Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Science Foundation tedesco (DFG, Ro2327 / 6-1) al CRR Gli autori desiderano ringraziare S. Durry e C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti, e M. Dubbert (Laboratorio di Elettronica, Zoological Institute , Università di Colonia, Germania) per l&#39;aiuto nella realizzazione del controllore di cella di Pockels e l&#39;interruttore HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. 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Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano senza interessi in competizione. Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario che consenta di pubblicazione Open Access da Rapp optoelettronico (Wedel, Germania), che produce uno strumento utilizzato in questo articolo il video. La società è stata né coinvolta negli esperimenti, né nella gestione dei dati, né nella scrittura manoscritto.

Il presente studio dimostra che SBFI è adatto per due fotoni di imaging di transitori di sodio intracellulari in piccoli compartimenti cellulari. Va tenuto presente, tuttavia, che l&#39;efficienza quantica di SBFI è piuttosto bassa 15 e relativi cambiamenti nella concentrazione di sodio è piuttosto piccola con attività fisiologica. Pertanto, la misurazione ad alta risoluzione di transitori Na + nei processi sottili è un compito relativamente noioso, e binning o media di diversi studi può essere necessario per ottenere segnali soddisfacenti. Inoltre, la cinetica di transienti sodio sono sorprendentemente lento, rendendo obbligatoria registrare per periodi di tempo prolungati. Questa osservazione corrisponde a quelle in studi precedenti, in cui il decadimento monoesponenziale dei transitori di sodio in dendriti neuronali e in astrociti è stata caratterizzata da grandi costanti di tempo di decadimento dell&#39;ordine di 10 secondi a temperatura ambiente 1,2,6. Transitori di sodio sembrano quindi esercitare un tempo molto più lento coUrse e molto più grandi costanti di tempo di decadimento rispetto ai transienti di calcio 16. Mettere da parte questi inconvenienti, l&#39;imaging di sodio dimostra di essere un valido strumento per lo studio delle proprietà fisiologiche dei sottodomini neuronali. Ad esempio, l&#39;imaging di sodio può servire per monitorare l&#39;attività sinaptica eccitatoria in o vicino alla sinapsi attive. Poiché il sodio è essenzialmente non tamponato 8,17, transitori sodio attività indotte sono linearmente correlate a una vasta gamma di rilascio di glutammato sinaptico o esogena glutammato applicati. Essi rappresentano quindi indicatori diretti e imparziali di attività glutamatergico neuronale. Inoltre, indicatore di sodio coloranti presentano s &#39;alta K d (di SBFI K d è nel range di 25 mm 1). Anche a concentrazioni relativamente alte di colorante intracellulari utilizzati per raggiungere la luminosità sufficiente (di solito 0,5-1 mM), l&#39;elevato K d &#39;s implica che i coloranti stessi non agiscono come buffer per sodium. Di conseguenza, essi non distorcano l&#39;ampiezza né il tempo corso di transitori di sodio, che è sempre una preoccupazione quando coloranti calcio-sensibili vengono introdotti nelle cellule 18. Si può pertanto ritenere che i segnali rilevati rappresentano una buona misura delle variazioni &quot;reale&quot; in sodio intracellulare. Il loro decorso lento quindi implica che la velocità di diffusione intracellulare del sodio nei neuroni è molto più piccolo di quanto precedentemente ipotizzato 19. Un requisito fondamentale per la corretta esecuzione di esperimenti che riguardano le proprietà di eccitatori vie di trasmissione e afflusso di sodio sinaptiche nelle spine e dendriti è l&#39;induzione di una attivazione veloce e altamente localizzata di strutture post-sinaptici. Questo può essere ottenuta con l&#39;applicazione facile e locale di glutammato o glutammato agonisti nelle immediate vicinanze di una colonna vertebrale o un dendrite dalla fotolisi lampo di composti gabbia. Fotolisi Flash non dama non meccanicamentege il tessuto, è privo di artefatti da movimento ed è ben stabilito per lo studio di questioni connesse (ad esempio la segnalazione di calcio locale). Il diametro dello spot uncaging è stato di 1,5 micron nel piano xy. Uncaging quasi un segnale di sodio spinosi dendrite indotti in entrambe le spine e il dendrite genitore. Considerando che i segnali tendevano ad essere più grande di spine più vicini al posto uncaging, le ampiezze della dendrite genitore e spine più lontano erano ancora piuttosto simili a quelle nelle immediate vicinanze del punto uncaging. Uncaging è stata eseguita per 300 msec durante il quale le correnti interiori aumentate in ampiezza. Glutammato Uncaged avrebbe diffuso nel tessuto durante lo stesso periodo di tempo, l&#39;attivazione di recettori ionotropici del glutammato e afflusso di sodio sulle regioni dendritiche e le spine più lontano dal punto uncaging. Un problema intrinseco