L&#39;assistenza è stata fornita da Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, e Cheyenne Gerdes durante lo sviluppo di metodi di laboratorio. Vorremmo ringraziare la Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) per l&#39;assistenza con TLC scansione densitometria. MALDI-TOF MS utilizzato per questo progetto è stato fornito attraverso il NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Iniziativa P3 Center (EPS-0701890) in Arkansas Biosciences Institute. Il finanziamento è stato fornito da una pesca degli Stati Uniti e Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, la Nazionale Società Speleologica, e The Center for North American Bat Ricerca e Conservazione presso l&#39;Indiana State University.

ATTENZIONE: Ottenere in anticipo tutte le statali e federali autorizzazioni necessarie per la movimentazione, il trasporto e la conservazione pipistrelli. Approvazioni devono essere ottenuti da vostra cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale, nonché dal comitato di biosicurezza istituzionale. Se pipistrelli vivi (o tessuto del sistema nervoso) devono essere trattati, i gestori degli animali dovrebbero essere vaccinati per la rabbia. Pipistrelli utilizzati in questo studio sono stati raccolti dal National Forest Ozark San Francesco, AR, durante l&#39;estate 2010 secondo metodi standard (di Arkansas State University Istituzionale Comitato Biosicurezza approvazione # 135349-1) 28. 1. Tissue Trattamento e lipidi estrazione <ol><li> Pulire tutti gli strumenti con metanolo prima e tra la raccolta di tessuto da diversi individui. Tagliare i capelli (circa 1,0 g) a partire da pelle con un paio di forbici e posto in un pallone da 125 ml Erlenmeyer. Sebo campione dalla superficie alare con il lavaggio pelle con 4-6 palle di cotone inumidito di cloroformio: Metanolo solvente (C: M; 03:02 v / v), e disporre questi in un pallone separato. </li><li> Estrarre tessuto con 10 ml di C: M (2:1 v / v) contenente 0,5% butilidrossitoluene (BHT) per evitare l&#39;ossidazione 29. Utilizzare solo solventi di qualità HPLC. </li><li> Dopo 2 ore, aggiungere circa 0,5 g di solfato anidro ad ogni pallone, mescolare brevemente, e raccogliere il solvente filtrando attraverso carta da filtro. </li><li> Ripetere i punti 1.2 e 1.3 due volte. Una volta con il 1:1 C: M e sequenziale con 1:02 C: M. Pool filtrati insieme. </li><li> Evaporare i filtrati riuniti sotto un flusso di N 2, determinare il peso secco, e disciogliere il residuo lipidico 3:2 C: M (con 0,5% BHT) ad una concentrazione di 10 mg / ml. Conservare campione in fiale di vetro a -20 ° C. In genere è meglio analizzare i campioni entro un mese dopo la raccolta del campione e per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo. </li></ol> 2. Lipid separazione da preparativa cromatografia su strato sottile <ol><li> Preparare in anticipo lavato con solvente da 1,5 ml microcetubi ntrifuge di riempimento con 3:02 C: M, risciacquo con acetone e asciugatura all&#39;aria. Questo viene fatto per rimuovere i plastificanti che possono interferire con la successiva analisi di spettrometria di massa. Conservare provette in un contenitore privo di polvere e maneggiare i tubi solo con i guanti per evitare la contaminazione da oli per la pelle. </li><li> Attivare la piastra TLC per primo pre-sviluppo con 3:02 C: M. Aggiungere abbastanza solvente alla camera TLC ad una profondità di 1 cm, quindi posizionare placca nella camera (chiudere con coperchio in vetro) e lasciare che il solvente eseguire