Vorremmo ringraziare Gaby Martins e gli organizzatori del workshop EMBO2010 3D Developmental Imaging dove questo lavoro è iniziato e tutti i collaboratori ai progetti Fiji e ImageJ.

1. 4D Time-lapse esperimenti di imaging Le impostazioni utilizzate per l&#39;acquisizione di immagini variano a seconda del materiale utilizzato. La capacità di microscopia confocale a sezione otticamente un campione dipende da una serie di fattori: la lunghezza d&#39;onda di eccitazione, dimensioni pinhole, apertura numerica dell&#39;obiettivo, l&#39;indice di rifrazione del campione e del mezzo in cui è incorporato il campione. La dimensione del foro stenopeico confocale selezionato determinerà lo spessore della sezione ottica raccolto. Un foro più piccolo produrrà una sezione ottica sottile aumentando la risoluzione asse z ma riducendo la quantità di luce catturata. Un foro più grande aumenta lo spessore della sezione ottica, riducendo la risoluzione asse z ma aumentando la quantità di luce catturata. Altri fattori da considerare durante la raccolta dei dati 4D prima correzione includono: <ol><li> Ottimizzare la velocità di scansione per rimuovere, o limite, deriva durante la cattura di un singolo punto temporale. Pertanto il tempo impiegato per la raccolta di immagini dovrebbe essere una piccola frazione dell&#39;intervallo tra punti temporali. </li><li> Strutture perfettamente ripetitive, o griglie, non sono adatti come strutture per la registrazione in quanto non è possibile determinare la correzione richiesta. Perline casualmente distribuiti o strutture irregolari permetterà la registrazione univoca. </li><li> Se si prevede di deriva, aumentare l&#39;area di scansione e limiti fuoco superiore e inferiore per assicurare l&#39;area di interesse rimane all&#39;interno della serie di immagini. </li><li> Oltre a garantire l&#39;opportuno risoluzione spaziale per risolvere le strutture di interesse, impostare la frequenza di campionamento per fornire la risoluzione temporale per gli eventi dinamici in fase di studio. Nota: Il tempo tra immagine punti temporali dovrebbe quindi essere almeno la metà del tempo-intervallo tra eventi che si ripetono regolarmente e diminuire per eventi irregolari. </li></ol> 2. Apertura del confocale Dataset Il pacchetto open source Fiji è una distribuzione del programma ImageJ, che contiene i plug-in pre-installati per eseguire numerosi processi sui dati raccolti dagli esperimenti di microscopia. Il software fornisce facile plug-in aggiornamento architettura e include una copia del corretto 3D deriva plug-in utilizzato per questo protocollo. Il software supporta l&#39;importazione di una vasta gamma di formati proprietari di immagine al microscopio attraverso l&#39;utilizzo di Bio-formati di importazione plug-in di Open Microscopia Ambiente. <ol><li> Installare il programma Fiji (http://fiji.sc/Downloads). </li><li> Caricare il set di dati acquisiti tramite il plugin Importatore LOCI Bio-formati. </li><li> Se il dataset è maggiore rispetto alla memoria assegnata al programma, selezionare l&#39;opzione &quot;Utilizza l&#39;opzione stack virtuale&quot; all&#39;interno della sezione gestione della memoria. </li></ol> 3. Correzione Drift di un oggetto 3D in Post Processing Nel corso di un prolungato tempo-lapseesperimento di un campione può muoversi anche quando incorporato. Per correggere qualsiasi movimento e consentire gli eventi di migrazione impressi da analizzare, post-elaborazione delle immagini può essere effettuata. Tutta l&#39;elaborazione dell&#39;immagine postale deve essere chiaramente descritta nella metodologia di qualsiasi analisi derivata da questo lavoro. <ol><li> Una volta che il dataset è stato caricato, eseguire il corretto 3D plug deriva. </li><li> Se ci sono canali di immagini multiple, selezionare il canale da utilizzare per registrare le immagini. Questo dovrebbe rappresentare idealmente una struttura statica all&#39;interno del campione piuttosto che elementi migratori o mobili. Tuttavia, se ciò non è possibile il canale di minor movimento dovrebbe essere scelto. </li><li> Se la RAM disponibile sul sistema utilizzato per questa analisi è inferiore a due volte la dimensione di dati originale, selezionare l&#39;opzione stack virtuale uso. Questo memorizzare il HyperStack registrato come una sequenza di immagini, piuttosto che salvare il file RAM. <ol><li> Selezionare una cartella per il plug-in per singola uscita corretto imafile Ges. Verrà creato un file di immagine separato per ogni canale in ciascuna posizione z. </li></ol></li><li> Il plugin sarà quindi condurre un&#39;analisi di correlazione di fase pair-wise tra ogni time-point per determinare la correzione richiesta che viene poi applicata al dataset. </li></ol>

<ol>
	<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+Microscopy.">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. 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Exp. (36), (2010).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish.">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li><li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li><li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome.">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li><li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion.">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La nostra capacità di utilizzare software di post-elaborazione per correggere la deriva campione di set di dati derivati ​​da estese time-lapse esperimenti di microscopia è limitato da una serie di fattori. La capacità di discernere deriva contro movimento migratorio di un campione dipende marcatori cellulari utilizzati. Marcatori cellulari che sono sia ampiamente espresse all&#39;interno di un campione o non sono coinvolti in eventi migratori durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine garantiscono la migliore ...