che si verifica quando si utilizza un laser UV per fotolisi di composti in gabbia somministrati attraverso la soluzione di balneazione cellulareè &#39;filtraggio interiore&#39;. A causa del tasso di assorbimento elevato della gabbia, la luce UV si attenua fortemente lungo la strada dall&#39;obiettivo al sito di stimolazione 20,21. Un modo pratico per evitare questo è perfusione locale con la gabbia che è limitato solo per il sito di stimolazione, che riduce inoltre la quantità di composto in gabbia necessaria al minimo. Rispetto al uncaging UV scansione laser-mediata, vicino-infrarossi a due fotoni uncaging 22 è spazialmente più precisa, soprattutto perché la precisione della stimolazione aumenta in asse z. D&#39;altra parte, a causa della piccola sezione di gabbie comunemente usati per le lunghezze d&#39;onda più lunghe come impiegati con eccitazione a due fotoni, sia una elevata concentrazione del composto in gabbia o molto elevato, richiedono intensità luminose potenzialmente fototossiche. Inoltre, due fotoni uncaging richiede un investimento molto maggiore nelle attrezzature; tra gli altri, un laser IR supplementare oltre ai componenti ottici richiesti, sono necessari. Sia SBFI e MNI-glutammato sono eccitabili nella gamma di lunghezze d&#39;onda identica. Questo può portare a una interdipendenza involontaria di laser UV uncaging e SBFI o laser per immagini IR e MNI-glutammato, con conseguente sbiancamento della SBFI dal flash uncaging e / o una uncaging continuo di glutammato dal fascio IR. Tuttavia, come mostrato nella Figura 6C, né un lampo UV per sé né la formazione immagine a più fotoni causato tali influenze reciproche nelle nostre condizioni sperimentali. Sistemi UV-in flash simili a quello qui descritto sono utilizzati di routine in molti altri laboratori e possono essere relativamente facilmente incorporati in nessuna microscopio di imaging multi-fotone esistente. Esso offre il vantaggio che il fascio laser per fotolisi può essere posizionato liberamente nel campo visivo. Inoltre, il sistema permette un riposizionamento rapido ed automatico del fascio laser e il volume di rilascio, rispettivamente, nel campo visivo durante un esperimento. Oumodifica r semplifica e migliora il posizionamento accurato dello spot uncaging, in modo che i frame del software di imaging possono servire per regolare fotogrammi di imaging e uncaging congruente. Nel loro insieme, whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in dendriti e spine dei neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging UV-luce-indotta di glutammato, permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. Si può quindi servire per analizzare le proprietà di trasmissione sinaptica eccitatoria e segnali di sodio nei neuroni postsinaptici nel tessuto intatto.

Recenti miglioramenti nelle tecniche microscopiche leggeri quali microscopia multi-fotone hanno consentito lo studio dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, queste tecniche sono ora ampiamente utilizzati per analizzare i segnali elettrici di attività legate sui neuroni e segnali di calcio concomitanti in piccoli compartimenti subcellulari, vale a dire in dendriti sottili e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio in dendriti e spine, le cui proprietà sono in gran parte inesplorate. Tali segnali possono essere analizzati da due fotoni di imaging di sodio intracellulare ([Na +] i) che permette la misurazione on-line di [Na +] i transienti per periodi prolungati senza significativo sbiancamento colorante o foto-danno 1,2. Per l&#39;imaging di i [Na +] </sub&gt;, a pochi coloranti indicatore chimico sono disponibili, ad esempio Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente più comunemente usato per Na + imaging è sodio-binding isoftalato benzofuran (SBFI). Si tratta di un raziometrica, colorante UV-eccitato simile al noto colorante calcio-sensibile fura-2 ed è stato impiegato per l&#39;imaging convenzionale Na + in molti tipi di cellule (ad esempio 5,6). Ci sono diverse possibilità di emozionanti del colorante e raccogliendo sua fluorescenza. Se è richiesta alta risoluzione temporale (cioè un frame rate elevato di imaging) in combinazione con le informazioni spaziali, SBFI può essere eccitato con una lampada allo xeno ad arco o un diodo dispositivo ad alta potenza di uscita della luce (LED) e la sua emissione rilevato con una carica ad alta velocità Dispositivo -coupled (CCD), fotocamera 7,8. Per la risoluzione spaziale massima profondità nel tessuto, microscopia a scansione laser multi-fotone è il metodo di scelta 9. Il relativamente basso efficie quantisticaNCY di SBFI richiede concentrazioni relativamente alte di colorante (0,5-2 mm), e il caricamento diretto del modulo membrana impermeabile di SBFI tramite un forte microelettrodo 10 o la patch pipetta 1. Utilizzando SBFI, precedenti lavori eseguiti in fettine di tessuto acute dell&#39;ippocampo roditori hanno dimostrato