completamente alla parte superiore della piastra. Questa operazione richiede circa 45 min. </li><li> Rimuovere la piastra e asciugare in una cappa aspirante fino a solvente evapora (circa 15 min), poi posto in un forno per almeno 10 minuti a 120 ° C. Inserire un segno di matita nella parte superiore della piastra di mantenere l&#39;orientamento quando vengono applicati campioni. Posizionare una linea di matita retta, a 1,5 cm dal bordo inferiore della piastra, per segnare la linea di base dove saranno collocati il ​​campione e gli standard. </li><li> Preparare camera di TLC tagliando unpezzo di carta da filtro grande abbastanza per allineare le due pareti corte e una parete lunga. Posizionare il filtro di carta fodera nella camera. Sarà completamente bagnata quando il solvente viene aggiunto alla camera. </li><li> Preparare 100 ml di fase mobile solvente, che è esano: etere dietilico: acido acetico (H: E: A; 80:20:2 v / v / v). Versare solvente nella camera di dare una profondità di circa 1 cm. Coprire con il coperchio in vetro, con una guarnizione grasso al silicone lungo il bordo superiore della camera. Lasciare la camera per equilibrare la notte prima dell&#39;uso. </li><li> Applicare il campione manualmente alla piastra preparata con un tubo capillare o pipetta come una striscia continua di circa 1,5 cm da un bordo a 1,5 cm dal bordo altri. Un applicatore automatico di campioni è preferito poiché caricherà il campione in una vena più omogeneo. Utilizzare le corsie esterne della piastra TLC di individuare circa 20 microlitri miscela di steroli, FFAs, TAG, e gli standard esteri di steroli (uso 10 mg / ml; miscele predefiniti possono essere ottenuti). </li><li> Posizionare la piastra TLC caricato inla camera equilibrata, chiudere con il coperchio, e sviluppare la piastra finché il solvente corre al bordo superiore. Questo richiede circa 45 min con la fase mobile qui descritto. Rimuovere la placca dalla camera e lasciare che il solvente in eccesso di evaporare dalla piastra in una cappa aspirante per circa 1 min. </li><li> Spruzzare con 0,05% rodamina 6G in etanolo al 95%. Visualizzare bande lipidi sotto una lampada a raggi ultravioletti di lunghezza d&#39;onda lunga. Segna con una matita la posizione f R per le bande fluorescenti risolti nel campione e standard. Una documentazione fotografica può essere preso a questo punto. </li><li> Identificare la banda corrispondente con lo standard TAG e rimuoverlo dalla piastra raschiando la silice con una spatola su un grande foglio di carta glassine pesare. Trasferimento di silice per una 1,5 ml di solvente lavato provetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di 3:2 C: M solvente provetta, ultrasuoni per 1 min, la silice pellet per centrifugazione, e poi trasferire il solvente in un nuovo tubo pre-pesati. Ripetere the passo precedente, in comune i filtrati, ed evaporare il solvente sotto un flusso di N 2. </li><li> Conservare il residuo essiccato contenente TAG sotto N 2 al buio a 4 ° C mentre campioni di tessuto aggiuntivi sono separati mediante TLC. Rodamina 6G è presente nei campioni, ma è insolubile in esano e viene rimosso durante dissoluzione del campione immediatamente prima analisi MS. </li></ol> 3. Analisi TAG mediante MALDI-TOF MS <ol><li> Preparare una soluzione fresca matrice α-ciano-4-idrossi-acido cinnamico (CHCA) sciogliendo 10 mg CHCA in 1 ml di solvente (49,5% etanolo, acetonitrile 49,5%, e 1% acquoso 0,1% TFA). </li><li> Preparare adrenocarticotropic ormone (ACTH; 18-39 clip, 