Confocale è ampiamente usato in biologia cellulare e dello sviluppo di seguire i movimenti delle cellule e dei cambiamenti nella morfologia. Acquisizione di una serie di sezioni ottiche a diversi piani focali consente la generazione di un tridimensionale (3D) modello di un campione, che può essere esteso in quattro dimensioni (4D) creando una serie tempo-intervallo di set di dati 3D. La generazione di set di dati 4D permette la misurazione dettagliata dei movimenti delle cellule e dei comportamenti. In esperimenti di time-lapse a lungo termine è comune osservare il movimento del campione. Ciò può essere causato da lievi imprecisioni in fase di controllo hardware e le posizioni focali. Mentre in altri casi, la deriva è il risultato di movimenti indotti dalla crescita campione o flessibilità all&#39;interno del mezzo di montaggio del campione. I metodi esistono per compensare o limitare questi movimenti compresi i miglioramenti ai sistemi di messa a fuoco hardware e una maggiore rigidità del mezzo di montaggio. Tuttavia, questi approcci non possono essere applicati in molti casi a causa del l&#39;imaging set fino tenuta a fornire le condizioni adatte per il mantenimento e la crescita dei campioni. Esistono soluzioni software open source per la correzione del movimento in 2D nel corso del tempo, attraverso l&#39;utilizzo delle StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins in ImageJ o Fiji, ma questi non possono essere applicate ai dataset 4D. Per correggere la deriva del campione abbiamo sviluppato un plug-in (Correct deriva 3D) per utilizzare la piattaforma di imaging di elaborazione open-source, Fiji 1. Il nostro plug-in è in grado di eseguire fase di registrazione correlazione per correggere movimento che si verifica a causa di deriva campione tridimensionali esperimenti temporizzati. Correlazione di fase 6 è un metodo efficiente di calcolo per determinare traduzione tra immagini. Il plug-in qui descritto utilizza la libreria di fase-correlazione sviluppato da Preibisch et al. 7. In esperimenti multi-canale, il plug-in utilizza un canale di determinazionene la correzione richiesta. Questa correzione viene quindi applicata a tutti i canali supplementari conseguente registrazione del set di dati 4D. Nel sistema modello zebrafish è possibile effettuare time-lapse imaging in un periodo di molte ore o anche diversi giorni 8. Un metodo comune per il montaggio del zebrafish è di incorporare l&#39;embrione vivo anestetizzato in bassa agarosio punto di fusione (0,8-1,5%), limitando il suo movimento 9-11. Mentre il movimento è limitato crescita del campione si verifica ancora, con conseguente cellule all&#39;interno del campo visivo posizione spostamento. Al fine di seguire il movimento delle cellule all&#39;interno dell&#39;embrione è necessario correggere prima per il movimento dell&#39;intero campione. Questo protocollo è stato sviluppato con i campioni di zebrafish, ed è stato utilizzato per lo sviluppo di immagini somite 12, ma può essere applicato a qualsiasi confocale dataset 4D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Low gelling temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9414-25G</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0208-4-PO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable 3mL graduated</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Samco</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">212</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Polyethylene transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">9cm bacterial grade Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">632180</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing</td>
			<td style="width:71px;">Bola</td>
			<td style="width:119px;">S1815-04</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Zeiss LSM-710 Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">421452-9600-000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample drift correction following 4d confocal time-lapse imaging

La generazione di quattro dimensioni (4D) dataset confocale; costituito da sequenze di immagini 3D nel tempo; fornisce un&#39;eccellente metodologia per catturare comportamenti cellulari coinvolti nei processi di sviluppo. La possibilità di monitorare e seguire i movimenti delle cellule è limitata dai movimenti di esempio che si verificano a causa di deriva del campione o, in alcuni casi, la crescita durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Inseguimento cellule in dataset colpite da drift e / o la crescita sarà integrare questi movimenti in una qualsiasi analisi della posizione della cella. Ciò può provocare il movimento apparente strutture statiche all&#39;interno del campione. Quindi prima di tracciamento delle cellule, la sua deriva campione deve essere corretto. Uso open source Fiji distribuzione 1 di ImageJ 2,3 e gli strumenti LOCI incorporati 4, abbiamo sviluppato il corretto 3D deriva plug-in per rimuovere movimento campione erronea in dataset confocale. Questo protocollo compensa in modo efficace per la traduzione campione o alterazioni po focalezione utilizzando fase correlazione registrare ogni time-point di una quadridimensionali dataset confocale, pur mantenendo la capacità di visualizzare e misurare i movimenti delle cellule nel corso prolungati esperimenti di time-lapse.

In zebrafish di sviluppo, le cellule muscolari veloci fondono in fibre multinucleate da 19 ore dopo la fecondazione (20 - fase somite) 13. Per visualizzare il movimento di nuclei e fusione di cellule muscolari noi svolte 4D confocale time-lapse utilizzando un ceppo transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore scheletrico α-actina di etichettare tutti del muscolo celle 14 e iniettato RNA codificante la proteina fluorescente rossa mCherry etichettato ...

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Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Microscopia time-lapse consente la visualizzazione dei processi di sviluppo. Crescita o deriva dei campioni durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine riduce la capacità di seguire con precisione e misurare i movimenti delle cellule durante lo sviluppo. Descriviamo l&#39;uso di software di elaborazione di immagini open source per correggere tridimensionale deriva campione nel tempo.

Correzione Drift seguente esempio 4D confocale Time-lapse imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Views.  Monash University.  Microscopia time-lapse consente la visualizzazione dei processi di sviluppo. Crescita o deriva dei campioni durante l'acquisizione dell'immagine riduce la capacità di seguire con precisione e misurare i movimenti delle cellule durante lo sviluppo. Descriviamo l'uso di software di elaborazione di immagini open source per correggere tridimensionale deriva campione nel tempo. 