cambiamenti su lesioni nella proliferazione cellulare e l&#39;espressione genica mediante immunoistochimica e in saggi di ibridazione in situ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x DPBS (-/-)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14200-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 G syringe (Omnican 40)</td>
			<td>B.Braun Melsungen</td>
			<td align="right">916162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeqGOLD Universal Agarose&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 2835919108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 414</td>
			<td>Sch&#246;ffler und W&#246;rner</td>
			<td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Labonord</td>
			<td align="right">5305103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:163px;">Labonord</td>
			<td align="right">5305060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes 94 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcons 15 ml</td>
			<td style="width:163px;">Greiner bio-one</td>
			<td align="right">188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-S100 (1:500)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-PCNA (1:400)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M087901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GFP (1&#160;:1000)</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Dig AP-coupled antibody&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope Sp5 DM6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Falcon catalog&#160;</td>
			<td align="right">353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td>
			<td align="right">24</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2)</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare il loro sistema nervoso centrale dopo l&#39;infortunio. Per studiare la risposta cellulare ed i meccanismi molecolari coinvolti nella zebrafish adulto sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e la riparazione, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. In questo approccio, generiamo manualmente un infortunio spingendo una siringa di insulina nel telencefalo adulto zebrafish. A diversi giorni di pregiudizio dopo, i pesci sono sacrificati, i loro cervelli sono sezionati fuori e colorate con immunoistochimica e / o ibridazione in situ (ISH) con marcatori appropriati per osservare la proliferazione cellulare, gliogenesi, e neurogenesi. L&#39;emisfero controlaterale unlesioned serve come controllo interno. Questo metodo combinato, ad esempio con l&#39;RNA sequenziamento profondo può aiutare a schermata di nuovi geni con un ruolo nella neurogenesi telencefalo zebrafish adulto, la rigenerazione e la riparazione.