2465,1989 Da) per risoluzione dello strumento e test di sensibilità mescolando 1 ml di ACTH (1 mg / ml) con 39,5 ml di acido trifluoroacetico 0,1% (TFA) per ottenere un 10 pmol / ml soluzione madre. Questo può essere conservato a -20 ° C per un uso futuro. </li><li> Preparare una nuova ACTH solut lavoroione (1 pmol / ml), prendendo 1 ml di / ml soluzione stock 10 pmol, la miscelazione con 9 ml 0,1% TFA, e quindi la miscelazione (1:1) con 10 ml di soluzione di matrice CHCA per ottenere un 500 fmol / concentrazione microlitri. </li><li> Preparare gli standard TAG a 10 mg / ml a 03:02 C: M per la calibrazione dello strumento MALDI (ad es tricaprin [470,361 Da], tricaprilina [554,455 Da], trilaurin [638,549 Da], tripalmitina [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristin [806,736 Da], trioleina [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], e trierucin [1.052,971 Da]). </li><li> Preparare trioleina a 10 mg / ml a 03:02 C: M per una taratura standard di lock-massa esterna TAG. </li><li> Sciogliere i campioni TAG memorizzati in esano ad una soluzione 10 mg / ml. </li><li> Preparare un 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) soluzione madre di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) con il 90% di metanolo per uso come campione e matrice standard. Anche preparare una soluzione 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) di NaOH. Coprire la provetta con la soluzione DHB con foi di alluminio<html> l al riparo dalla luce. </li><li> Mix (in tubi pre-lavati) 10,0 ml matrice DHB, 10,0 microlitri del campione o standard e 5,0 microlitri 1,0 M NaOH. Mescolare e centrifugare brevemente il tubo per portare miscela al fondo. </li><li> Spot 1.0 ml di norma, campione o ACTH su una piastra porta in acciaio inox MALDI e posto in un essiccatore fino a secco. Posizionare la piastra di destinazione nello strumento per l&#39;acquisizione dati. </li><li> Eseguire MALDI-TOF MS analizza in modo reflectron positivo. Tune e calibrare lo strumento, come descritto dal produttore dello strumento utilizzando la soluzioni standard TAG ACTH e. </li><li> Acquisire spettri per ogni campione avvistato sulla piastra bersaglio (in linea con le specifiche dello strumento; parametri per questo lavoro sono stati 5 gittata Hz laser, ~ 100 scatti al posto di ottenere uno spettro medio). Dopo la rasatura e sottraendo lo sfondo da spettri MALDI, picchi di ioni processo manualmente con il motore di ricerca online LIPID MAPPE (/ Tools / ms / glycerolipids_batch &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). </li><li> Copia e incolla spettri lista nella lista di ioni precursori e box intensità. Limitare la ricerca alla composizione acile desideri. Identificare i tag di massa / carica (m / z) rapporti da ioni presenti nello spettro per ogni campione. Se l&#39;estere metilico di acidi grassi (FAME) le percentuali sono disponibili dall&#39;analisi GC / MS separato, aggiungere questi dati per ottenere le probabilità di TAG presenti. </li></ol> STRUMENTO: Lo spettrometro di massa utilizzato in questo studio è un MALDI Micro MX Waters (dotato di un nm 20 Hz N 2 laser 337). Strumento MALDI di qualsiasi produttore con possibilità di modalità reflectron positivo può essere utilizzato. Impostazioni generali utilizzati sono tensione ad impulsi, 2.000 V; reflectron, 5.200 V; fonte, 15.000 V, con l&#39;acquisizione dei dati utilizzando il software MassLynx (ver. 4.0). Queste condizioni operative offrono una risoluzione di massa superiore a 12.000.

