Il protocollo presentato consente di quantificare un'ampia gamma di lipidi nei tessuti animali. È uno strumento facile per studiare i meccanismi lipidici e anche per identificare biomarcatori che indicano la tossicità precoce nei modelli animali. Il metodo fornisce un profilo quantitativo di oltre 400 lipidi molecolari in 14 diverse classi lipidiche in un'ampia varietà di matrici campione con un tempo di tendenza di 10 minuti per campione.
Per iniziare, diluire la centrifuga aliquote 1 surnatante due volte la concentrazione con tampone bicarbonato di ammonio. Dopo aver preparato la curva standard dell'albumina sierica bovina, vortice le provette standard e centrifugare le provette a 18, 200 g per 15 secondi a temperatura ambiente. Dai tubi standard preparati in precedenza, trasferire 6 microlitri ciascuno dei pezzi bianchi, standard e campioni su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
Quindi, aggiungere 250 microlitri di reagente Bradford a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e mescolare. Dopo l'incubazione per 5 minuti, misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 595 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Preparare tubi da 2 millilitri con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio in ciascun tubo del bianco totale e del bianco standard interno e conservare tutti i campioni sul ghiaccio.
Preparare i campioni di controllo qualità, considerando che un campione di controllo qualità viene posizionato tra ogni set di 10 campioni. Aggiungere 10 microlitri di plasma umano in pool a tubi da 2 millilitri, quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione standard interna in tutti i campioni di bianco standard interni, controllo qualità e studio. Aggiungere 300 microlitri di miscela di metanolo butanolo a meno 20 gradi Celsius a ciascun campione e agitare a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente su termomixer.
Quindi, aggiungere 300 microlitri di miscela di acetato di etile eptano e agitare a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente sul termomixer, quindi aggiungere 300 microlitri di miscela di acido ascetico all'1% e agitare per 5 minuti a 450 g a temperatura ambiente sul termomixer. Centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire 360 microlitri della fase superiore in un nuovo tubo autobloccante da 2 millilitri etichettato come 2. Dopo aver aggiunto 320 microlitri di eptano acetato di etile al tubo in fase acquosa etichettato come 1, agitare a 450 g per 5 minuti a temperatura ambiente sul termomiscelatore, quindi centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente come dimostrato in precedenza.
Trasferire 320 microlitri della fase superiore e combinarli con la frazione del passaggio precedente nel tubo 2. Allo stesso modo, aggiungere 250 microlitri di eptano etilacetato alla fase acquosa nel tubo 1 e agitare a 450 g per 5 minuti a temperatura ambiente sul termomixer. Di nuovo, centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire 200 microlitri della fase superiore e combinarla con le frazioni dei passaggi precedenti nel tubo 2.
Evaporare fino all'essiccazione a 35 gradi Celsius in un concentratore sottovuoto e risciogliere in 300 microlitri di soluzione di miscela MS. Vortice ogni tubo per 5 secondi per assicurarsi che tutto sia sciolto e centrifugare a 18.200 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire un'aliquota di 50 microlitri nella piastra da microlitri per l'analisi della modalità di ionizzazione positiva e diluire con 50 microlitri di soluzione di miscela MS.
Anche in questo caso, diluire con 80 microlitri di miscela MS e trasferire un'aliquota di 20 microlitri nella piastra MTP per l'analisi della modalità di ionizzazione negativa. Avvolgere la piastra con un foglio e conservare a 4 gradi Celsius prima dell'analisi. Calibrare un MS sia in modalità positiva che negativa in conformità con le istruzioni del produttore 5 giorni o meno prima dell'analisi.
Installare la nano-sorgente di infusione diretta in anticipo, assicurandosi che sia correttamente allineata contro il capillare di trasferimento del MS e un chip ugello da 4,1 micrometri nel supporto del chip, quindi controllare i parametri per l'infusione positiva e negativa corrispondenti a una pressione del gas di 1,25 psi, tensione della sorgente di 1,1 kilovolt, 5 microlitri di volume di iniezione del campione, chiusura del contatto di uscita Rel1 per 2,5 secondi, 5 minuti di tempo di consegna, raffreddamento della piastra a 4 gradi Celsius, quindi impostare il regolatore di temperatura e creare una nuova piastra. Per la modalità positiva, controllare e sintonizzare il software che il metodo MS sia impostato con una temperatura capillare di 250 gradi Celsius e il livello RF dell'obiettivo S a 65,0. Nel software Xcalibur, aprire il metodo positivo e verificare che l'acquisizione MS a scansione completa sia impostata da zero a 1 minuto nell'intervallo da 550 a 1.000 m/z con risoluzione di 140.000 con controllo automatico del guadagno di 1 milione e tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi.
