Le fasi di organogenesi negli embrioni di topo rimangono scarsamente studiate in parte a causa della difficile visualizzazione delle strutture complesse embrionali. Questo protocollo descrive le tecniche che consentono la visualizzazione e l'analisi 3D e 4D degli embrioni di topo durante l'estensione e la segmentazione assiale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di studiare e mostrare le complesse strutture dell'embrione di topo come oggetti dinamici 3D.
Questo protocollo contiene tecniche che possono essere utilizzate nello studio delle malformazioni congenite che colpiscono la vertebra e il midollo spinale dei mammiferi, come la scoliosi. Queste tecniche possono essere utilizzate anche con sistemi modello in vitro, consentendo così lo studio dello sviluppo embrionale umano. Per preparare gli embrioni di topo tra il giorno embrionale 8.25 e il giorno embrionale 10.5 per l'imaging dal vivo, sezionare gli embrioni in mezzo M2 preriscaldato a 37 gradi Celsius.
Rimuovere delicatamente il sacco vitellino con una pinza pulita e lavare l'embrione una volta con un mezzo M2 fresco per rimuovere il sangue e i detriti prodotti durante la dissezione. Durante la procedura di imaging dal vivo, incubare embrioni in mezzo DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con FBS definito 10% HyClone, due L-glutammina millimolare e 1% penicillina streptomicina in una camera riscaldata a 37 gradi Celsius e un 65% di ossigeno con il 5% di anidride carbonica. Per preparare embrioni di topo allo stadio simile per la microscopia a immunofluorescenza, invece di usare M2 riscaldato, sezionare gli embrioni in PBS freddo e fissare in paraformaldeide al 4%.
Dopo aver eseguito l'intero protocollo di colorazione dell'immunofluorescenza come descritto nel manoscritto di testo, la clearance dei tessuti può essere ottenuta utilizzando RapiClear. In primo luogo, posizionare gli embrioni al centro di un vetrino concavo di depressione da 75 per 25 millimetri, rimuovere tutto il PBST nel vetrino di depressione del microscopio e aggiungere 200 microlitri di soluzione di compensazione, quindi coprire la preparazione del vetrino con una scatola. Dopo 10 minuti protetti dalla luce, quando gli embrioni iniziano a diventare trasparenti, sostituire la soluzione di compensazione e attendere altri 20 minuti.
Coprire l'embrione con una coverslip partendo da un lato e muovendosi delicatamente verso l'altro. Il campione è ora pronto per l'imaging. Per la pulizia utilizzando metil salicilato o BABB, assicurarsi che gli embrioni siano completamente disidratati in metanolo al 100% e quindi iniziare la serie di BABB e metanolo con aumenti di concentrazione successivi del 20% e un'incubazione di 20 minuti per ogni fase.
Quando la soluzione BABB raggiunge il 100%, apportare due modifiche aggiuntive per una nuova soluzione. Preparare un vetrino di copertura da 20 per 60 millimetri 1,5 per montare gli embrioni per evitare di comprimere il campione. Aggiungi distanziali realizzati con sottili rondelle metalliche.
Trasferire gli embrioni eliminati sui vetrini del microscopio usando uno stuzzicadenti, una punta di cotone fine o una pipetta Pasteur. Quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, coprire con un altro vetro di copertura simile e sigillare con paraffina fusa per stabilizzare meglio la preparazione per evitare bolle. Posizionare il coverslip su un lato e poi farlo scorrere gradualmente e delicatamente lateralmente, aggiungendo altro mezzo se necessario.
Il campione è ora pronto per essere ripreso al microscopio. Utilizzare Fiji/ImageJ per riposizionare l'embrione in una posizione standardizzata dell'asse anteriore-posteriore e dorsale-ventrale dopo l'imaging. Riduci le dimensioni del set di dati nell'immagine delle Figi, quindi ridimensiona e inserisci i valori di scala X, Y e Z necessari per ridurre il set di dati a meno di 200 megabyte.
Assicurati che l'opzione Crea nuova finestra sia selezionata. Quindi vai ai plugin e apri 3D Viewer. All'interno della finestra del Visualizzatore 3D, fai clic sull'embrione per selezionarlo, facendo apparire una casella 3D rossa.
Quando si utilizza questa modalità, controllare la rotazione del set di dati con un mouse. Dopo aver assicurato la posizione perfetta dell'embrione, selezionare modifica, trasformare l'immagine ed esportare l'immagine trasformata nella finestra del Visualizzatore 3D. Ispeziona i diversi piani ortogonali, quindi vai all'immagine, quindi impila e seleziona le viste ortogonali.
Quando l'embrione è posizionato correttamente, selezionare il menu della finestra visualizzatore 3D, quindi modificare, trasformare e salvare la matrice di trasformazione in un file di testo con estensione mat. Apri il file di testo usando Fiji/ImageJ, rimuovi le prime due righe e salva di nuovo. Questo crea un file matrice di trasformazione compatibile con il plugin TransformJ.
Passare al set di dati a piena risoluzione ed eseguire l'operazione plugin TransformJ e TransformJ affine. Nella nuova finestra, cercare il file della matrice precedentemente salvato, selezionare l'interpolazione cubica B-spline e ricampionare isotropicamente, quindi fare clic su OK. Dopo aver riposizionato correttamente l'embrione, tagliare la maggior parte dello spazio vuoto creato. Per eseguire un'immagine di proiezione Z completa, fare clic su stack, Z Project e scegliere l'intensità massima.