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo articolo presenta un metodo semplice e robusto per separare ampie classi di lipidi isolati da mammiferi tegumento mediante TLC preparativa e determinazione profili TAG mediante MALDI-TOF MS, senza dispendio di tempo derivatizzazione delle molecole lipidiche. Le fasi critiche produrre spettri qualità di TAG con MALDI-TOF MS seguenti: 1) estrazione di successo del composto con contaminazione minima o ossidazione; 2) separazione sufficiente e l&#39;isolamento mediante cromatografia e 3) ad alta risoluzione e precisione di massa MALDI-TOF MS. Questo documento viene illustrato il metodo per l&#39;estrazione e la separazione della frazione lipidica neutro dal plagiopatagium del pipistrello rosso orientale per ottenere profili MS TAG. Mentre il presente studio ha utilizzato una specie di pipistrelli (Mammalia: Chiroptera) questi metodi possono essere estesi a studiare i lipidi tegumentario di qualsiasi specie di mammifero. Bat tegumento si caratterizza per essere prevalentemente colesterolo, con minori quantità di TAG, FFAs, squaLene, e steroli / esteri di cera. Rapporti di sebo lipidi nel pipistrelli differiscono dagli esseri umani in che lo squalene è presente in basse quantità (al contrario di fino al 16% nell&#39;uomo), mentre il colesterolo si verifica in rapporti più grandi (1-7% negli esseri umani, ma 26-62% nei pipistrelli) 22 , 31. Capelli umani contengono circa il 3% TAG, mentre i rapporti fino al 28% si trovano in capelli pipistrello rosso orientale. L&#39;estrazione di campioni di lipidi dai pipistrelli è simile per le altre specie. Mentre in questo studio batuffoli di cotone imbevuto di solvente sono usati per rimuovere sebo, si può anche invertire un tubo fiala o campione contenente il solvente sulla superficie del tegumento più volte. Prodotti a nastro specializzati forniscono anche mezzi alternativi per estrarre lipidi di superficie 32. Una parte fondamentale di una corretta estrazione dei lipidi è quello di minimizzare la contaminazione da oli per la pelle. Questo è facilmente realizzabile mantenendo una bottiglia a spruzzo con metanolo e spruzzare tutti i bicchieri e utensili, pulire gli utensili con un fazzoletto tra tutti i campioni e indossando i guanti. Ossidazione of acili polinsaturi è impedito attraverso l&#39;aggiunta di BHT, e dovrebbe essere utilizzato indipendentemente dalla temperatura campioni vengono conservati a. Analisi di biomolecole di solito richiede un passo cromatografica alle molecole separate di interesse da contaminanti. TLC è usato in questo metodo, che evita requisiti strumentazione per gascromatografia, la cromatografia liquida e richiede meno esperienza tecnica per ottenere risultati affidabili e ripetibili. A seconda della classe di lipidi di interesse, molte diverse fasi mobili possono essere incorporati. Inoltre, l&#39;utilizzo di piastre HPTLC e scansione densitometria può essere utilizzato per ottenere risultati quantitativi. Mentre le variazioni dei metodi di TLC sono troppo numerosi da elencare qui, alcune fasi mobili comuni utilizzati in lipidi TLC includono cloroformio: metanolo: acqua per la separazione dei fosfolipidi e glicolipidi o isooctane: etere etilico per la separazione dei lipidi non-polari 28. In termini di separare TAG da altre classi di lipidi, la H: E: A in modosistema lvent lavora costantemente e fornisce risultati comparabili. Un altro vantaggio nell&#39;usare TLC è che le bande di interesse possono essere rapidamente profilati mediante MALDI-TOF MS senza previa derivatizzazione degli analiti. In questo studio, la silice viene tolto dalla piastra TLC, e l&#39;analita viene eluito da esso mediante sonicazione in un solvente e successiva centrifugazione per separare l&#39;adsorbente ed evaporazione del solvente di eluizione. In alternativa, matrice può essere applicato direttamente su bande analita separati su lastre TLC e poi direttamente analizzati mediante MALDI-TOF MS 33. Profili di successo, MALDI-TOF MS non si basa su sufficienti preparazione del campione e la competenza dell&#39;operatore con la sintonizzazione e la calibrazione dello strumento. Lo strumento deve essere calibrato ogni giorno con le norme riguardanti molecolare gamma di peso appropriato per le molecole di interesse. La sensibilità e risoluzione adatto (ad es ≥ 10.000) dell&#39;apparecchiatura dovrebbero essere confirmeD al giorno con ACTH. I costituenti lipidici sebacee presenti sulla superficie del tegumento dei mammiferi possono svolgere un ruolo nella colonizzazione da patogeni batterici / fungini. Pertanto, la conoscenza della composizione chimica tra le specie e gli individui possono fornire indizi sui processi di malattie umane e della fauna selvatica. Differenze intraspecifici tra gli individui malati e sani possono rappresentare segni clinici che aiutano nella individuazione della malattia e la diagnosi. Inoltre, se composti specifici che inibiscono la crescita microbica sono presenti, essi possono essere identificati per l&#39;uso nel trattamento e prevenzione di malattie.