attività legate transitori di sodio in dendriti e spine dei neuroni CA1 piramidali che sono causati principalmente da afflusso di sodio attraverso ionotropici NMDA recettori 1,2. Per lo studio delle proprietà di tali segnali sodio locali in maggior dettaglio, l&#39;attivazione di specifici recettori postsinaptici di applicazione di agonisti del recettore è un metodo adatto di scelta. Per simulare l&#39;attività presinaptica e rilascio del trasmettitore, l&#39;applicazione dovrebbe essere relativamente breve e focalizzato per consentire la stimolazione locale. Questo, tuttavia, risulta essere molto impegnativo nel tessuto intatto. Applicazione di pressione locale di agonisti del recettore con una pipetta a punta fine permette di ap molto focaleplicatura, ma ospita il rischio potenziale per produrre il movimento della struttura di interesse (ad esempio, come un dendrite o spine dendritiche), e quindi ostacola imaging ad alta risoluzione. L&#39;idoneità di ionoforesi di sostanze neuro-attivi dipende dalle loro proprietà elettriche e alte ampiezze di corrente può produrre artefatti cellulari pure. Un modo per aggirare questi ostacoli è l&#39;impiego di composti foto-attivati ​​e la loro fotolisi del flash. Fondamentalmente, due principi differenti vengono utilizzati per la foto-attivazione di sostanze in gabbia: I) a largo campo del flash fotolisi 11 e II) uncaging focale impiegando moduli di scansione in combinazione con il laser 12. Mentre in tutto il campo del flash fotolisi viene utilizzato per attivare più grandi regioni di interesse, ad esempio, un intera cella, uncaging focale è impiegata per stimolare in particolare i piccoli compartimenti cellulari. In questo studio dimostriamo una procedura per whole-cell patch-clamp e multi-pImaging sodio Hoton in dendriti e spine di neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging luce UV-indotta di glutammato, che permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Multi-fotone microscopia a fluorescenza ha permesso l&#39;analisi dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, è ampiamente usato per studiare i segnali di calcio di attività legate in piccoli compartimenti subcellulari come i dendriti e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio post-sinaptici, le cui proprietà sono solo marginalmente comprensibili. Qui, descriviamo un metodo per combinato whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in micro domini cellulari dei neuroni centrali. Inoltre, si introduce una procedura modificata per l&#39;ultra-violetta (UV) uncaging-luce-indotta di glutammato, che consente l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. A tal fine, le registrazioni cellule intere sono state effettuate su Cornu Ammonis suddivisione 1 (CA1) neuroni piramidali in fettine di tessuto acute dellaippocampo di topo. I neuroni sono stati riempiti con il sodio-sensibile colorante fluorescente SBFI attraverso la patch-pipetta, e multi-fotone di eccitazione del SBFI consentito la visualizzazione dei dendriti e spine adiacenti. Per stabilire uncaging focale indotta da UV, diversi parametri tra cui l&#39;intensità della luce, volume interessato dal fascio uncaging UV, posizionamento del fascio così come la concentrazione del composto in gabbia sono stati testati e ottimizzati. I nostri risultati mostrano che la perfusione locale con glutammato in gabbia (MNI-glutammato) e il suo risultato UV-uncaging focale nelle correnti interiori e transitori di sodio in dendriti e spine. Naturalmente il tempo e l&#39;ampiezza delle due correnti attivo e segnali sodio correlano con la durata dell&#39;impulso uncaging. Inoltre, i nostri risultati mostrano che i segnali di sodio intracellulari sono bloccati in presenza di bloccanti per i recettori ionotropici del glutammato, dimostrando che essi sono mediati da afflusso di sodio se questo percorso. In sintesi, il nostro metodo fornisce uno strumento affidabile per laricerca di segnali di sodio intracellulari indotti da attivazione del recettore focale nel tessuto cerebrale intatto.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato una procedura per la microscopia multi-fotone delle dinamiche di sodio cellulari con il colorante fluorescente SBFI sodio-dipendenti nei neuroni piramidali CA1 di topo acuta fettine di tessuto ippocampale. Inoltre, mostriamo come combinare questa tecnica di imaging con uncaging a base di laser-scanning di composti neuro-attiva (ad esempio glutammato in gabbia) e la sua precisione di targeting per cellulari micro-domini. Caricamento neuroni con SBFI attraverso la patch-pipetta permesso la visualizzazione di tutta la cellula compresi dendriti e spine sottili adiacenti impiegando multi-fotone di eccitazione (Figura 6A, B, D e Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 segnali di sodio e correnti sinaptiche indotte dal flash fotolisi del glutammato in gabbia. (A) MaximAl proiezione dell&#39;immagine di un neurone piramidale