Quindi disegna il ROI minimo che contiene l'intero embrione in X e Y.Passa alle finestre dell'immagine del set di dati originale facendo clic su modifica, selezione, ripristina selezione e ritaglia selezionando l'immagine. Taglia le fette all'inizio e alla fine che non intersecano i tessuti embrionali selezionando l'immagine e aprendo le pile, fai clic sugli strumenti, seleziona il dispositivo di rimozione delle sezioni e specifica la prima e l'ultima fetta da rimuovere, assicurandoti di cambiare l'incremento in uno. Se lo si desidera, eseguire ulteriori analisi e ricostruzioni 3D utilizzando le istruzioni nel manoscritto di testo.
Per eseguire l'analisi 3D di embrioni più sviluppati, sezionare feti embrionali giorno 18,5 in PBS freddo, rimuovere tutte le membrane embrionali extra, quindi lavare i feti più volte in PBS fresco per rimuovere sangue e detriti prodotti durante la procedura di dissezione. Fissare i feti in 4% PFA fatto in PBS a quattro gradi Celsius per cinque o sette giorni. Dopo aver lavato l'embrione più volte in PBS, disidratare i feti incubando nel 10%10 aumenti successivi di soluzioni di metanolo fino a raggiungere il 100% di metanolo.
Eseguire ogni incubazione per 25 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Successivamente, incubare i feti separatamente su uno shaker prima per un giorno in perossido di idrogeno al 5% in metanolo e poi in perossido di idrogeno al 10% in metanolo per un massimo di tre giorni fino a quando gli embrioni perdono tutta la pigmentazione naturale. Reidratare gradualmente gli embrioni in una serie di metanolo inversa in acqua demineralizzata con ogni incubazione per 20 minuti su uno shaker a temperatura ambiente, quindi lavare gli embrioni tre volte per 30 minuti per lavaggio in acqua demineralizzata.
Per incorporare i feti in blocchi di agarosio all'1%, riempire un tubo di plastica da 50 millilitri o una siringa con agarosio fuso, quindi posizionare il feto nell'agarosio in posizione verticale e mantenere questa posizione con una pinza durante la solidificazione dell'agarosio. Posizionare lo stampo con il blocco a quattro gradi Celsius per 30 minuti affinché l'agarosio si gelatini completamente, quindi rimuovere il blocco di agarosio con il feto dallo stampo e metterlo in un contenitore con acqua demoralizzata. Eseguire la disidratazione del feto gradualmente con aumenti del 10% della concentrazione di metanolo diluito in acqua demineralizzata o PBS, mantenendo il campione in concentrazione di metanolo per almeno 45 minuti a temperatura ambiente su uno shaker fino al raggiungimento del 100% di metanolo.
Eliminare i feti spostandoli attraverso una soluzione babbana in serie e metanolo per 2,5 ore in ogni concentrazione con aumenti del 25% della concentrazione di BABB fino a raggiungere il 100% di BABB. Sostituire la soluzione BABB con una nuova ogni giorno fino a quando il feto non è completamente trasparente. Questo processo potrebbe richiedere da tre a cinque giorni.
Utilizzare la colla per collegare il blocco di agarosio eliminato all'asse motore dello scanner OPT, quindi regolare l'ottica per ottenere un'immagine dell'intero feto e procedere all'acquisizione di un set di dati di proiezione completo. La tecnica di live imaging 4D consente l'analisi dinamica dell'espressione del reporter LuVeLu e degli embrioni embrionali knockout condizionati al giorno 8.5 Snai1. Insieme al normale segnale LuVeLu sul mesoderma presomitico, gli embrioni knockout condizionali Snai1 mostrano l'espressione LuVeLu nel rigonfiamento ectopico che deriva dalla striscia primitiva.
I saggi di immunofluorescenza a montaggio intero consentono il rilevamento di potenziali NMP e regolatori chiave della differenziazione del mesoderma. Le frecce bianche e gialle evidenziano le differenze negli embrioni mutanti e selvatici. La renderizzazione 3D di immunocolori a montaggio intero consente una migliore comprensione del tessuto o della struttura nello studio.
In questo caso, è stata studiata la posizione di potenziali NMP nel bocciolo della coda. Le ricostruzioni tissutali 3D sono anche importanti per comprendere e caratterizzare i difetti morfologici negli embrioni di topo. La visualizzazione interattiva della ricostruzione 3D può anche essere costruita in formati user-friendly.
Ad esempio, in un file PDF. Queste strutture caudali embrionali 3D possono essere utilizzate per illustrare la potenza dei modelli 3D a un pubblico più generale e per aiutare nello studio nell'insegnamento dell'allungamento e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, la visualizzazione 3D in toto di embrioni di topo più sviluppati è possibile utilizzando la tecnica di microscopia OTP.
I rendering animati sono mostrati qui, evidenziando le fette chiave dei feti embrionali del giorno 18.5. La cosa più importante da ricordare è che il risultato deve rimanere una rappresentazione fedele di ciò che si osserva nell'embrione. I ricercatori possono utilizzare questi metodi per andare oltre la presentazione solo statica alle immagini, ma includono anche video, ricostruzioni tridimensionali e persino modelli 3D interattivi dei loro dati.