Tessuti tegumentario mammiferi comprendono l&#39;epidermide, strutture cheratinose (ad esempio capelli e unghie), e delle ghiandole esocrine. Ghiandole esocrine sebacea tipo sono associati con follicoli piliferi, che sono indicate collettivamente come unità pilo-sebaceo 1. Ghiandole sebacee rilasciare un essudato oleoso sulla superficie della pelle denominata sebo. Il sebo è composto in gran parte da glycerolipids (ad esempio trigliceridi [tag]), acili grassi liberi (FFA), esteri di steroli / cera, e squalene. Composizione chimica del sebo è 2 specie-specifico. Oltre ad essere parte del sistema immune innato e modalità funzione antimicrobica 3, lipidi sebacee influenzano importanti processi fisiologici tra cui la perdita per evaporazione dell&#39;acqua attraverso la pelle 4, integrità cellulare e regolazione genica 5, 6 e l&#39;assorbimento del farmaco. Composizioni lipidiche sebacee possono anche servire come marcatori di malattia. Rapporti e quantità di sebacea b Alteredclassi di lipidi stradali sono segni clinici di malattie come l&#39;acne vulgaris 7, 8 forfora, dermatite seborroica 8, asteatosis 9, tra gli altri 10. Tessuti epidermici e asciugacapelli includono profili variabili contenenti steroli e derivati, TAG, FFAs, ceramidi, fosfolipidi e altri componenti lipidici minori. Poiché lipidi tegumentario possono funzionare in processi patologici, determinando differenze di composizione chimica dei TAG tra individui sani e malati può essere utile per la diagnosi clinica di malattia. I lipidi sono generalmente definiti come composti organici insolubili in acqua con sostituenti sia polare o non polare polari 11. Strutture lipidiche possono essere lunghe catene di idrocarburi, alcani ossigenati (compresi esteri cerosi, FFAs, alcoli, chetoni e aldeidi) o strutture ad anello complesse come il colesterolo 12. Ci sono otto classi principali di lipidi in base alla struttura (FFA, glycerolipids [GL], glicerofosfolipidi [GP], sfingolipidi [SP], lipidi steroli [ST], lipidi prenol [PR], saccharolipids [Sl], e polichetidi [PK]), che presentano una vasta gamma di proprietà chimiche a seconda delle classe 13. A causa della grande variazione delle proprietà chimiche delle classi lipidiche, profilazione diretta senza previa derivatizzazione di molecole lipidiche si desidera. Un metodo emergente nella ricerca lipidi è cromatografia su strato sottile (TLC) in combinazione con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione spettrometria tempo di volo di massa (MALDI-TOF MS) 14. MALDI-TOF MS è ampiamente utilizzato nella ricerca proteomica per identificare le proteine ​​e associarli a specifiche sequenze di aminoacidi a causa del molto accurate di massa &quot;impronte digitali&quot; peptide ioni generati dalle proteine ​​tripsina-digerito 15. MALDI-TOF MS può anche essere usato per profilare altre classi di biomolecole, comprese lipidi come TAG 16-18. MALDI è necessario l&#39;utilizzo di una matrice, tipcamente un composto organico che contiene le strutture doppio legame aromatiche e coniugati. Le molecole della matrice servono per trasferire delicatamente l&#39;energia del laser per gli analiti, promuovere il trasferimento di protoni, e produrre singolarmente praticati ioni in fase gassosa 19-21. Gli ioni sono sottoposti ad un campo di alta tensione sotto alto vuoto ed accelerati in un analizzatore di massa TOF dove gli ioni vengono successivamente separati da differenze di velocità che sono proporzionali alle loro rapporti tra massa e carica. Anche molto grandi biomolecole possono essere ionizzati con poca frammentazione, specie da produzione di ioni molecolari singolarmente praticati per l&#39;analisi dello spettro semplificata. La capacità di analizzare molecole lipidiche direttamente senza previa derivatizzazione ha promosso adozione immediata di MALDI-TOF MS nella ricerca lipidomico 18. Questo articolo presenta un metodo di routine per isolare e analizzare lipidi tegumentario dai capelli, le secrezioni sebacee e plagiopatagium del pipistrello rosso orientale (Lasiurus Borealis). Questo viene utilizzato per determinare le variazioni interspecifici a pipistrello lipidi tegumentario per chiarire il processo della malattia della Sindrome White-Nose (WNS) 22. WNS è una malattia fungina di pipistrelli ed è causata dalla specie psicrofile descritti di recente Geomyces destructans 23-25. WNS ha causato la morte di oltre 5 milioni di pipistrelli della caverna del Nord America e minaccia l&#39;estinzione di specie di pipistrelli vulnerabili, con potenziali impatti economici di miliardi di dollari di danni al settore agricolo 26,27. Per studiare i passaggi in G. destructans infezione, lipidi sono stati estratti dai capelli e ala tessuti di pipistrelli rossi orientali e separati in classi di lipidi di massima mediante TLC per isolare la frazione TAG per la successiva analisi mediante MALDI-TOF MS. TAG contengono catene di acidi brevi e sono facilmente rilevati da MALDI-TOF MS con poca interferenza matrice.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>101162</td>
			<td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Flexible Plates</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>4410-222</td>
			<td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTH</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td>
			<td>A8346-5X1VL</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triolein</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td>
			<td>44895-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Lipid Standard</td>
			<td></td>
			<td>TLC 18-1</td>
			<td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TAG Standard</td>
			<td>Nu-Check Prep., Inc.</td>
			<td>NIH Code 53B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TAG Standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td>
			<td>17810-1AMP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials with Teflon Cap</td>
			<td>U.S. National Scientific Co.</td>
			<td>B7800-2</td>
			<td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHB</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td>
			<td>50862-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td>
			<td>C8982-10X10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sebutape</td>
			<td>CuDerm</td>
			<td>S100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the triacylglyceride contents in bat integumentary lipids by preparative thin layer chromatography and maldi-tof mass spectrometry