CA1 caricato con SBFI tramite la pipetta di patch (PP). La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel B. LP indica la posizione e l&#39;orientamento della pipetta per perfusione locale di glutammato in gabbia. (B) ad alta potenza massima proiezione di una pila di sezioni ottiche di un dendrite con spine dendritiche adiacenti. Le pile di sezioni ottiche sottoposti z-allineamento e deconvoluzione. La croce rossa indica la regione di destinazione del fascio uncaging. La linea tratteggiata arancione delimita la regione di interesse da cui è stata registrata l&#39;emissione di fluorescenza. La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel D. (C) A sinistra: il segnale di sodio (riga superiore) e somatica verso l&#39;interno di corrente (riga inferiore) indotta dal flash fotolisi del glutammato in gabbia (indicato dal lampo giallo). La linea rossa rappresenta un fit dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI Destra:. senza pre-perfusione con glutammato in gabbia, la stessa UV-flash né evocato un cambiamento di emissione SBFI, né una corrente verso l&#39;interno (D) A sinistra:. Immagine ad alta potenza del dendrite e adiacente spine come delineata in B. Accanto, la stessa immagine con valori di grigio invertite. Le linee tratteggiate indicano le regioni di interesse in cui è stato registrato l&#39;emissione di fluorescenza. La croce rossa indica la localizzazione del fascio uncaging Destra:. Transienti sodio indotta da UV-flash fotolisi del glutammato in gabbia. Blu traccia: segnali di sodio nel dendrite; traccia rossa: risposta media da tre spine adiacenti al punto uncaging; traccia verde: risposta media da tre spine lontane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la perfusione locale con Cagedglutammato, applicando un UV-flash vicino ad un dendrite portato ad una diminuzione transitoria emissione di fluorescenza di SBFI, riflettendo un aumento della concentrazione di sodio intracellulare (Figura 6C, D e Figura 7B). Allo stesso tempo, una corrente verso l&#39;interno è stato registrato al soma (Figura 6C e Figura 7B). Aumentare la durata del flash UV ha portato ad aumentare ampiezze sia della suscitato verso l&#39;interno correnti e segnali di sodio (dati non mostrati), indicando che il sistema era ben all&#39;interno della sua gamma dinamica e che le risposte non uncaging né cellulari erano saturi. Applicazione di un UV-lampo di identica durata o più per sezioni che non sono state pre-perfusi con glutammato in gabbia, non ha provocato cambiamenti nel SBFI fluorescenza né correnti interiori, indicando che questi segnali sono dovuti alla uncaging di glutammato (Figura 6C). Inoltre, questi risultati mostrano che nessuna interdipendenza dei componenti imaging- e uncaging si osserva under nostre condizioni sperimentali. Segnali di sodio potrebbe essere rilevato anche in spine dendritiche (Figura 6D). Anche se non abbiamo tentato di ottenere la stimolazione di un singolo colonna vertebrale solo con glutammato uncaging, ampiezze di picco tendevano ad essere leggermente superiore a spine vicino al punto uncaging, considerando spine più lontano hanno mostrato variazioni di fluorescenza praticamente identiche come il dendrite genitore (Figura 6D). Infine, abbiamo studiato il percorso per afflusso di sodio nei dendriti e spine in risposta a uncaging di glutammato. A tal fine, abbiamo impiegato CNQX e APV, che sono bloccanti selettivi per i sodio-permeabili, recettori ionotropici del glutammato del AMPA- e NMDA-sottotipo, rispettivamente. I nostri risultati mostrano che i segnali sodio intracellulare indotta da glutammato e le correnti somatici stimolate sono stati omessi in presenza di questi bloccanti (Figura 7B). Al momento del wash-out dei bloccanti, i segnali sono riacquistato. Questo dimostra that uncaging di glutammato attiva i recettori del glutammato ionotropici sui neuroni piramidali CA1, che mediano l&#39;afflusso di sodio nei dendriti e spine, con conseguente transienti intracellulari di sodio e correnti verso l&#39;interno. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 profilo farmacologico dei segnali di sodio evocate e delle correnti verso l&#39;interno. (A) SBFI pieno CA1 piramidale neuroni con la patch pipetta (PP) allegato al soma (B) A sinistra:. Transitorio di sodio e la corrente somatica indotta da foto-attivazione di glutammato in gabbia in un dendrite e spine collegate Center. Perfusione con l&#39; ionotropici bloccanti del recettore del glutammato CNQX e APV inibisce sia il segnale di sodio e la corrente verso l&#39;interno indotta da uncaging destra:. Su wash-out dei bloccanti, i segnali vengono ripristinati. I rappre linea rossats una misura dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300 msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo. 

Video: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Ricerca

Neuroscienze

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...