Applicare la massa di blocco di 680,48022. Verificare che il metodo di acquisizione MS/MS indipendente dai dati sia impostato tra l'intervallo di tempo di 1 e 5 minuti con una risoluzione di 17.500 con una prima massa fissa di 250 m/z. Verificare che il controllo automatico del guadagno per MS2 sia impostato a 100.000 e che venga utilizzato un tempo massimo di iniezione a 64 millisecondi, un'energia di collisione di 20 NCE, la finestra di isolamento a 1 m/z e che venga utilizzato un elenco di massa di inclusione da 398 a 1.100 m/z con un passo di massa di 1 Dalton.
Per l'acquisizione in modalità negativa, verificare che il metodo MS sia impostato con la temperatura capillare a 250 gradi Celsius nel livello RF dell'obiettivo S a 65,0 nel file MS tune. Successivamente, nel software Xcalibur, verificare che la modalità di acquisizione a scansione completa sia impostata da zero a 1 minuto con una risoluzione di 140.000 che copre l'intervallo da 400 a 940 m / z, controllo automatico del guadagno di 1 milione, tempo massimo di iniezione di 200 millisecondi e una massa di blocco di 526,46262. Verificare che l'acquisizione MS2 in modalità DIA sia impostata tra 1 e 5 minuti di corsa con una risoluzione di 17.500 con una prima massa fissa di 150 m/z, controllo automatico del guadagno di 100.000, 64 millisecondi di tempo massimo di iniezione e 35 NCE di energia di collisione utilizzando l'elenco di massa di inclusione da 400 a 940 con un passo di massa di 1 Dalton.
Creare la coda della sequenza di analisi nel software Xcalibur in modalità positiva e attivarla, quindi creare la sequenza nel software ChipSoft e avviare l'analisi in attesa che l'acquisizione del campione venga attivata da un segnale di chiusura del contatto proveniente dal robot di infusione diretta per ogni campione. Al termine dell'analisi in modalità positiva, creare la coda della sequenza di analisi nel software Xcalibur in modalità negativa e attivarla, quindi creare la sequenza nel software ChipSoft e avviare l'analisi in attesa che l'acquisizione del campione venga attivata da un segnale di chiusura del contatto proveniente dal robot di infusione diretta per ciascun campione. La concentrazione lipidica totale normalizzata è stata identificata e quantificata dalle 14 classi lipidiche più abbondanti, che era leggermente elevata per le classi lipidiche PE, PEO, PC, PCO, PI e PG e una certa regolazione verso il basso è stata osservata per i lipidi SM, LPE e PA.
Mentre nessuna differenza poteva essere vista per TAG e PS. Questi risultati mostrano anche che, tra le caratteristiche molecolari basate sulla formula molecolare totale, da 100 a 120 composti sono stati significativamente influenzati dall'esposizione al fumo di sigaretta. La deconvoluzione della frammentazione MS2 e la normalizzazione delle intensità del segnale del frammento hanno permesso la definizione approssimativa della quantità totale di ciascun acido grasso coniugato rappresentato in ciascun vetro lipidico e il confronto di questi dati tra gruppi esposti e gruppi di controllo. È stata osservata una diminuzione degli acidi grassi completamente saturi e di pochi acidi grassi insaturi, mentre gli acidi grassi polinsaturi nella composizione delle classi di fosfolipidi PC, PE e PG erano elevati nel gruppo del fumo di sigaretta per tutti i punti temporali.
I casi estremi di PC e PG coniugati con acido eicosapentaenoico e docosaesaenoico sono stati rilevati esclusivamente nel gruppo di esposizione 3R4F CS. Il pipettaggio del campione e del campione QC deve essere eseguito con punte a banda bassa e per essere precisi, il che significa che le punte devono essere controllate tra ciascun campione. Il pipettaggio della soluzione standard interna è fondamentale e deve essere accurato.
La soluzione di metanolo diclorometano da 1 a 1 deve essere maneggiata con cura e deve essere utilizzato un punte non plastificante per evitare di avere polimeri plastici nei campioni. Le punte devono essere cambiate tra ogni campione.