Il tegumento mammiferi comprende ghiandole sebacee che secernono un materiale oleoso sulla superficie della pelle. Produzione di sebo è parte del sistema immune innato che è protettiva contro i microbi patogeni. Produzione di sebo anomala e la composizione chimica sono anche un sintomo clinico di malattie della pelle specifici. Il sebo contiene una miscela complessa di lipidi, tra cui trigliceridi, che è specie-specifico. Le proprietà chimiche di massima esposti da diversi classi di lipidi ostacolano la specifica determinazione della composizione del sebo. Tecniche di analisi per i lipidi in genere richiedono derivatizations chimici che sono i costi di preparazione dei campioni aumento alta intensità di lavoro e. Questo documento descrive come estrarre lipidi dal tegumento mammiferi, classi di lipidi ampi separati mediante cromatografia su strato sottile, e il profilo dei contenuti triacylglyceride utilizzando la spettrometria di massa matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione di tempo di volo. Questo metodo robusto consente una determinazione direttadei profili triacylglyceride tra specie e individui, e può essere facilmente applicato a qualsiasi gruppo tassonomico di mammiferi.

Il metodo di estrazione per isolare lipidi totali dal tessuto descritto da Folch 30 è una procedura semplice, atta qui. Dopo estrazione tessuto ed evaporazione del solvente, i lipidi appaiono spesso come una pellicola giallastra. Il colore giallo più probabile è da contaminanti proteici, che possono essere rimossi eseguendo una estrazione liquido-liquido. Questa elaborazione campione aggiuntivo non è necessario in questa procedura perché TLC preparativa separa la frazione TAG da tali contaminanti. L&#39;aggiunta di fresco solfato di sodio anidro in tutte le fasi di filtraggio aiuta a ridurre la contaminazione dell&#39;acqua che colpisce determinazioni di peso lipidico accurate. Mammiferi lipidi tegumentario analisi mediante TLC preparativa con H: E: A come fase mobile solito risolvere quattro bande distinte corrispondenti a (a partire dall&#39;origine) steroli, FFAs, tag e esteri di steroli / esteri di cera / squalene (Figura 1). A volte quando si utilizza analiticoad alte prestazioni cal (HP) TLC con la H: E: Una fase mobile, gli esteri di steroli, esteri cerosi, e squalene separerà e appaiono come tre bande separate. Nelle condizioni utilizzate nel presente studio, gli esteri di sterolo / cerose non sono separati. Se queste bande sono di interesse, la fase mobile può essere commutato isoottano: etere etilico (95:5 v / v), e la piastra HPTLC può essere analizzata mediante la scansione densitometria. Altri fattori che possono causare la separazione poveri. Questi sono solitamente eliminati posizionando la carta da filtro nella camera, applicando grasso per una perfetta tenuta sul coperchio, equilibrante la camera durante la notte, e mantenendo TLC camere pulite, avere separazioni e dati TLC qualità costante. Rappresentante spettri di massa MALDI-TOF ottenuto per TAG isolati dal pipistrello rosso orientale sono mostrati nelle Figure 2 e 3. Questi spettri contengono picchi di ioni TAG nel range di massa tra m / z 850-910, che è tipico per TAG isolati da mammiferi non acquaticos. L&#39;aggiunta di 1,0 M NaOH promuove singolarmente comportano ioni Na + che sono più stabili di ioni H +. Oltre alla stabilità, l&#39;assenza di ioni H + + e K aumenta la facilità di analisi spettrale. La m / z 850-910 ioni picchi corrispondono alle 16:00, 18:00, 18:01, 18:02 e porzioni FA essendo i componenti acile dominanti nei tag (Tabella 1). Eventuali frazioni FA di TAG possono essere inizialmente determinati da totale ioni m / z presenti in MALDI-TOF MS spettri, e le differenze tra le specie e degli individui dedotte. Tuttavia, se sono necessari i rapporti specifici di contenuto acile, quindi devono essere utilizzati MS / MS o la gas cromatografia (GC / MS). Ulteriori informazioni sui rapporti acil può dedurre osservando i picchi nella regione diacylglycerides dello spettro (Figura 4). Diacylglycerides sono prodotte dalla frammentazione TAG nell&#39;origine MALDI e possono essere trovati in m / z 590-650 regione. TAG frammentazione può essere aumentataomettendo l&#39;aggiunta di 1,0 M NaOH 16. Bat rosso ala tessuto orientale è caratterizzata da un picco dominante al m / z 879,7 e tessuto capelli con un picco dominante a m / z 881,8 (Figure 2 e 3, rispettivamente). Picchi a m / z 907,8, 879,7 e 855,7 (POP, OPP) sono circa anche in intensità (~ 50%) nel tessuto capelli con il picco a 853,7 essere ~ 40%. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composizione </td><td fo:width="1in"> Elemental Composizione </td><td fo:width="1in"> Mass osservata </td></tr><tr><td> TAG Na + </td><td></td><td> TAG Na + </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911,8 </td></tr><tr><td> OOS, LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909,8 </td></tr><tr><td> OOO, GFI LNSS, LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907,8 </td></tr><tr><td> LOO, LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905,8 </td></tr><tr><td> LLO, OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903,7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901,7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899,7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897,7 </td></tr><tr><td> LnLnLn </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895,7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883,8 </td></tr><tr><td> LSP, OOP, Sopo </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881,8 </td></tr><tr><td> LOP, LnSP, LSPo </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ Td&gt; <td> 879,7 </td></tr><tr><td> LLP, LNOP, Lopo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877,7 </td></tr><tr><td> LnLP, LLPo, LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875,7 </td></tr><tr><td> LnLnP, LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873,7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871,7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857,8 </td></tr><tr><td> POP, OPP </td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855,7 </td></tr><tr><td> OOM, PPL, PoPoS, Popo </td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853,7 </td></tr><tr><td> PPLN, ppol, Popoo, MYOO </td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851,7 </td></tr><tr><td> LLM, LnOM </td><td> C 53 H 94 </sub&gt; O 6 </td><td> 849,7 </td></tr><tr><td> PPP, SSLA </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829,7 </td></tr><tr><td> PPPO, Osla </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827,7 </td></tr><tr><td> PPoPo, PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825,7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817,6 </td></tr><tr><td> MMS, Slap, PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801,7 </td></tr><tr><td> SLaPo, PPOM, PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799,7 </td></tr><tr><td> PoPoM, OOCa </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797,7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773,7 </td></tr><tr><td> MMPo, OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771,7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769,6 </td></tr><tr><td> MMM, PPCA, PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745,6 </td></tr><tr><td> PoPCa, PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743,6 </td></tr><tr><td> Popoca </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741,6 </td></tr><tr><td> LaLaP, Mmla, MCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717,6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715,6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643,5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641.5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639,5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619,5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617,5 </td></tr><tr><td> LP </td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615,5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Composizione di acidi grassi, composizione elementare, e la massa isotopica di addotti sodiated di trigliceridi e diacylglycerides. Ln = acido linolenico (18:03), L = acido linoleico (18:02), O = acido oleico (18:01), S = acido stearico (18:00), P = acido palmitico (16:00), Po = acido palmitoleico (16:01), M = acido miristico (14:00), My = acido miristoleico (14:01) La = laurico acido (12:00), Ca = acido caprico (10:00). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> Figura 1. Sottile strato cromatogramma ampio separazione classe di lipidi da esano: etere etilico: acido acetico(80:20:2 v / v / v) come fase mobile. Banda tra steroli e FFA non è stata identificata da uno standard, ma può essere un alcol grasso o cera diestere. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> Figura 2. Regione TAG estesa MALDI-TOF spettro di massa di TAG sodiated. (M / z 700-950) da pipistrello rosso orientale (L. borealis) tessuto ala Peaks individuate a m / z 853,7 (OOM, PPL, PoPoS, Popo) e m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> Figura 3. Regione TAG estesa MALDI-TOF spettro di massa dei TAG sodiated (m / z 700-950) da pipistrello rosso orientale (L. borealis) tessuto dei capelli.Peaks individuati a m / z 905,8 (LOO, LLS) e m / z 907,8 (OOO, GFI LNSS, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> Figura 4. DAG regione MALDI-TOF spettro di massa di frammenti DAG sodiated (m / z 530-730). Tessuto dalla bat rosso orientale (L. borealis) ala Peaks individuate a m / z 643,5 (OO) e m / z 615,5 (LP) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Tegumento mammiferi contiene lipidi solventi estraibili che possono fornire le composizioni chimiche caratteristiche delle singole specie. Questo articolo presenta un metodo di routine per separare ampie classi lipidiche isolate da tessuti tegumentario mediante cromatografia su strato sottile e determinare il profilo triacylglyceride laser desorbimento / ionizzazione spettrometria di massa matrix-assisted tempo di volo.

Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

21.1K Views.  Arkansas State University.  Tegumento mammiferi contiene lipidi solventi estraibili che possono fornire le composizioni chimiche caratteristiche delle singole specie. Questo articolo presenta un metodo di routine per separare ampie classi lipidiche isolate da tessuti tegumentario mediante cromatografia su strato sottile e determinare il profilo triacylglyceride laser desorbimento / ionizzazione spettrometria di massa matrix-assisted tempo di volo. 

Video: Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Caratterizzazione di polimeri sintetici tramite matrice assistita Laser desorbimento ionizzazione tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) di volo

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

The Effect of Anodization Parameters on the Aluminum Oxide Dielectric Layer of Thin-Film Transistors

Aluminum-oxide (Al2O3) is a low cost, easily processable and high dielectric constant insulating material that is particularly appropriate for use as the dielectric layer of thin-film transistors (TFTs). Growth of aluminum-oxide layers from anodization of metallic aluminum films is greatly advantageous when compared to sophisticated processes such as atomic layer deposition (ALD) or deposition methods that demand relatively high temperatures (above 300 &#176;C) such as aqueous combustion or spray-pyrolysis. However, the electrical properties of the transistors are highly dependent on the presence of defects and localized states at the semiconductor/dielectric interface, which are strongly affected by the manufacturing parameters of the anodized dielectric layer. To determine how several fabrication parameters influence the device performance without performing all possible combination of factors, we used a reduced factorial analysis based on a Plackett-Burman design of experiments (DOE). The choice of this DOE permits the use of only 12 experimental runs of combinations of factors (instead of all 256 possibilities) to obtain the optimized device performance. The ranking of the factors by the effect on device responses such as the TFT mobility is possible by applying analysis of variance (ANOVA) to the obtained results.

Anodization parameters for growth of the aluminum-oxide dielectric layer of zinc-oxide thin-film transistors (TFTs) are varied to determine the effects on the electrical parameter responses. Analysis of variance (ANOVA) is applied to a Plackett-Burman design of experiments (DOE) to determine the manufacturing conditions that result in optimized device performance.

L'effetto dei parametri di anodizzazione sullo strato didielettrico dell'ossido di alluminio dei transistor a film sottile

Aluminum-oxide (Al2O3) is a low cost, easily processable and high dielectric constant insulating material that is particularly appropriate for use as the ...

Fabrication of Thin Film Silver/Silver Chloride Electrodes with Finely Controlled Single Layer Silver Chloride

This paper aims to present a protocol to form smooth and well-controlled films of silver/silver chloride (Ag/AgCl) with designated coverage on top of thin film silver electrodes. Thin film silver electrodes sized 80 &#181;m x 80 &#181;m and 160 &#181;m x 160 &#181;m were sputtered on quartz wafers with a chromium/gold (Cr/Au) layer for adhesion. After passivation, polishing and cathodic cleaning processes, the electrodes underwent galvanostatic oxidation with consideration of Faraday&#39;s Law of Electrolysis to form smooth layers of AgCl with a designated degree of coverage on top of the silver electrode. This protocol is validated by inspection of scanning electron microscope (SEM) images of the surface of the fabricated Ag/AgCl thin film electrodes, which highlights the functionality and performance of the protocol. Sub-optimally fabricated electrodes are fabricated as well for comparison. This protocol can be widely used to fabricate Ag/AgCl electrodes with specific impedance requirements (e.g., probing electrodes for impedance sensing applications like impedance flow cytometry and interdigitated electrode arrays).

This paper aims to present a method to form smooth and well-controlled films of silver chloride (AgCl) with designated coverage on top of thin film silver electrodes.

Fabbricazione di elettrodi a pellicola d'argento/argento con cloruro d'argento a livello singolo finemente controllato

This paper aims to present a protocol to form smooth and well-controlled films of silver/silver chloride (Ag/AgCl) with designated coverage on top of thin ...