Utilizzando il flusso di lavoro descritto in questo articolo, una lesione è stata introdotta nel emisfero destro di un telencefalo zebrafish adulto (Figure 1A-1B). Una corretta ferimento conduce ad un canale lesione che si estende da dorsale a ventrale attraverso tutta pallio del telencefalo (Figura 3C). La lesione dovrebbe essere limitato a uno degli emisferi e non deve attraversare il ventricolo mediale. Il canale lesione è visibile con il microscopio in campo chiaro (Figura 3C) e verrà guarito dopo circa 35 giorni a 15. È stato precedentemente dimostrato che dopo aver ferito un up-regolazione di proliferazione delle cellule antigene nucleare (PCNA, figura 3A) e S100β (Figura 3B) a 3-7 DPL è rilevabile mediante immunoistochimica 15. La colorazione di PCNA e S100β è sovrapposizione, indicando proliferazione delle cellule gliali radiali. Fnoltre, al fine di visualizzare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), un saggio pugnalata ferita è stata eseguita sul Tg (Olig2: EGFP) Pesci 24. Su colorazione con un anticorpo anti-GFP, accumulo di OPC in prossimità del canale lesione è rilevabile (Figura 3D). Questo accumulo è transitorio, e cluster OPC non si osservano più a 35 dpl 15. Se la lesione non è stato introdotto correttamente, il canale lesione non sarà visibile, e up-regulation di PCNA e S100β o accumulo di OPC non sarà rilevabile. PCNA è il marcatore più sensibile per le lesioni cerebrali. Al fine di verificare l&#39;efficienza del coltellata ed escludere che entrambi gli emisferi sono feriti, si raccomanda di macchiare sempre le sezioni con un anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata (fino a 4 volte 15) in uno solo degli emisferi. Sebbene nella maggior parte dei casi èsufficiente utilizzare solo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno per monitorare i cambiamenti nell&#39;espressione genica, si consiglia vivamente di confrontare l&#39;espressione genica nell&#39;emisfero controllo con l&#39;espressione in emisferi telencefalici di tipo cervelli selvatici. In questo modo, tutti gli effetti sistemici della lesione sull&#39;espressione genica che interesserebbe entrambi gli emisferi possono essere rilevati. La pugnalata ferita dosaggio in combinazione con uno schermo sistematica espressione di regolatori della trascrizione (TRS) (25 e Schmidt et al., Inedito) può anche essere utilizzato per identificare i geni TR con un possibile ruolo nella neurogenesi e rigenerazione (Figure 4A-4C). Questo approccio ha individuato una serie di fattori che sono espressi in telencefalo e la cui espressione è specificamente up-regolata in risposta a lesioni (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Rappresentazione schematica di zebrafish adulto telencefalica stab ferimento. A) L&#39;ago della siringa di insulina viene spinto attraverso il cranio di un zebrafish adulto di generare un infortunio telencefalica. Il bianco linea tratteggiata rappresenta il confine tra i due emisferi telencefalici e la croce verde indica la posizione della coltellata. B) Vista dorsale di un cervello zebrafish adulto. Sono indicate le principali aree cerebrali. La croce verde indica la posizione della lesione indotta. C) La punta dell&#39;ago, che serve per indurre il pregiudizio telencefalica, misure 2 mm. Bulbo olfattivo (ob), telencefalo (tel) e tetto ottico (ot). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. SRappresentazione chematic di un cervello zebrafish adulto in un blocco di agarosio tagliata poco prima vibratomo sezionamento. anteriore è alto. Bulbo olfattivo (ob), telencefalo (tel), tetto ottico (ot), cervelletto (cb) e midollo (m). Scala bar: 500 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Risposte rigenerative per pugnalare lesioni ferita. DC) Adulto cervello zebrafish a 5 giorni dopo il lesione (dpl). AB) Il PCNA proliferativa marcatore (A) e il marcatore gliali radiali S100β (B) sono up-regolati nella zona ventricolare (frecce) sul ferimento stab. (C) Il canale lesione è visibile sotto illuminazione in campo chiaro (frecce). La zona ventricolare è indicato dalla linea verde. (D) le cellule Oligodendrocyte precursori (Olig2: EGFP +) si accumulano nel sito della lesione (frecce). Scala bar: 200 micron. In tutti i pannelli, l&#39;emisfero destro è l&#39;emisfero leso. Dorsale è alto. La linea tratteggiata in A a D indica il confine tra il pallio e la subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Un esempio di geni up-regolati in risposta a pugnalare lesioni. Notare il forte up-regulation (frecce) di eomesa (A, B) e sox4a (C) espressione di mRNA nell&#39;emisfero destro telencefalica (emisfero accoltellato) monitorata mediante ibridazione in situ a 5 dpl. L&#39;emisfero sinistro è illeso e serve come controllo. (B) mostra un ingrandimento maggiore della regione telencefalica dorsale di A. dorsale è alto. Barra della scala: 200 micron per A e C e 55 micron per B. Illinea tratteggiata in A e C indica la separazione tra il pallio e la subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABBREVIAZIONI </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatasi alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albumina di siero bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervoso centrale </td></tr><tr><td> Dig </td><td> Digossigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimetilsolfossido </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Giorni dopo lesione </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin omologo di un </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Proteina acidica fibrillare gliale </td></tr><tr><td> hr </td><td> Ora </td></tr><tr><td> HYBbuffer </td><td> Tampone di ibridazione </td></tr><tr><td> ISH </td><td> ibridazione in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanolo </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-blu tetrazolio </td></tr><tr><td> OPC </td><td> Cellule precursori degli oligodendrociti </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Tampone fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antigene nucleare della proliferazione cellulare </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldeide </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinasi K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialylated neuronale molecola di adesione delle cellule </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0.1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Acido ribonucleico </td></tr><tr><td> RT </td><td> Temperatura ambiente </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box contenente gene 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato di Saline di sodio </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Zona subventricolare </td></tr><tr><td> TR </td><td> Regolatori della trascrizione </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

stab-wound-injury-zebrafish-adult-telencephalon-method-to-investigate

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JoVE Journal

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Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Views.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Video: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

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Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Un metodo per infliggere Chiuso Testa trauma cranico in<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.