Questo protocollo è significativo perché ci ha permesso di identificare se un campione di paziente conteneva anticorpi patogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua capacità di differenziare la reattività tra antigeni di superficie e intracellulari, che non possono essere facilmente discriminati con altri metodi. I neuroni ippocampali culturali vengono utilizzati per identificare nuovi anticorpi.
L'identificazione di questi nuovi anticorpi consente infine l'inizio di una specifica in monoterapie per migliorare gli esiti dei pazienti. Questa tecnica è importante perché può essere estesa a tutto il campo delle malattie legate agli anticorpi patogeni diretti alle proteine di superficie neuronali. Tenendo la testa dell'embrione con una pinza curva fine, perforare le orbite con un paio di sottili pinze dritte con un angolo di 45 gradi.
Quindi rilasciare la pinza curva fine. Con l'aiuto delle forbici chirurgiche, sezionare la pelle e il cranio a partire dall'osso occipitale fino all'osso frontale. Quindi rimuovere il cervello con un paio di pinze curve sottili e raccoglierlo nel piatto di sei centimetri con ibernazione più B27.
Una volta recuperati i cervelli di tutti gli embrioni, utilizzare la pinza dritta fine per separare sagittalmente i telencefaloni. Quindi, preparare un piatto di 10 centimetri posizionando gocce di ibernazione più B27 a distanze di un centimetro in un cerchio e posizionare un telencefalo per goccia per visualizzare attraverso il cannocchiale da dissezione con un ingrandimento di 1,25 X. Mentre si lavora al microscopio, rimuovere con attenzione il talamo e sbucciare le meningi per visualizzare meglio l'ippocampo.
Quindi sezionare l'ippocampo con le forbici a molla di precisione. E posizionarlo nel piatto da 3,5 centimetri con ibernazione più B27 e istrate due. Ripeti la procedura per raccogliere tutti gli ippocampi.
Per la dissociazione enzimatica dell'ippocampo, aggiungere un millilitro di tripsina al 2,5% nel tubo da 50 millilitri contenente l'ippocampo. Dopo aver portato il volume nel tubo a cinque millilitri con HBSS, incubare il tubo per 15 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Per diluire ulteriormente la tripsina, aggiungere 10 millilitri di HBSS preriscaldato e riposizionare il tubo a bagnomaria, impostato a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, utilizzare una micro pipetta da 1000 microlitri per trasferire l'ippocampo che appare come una massa di muco in un tubo da 50 millilitri. E incubare il tessuto con sei millilitri di HBSS preriscaldato per cinque minuti, come dimostrato. Per dissociare meccanicamente il tessuto, trasferire la massa ippocampale in un tubo da due millilitri con fondo conico.
Dopo aver aggiunto un millilitro di fluido DMEM preriscaldato, omogeneizzare il pellet con una micro pipetta da 1000 microlitri aspirando delicatamente su e giù. Assicurandosi di non creare bolle, ripetere l'aspirazione su e giù da 10 a 20 volte con una pipetta di vetro pre-tirata con la punta a contatto con il fondo conico del tubo fino a quando la miscela è traslucida. Contare le cellule prima di distribuirle uniformemente su un piatto di 3,5 centimetri con movimenti di agitazione incrociati.
Una volta fatto, posizionare il piatto nell'incubatrice con il 5% di anidride carbonica. Per l'immunocolorazione fluorescente di 14 giorni in vitro, aggiungere il campione contenente anticorpi anti-NMDAR ai vetrini di copertura e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo un'ora, trattare il campione con formaldeide al 4% e PBS come soluzione di fissazione a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi lavare la spinta del campione con PBS per cinque minuti ciascuno, seguita dall'aggiunta di anticorpi secondari di capra anti-umana Alexa Fluor 488 a una diluizione da uno a 1000 per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, montare i vetrini di copertura contenenti il campione con un mezzo di montaggio liquido e aspirare il liquido residuo. Visualizza i neuroni con l'imaging a fluorescenza.
Per l'imaging del calcio, utilizzare da 14 a 18 giorni in vitro cellule che sono state coltivate su vetrini di copertura. Prima dell'imaging, trattare le cellule con il vettore virale che codifica per pAAV2 CAG GCaMP 5G a 2,5 volte da 10 a 10 copie del genoma per millilitro per cinque-sette giorni. Un giorno prima dell'imaging, incubare le cellule con il campione del paziente per 24 ore.
Il giorno dell'imaging, preparare la configurazione e impostare la camera cellulare del microscopio a 37 gradi Celsius. Riempire la corsia con acqua distillata, infonderla con il 5% di anidride carbonica per mantenere le condizioni fisiologiche delle cellule. Dopo aver coperto le cellule con una soluzione fisiologica extracellulare, trasferirle nella camera cellulare del microscopio.
Aggiungere 10 micromolari NBQX per bloccare i recettori AMPA e KA e visualizzare la risposta del recettore NMDA. Acquisisci il filmato di quattro minuti con i fotogrammi registrati ogni 100 millisecondi. Poco dopo aver iniziato l'acquisizione, aggiungere una soluzione di stimolazione al piatto.
Dopo la stimolazione, estrarre il segnale fluorescente nel tempo dalla coltura incubata con il controllo e il liquido cerebrospinale del paziente o campioni di liquido cerebrospinale o CSF utilizzando software di elaborazione come Image J.It è stato osservato che le cellule in un giorno in vitro sono state distribuite uniformemente e hanno aderito alla piastra con una lamella che si sviluppa intorno al corpo cellulare e neuriti minori che iniziano ad estendersi. Dopo alcuni giorni di coltura, i neuriti si sono estesi a breve distanza e le cellule hanno mostrato una significativa polarizzazione. La rete neuronale ha continuato a crescere ed è diventata complessa.
A 18 giorni, i neuroni erano maturi, interconnessi e costruivano la rete neuronale. Le immagini fluorescenti rappresentative mostrano neuroni maturi a 18 giorni utilizzando marcatori selettivi. L'incubazione delle colture con i campioni di pazienti ha prodotto un intenso segnale di fluorescenza in quanto contiene gli anticorpi auto che riconoscono il recettore NMDA presente sulla superficie dei neuroni.
Al contrario, i campioni di controllo non hanno prodotto alcun segnale fluorescente quando somministrati alle colture neuronali. L'applicazione di NMDA ha aumentato l'intensità della fluorescenza come indicato da un cambiamento nella fluorescenza verde intracellulare. Quando è stato applicato lo stimolatore, i neuroni trattati con il campione di CSF di controllo hanno mostrato una maggiore differenza nell'intensità della fluorescenza rispetto alle cellule trattate con il campione CSF dei pazienti.
L'identificazione delle proprietà e la dissezione dell'ippocampo determinano la purezza delle colture. L'aggregazione cellulare è un fattore chiave, soprattutto quando si utilizzano le colture per scopi di imaging. Inoltre, i neuroni ippocampali in coltura possono essere utilizzati per identificare nuovi anticorpi e i loro antigeni bersaglio quando combinati con tecniche di immunoprecipitazione e spettrometria di massa.
Questa tecnica ha permesso la caratterizzazione di una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi. Pertanto, è essenziale nello studio del nuovo campo della nano immunologia.
