Il nostro metodo utilizza la selezione della gamma host e marcatori fluorescenti per la generazione efficiente e senza soluzione di continuità del virus vaccina ricombinante in una varietà di tipi di cellule. Questa tecnica combina la velocità di ricombinazione omologa con la natura scarless della selezione dominante transitoria. Inoltre, ospitiamo la selezione dell'intervallo per eliminare la possibilità di cambiamenti prodotti chimicamente.
Questo metodo può anche essere utilizzato per modificare il virus vaccinia o altri poxvirus per esprimere geni estranei, ad esempio, per generare vaccini. Se si esegue questo protocollo solo con la selezione della fluorescenza, è necessario assicurarsi di vagliare abbastanza virus da rilevare un ricombinante relativamente raro senza pressione selettiva PKR. Questo metodo si basa sul guadagno e sulla perdita di marcatori fluorescenti per selezionare correttamente i virus che hanno acquisito le cassette di ricombinazione e per rilevare virus che hanno ricombinato senza cicatrici.
Per generare un vettore di ricombinazione, aggiungere prima 17 microlitri di acqua libera della DNasi, 1,2 microlitri di ogni primer, cinque microlitri di tampone di reazione PCR 5x, DNA modello e 0,5 microlitri di DNA polimerasi a un tubo PCR per amplicon. Aggiungere ulteriore acqua priva di DNasi per portare il volume finale in ogni tubo a 50 microlitri. E posizionare i tubi in un termociclo.
Sciogliere il DNA a 98 gradi Celsius per 30 secondi prima di utilizzare 25 passaggi di un protocollo PCR in tre passaggi come indicato. Per visualizzare i prodotti di amplificazione su un gel di agarosio dell'1%, aggiungere 10 microlitri di ogni prodotto dna e 2 microlitri di buffer di carico ad ogni pozzo. Eseguire il gel per un'ora a otto volt per centimetro.
Alla fine della corsa, utilizzare un kit di estrazione del gel di DNA secondo il protocollo del produttore per purificare ogni amplicon. Elute gli ampli dalla colonna con 50 microlitri di acqua libera da DNasi e centrifugazione immediata. Per linearizzare un vettore di clonazione, aggiungere prima un microgrammo del vettore, 17 microlitri di acqua libera della DNasi, 2 microlitri di buffer di reazione e 1 microlitro di EcoRI a un tubo per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere 0,2 picomoli del vettore linearizzato 10 microlitri di acqua libera della DNasi e 10 microlitri di mix principale di assemblaggio del DNA ad ogni amplicono isolato. Incubare campioni a 50 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, trasformare E.coli chimicamente competente con due microlitri del prodotto assemblato secondo protocolli standard.
Piastra 100 microlitri di cellule trasformate su piastre di agarosio LB integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, selezionare colonie ben isolate per l'inoculazione nel brodo di Luria integrate con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina durante la notte a 37 gradi Celsius e 225 giri al minuto. La mattina dopo, usa un kit di miniprep plasmide per isolare i plasmidi.
E controllare la concentrazione e la purezza del DNA su uno spettrofotometro. Per la generazione di virus ricombinanti, infettare un monostrato confluente di cellule adatte con il virus da ricombinare a una molteplicità di infezione di uno su una piastra a sei pozzi. E incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora.
Al termine dell'incubazione, sostituire il supernatante in ogni pozzo con DMEM fresco e utilizzando un reagente di trasfezione disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore. Aggiungere a ciascun pozzo tre microgrammi del vettore di ricombinazione di interesse. Posizionare la piastra nell'incubatore per ulteriori 48 ore.
Prima di mettere in comune le cellule da ogni condizione di trasfezione in singoli tubi da 1,5 millilitri. Quindi congelare le cellule raggruppate tre volte prima di sonicare i lisciviati risultanti per 15 secondi a un'ampiezza del 50%. Successivamente, diluire serialmente 10 volte il lysato sonicato, raccolto da 10 alla prima a 10 alla sesta concentrazione in DMEM fresco e aggiungere un millilitro di ogni diluizione ai singoli pozzi confluenti di una linea cellulare competente della protein chinasi R.
Posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora prima di sostituire i supernaganti con mezzo fresco e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. Dopo 24-48 ore, identificare i virus ricombinanti mediante microscopia a fluorescenza. Le placche provenienti da virus ricombinanti esprimono fluorescenza rossa dovuta all'integrazione del gene di fusione mCherry-E3L.
La placca purifica i virus ricombinanti tre volte su cellule selvatiche di tipo RK13. Dopo tre cicli di purificazione della placca, infettare le cellule RK13+E3L+K3L con diluizioni seriali del lisato di placca. Identificare i virus collassati, mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un adeguato sistema di imaging dotato di cubi filtranti GFP e RFP.
Quindi la placca purifica le placche VC-R4 solo verdi o E3L incolori tre volte sulle cellule RK13+E3L+K3L. Assicurarsi che nessuna placca fluoresce rosso. Infettare le cellule con almeno 100 unità di formatura della placca per aumentare le possibilità di identificare una placca incolore.
In rari casi, potrebbero essere necessari più cicli di infezione. Le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 della protein chinasi R competenti sono indicative dell'espressione virale di mCherry-E3L. E placche o placche incolori che esprimono solo eGFP nelle celle RK13+E3L+K3L confermano il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L.
Il virus ricombinante VC-R4, che manca di entrambi gli antagonisti della protein chinasi R, non può replicarsi nelle cellule RK13 della protein chinasi R competente mentre l'apparente virus VP872, che esprime E3L è competente per la replicazione. Per confermare che questa incapacità di replicarsi nelle cellule RK13 era dovuta solo alla perdita di E3L, il GFP potenziato è stato sostituito con E3L nel virus VC-R4. Ha generato un virus rilevante utilizzando lo stesso protocollo di selezione.
È interessante notare che, pur rendendo questo virus, sono state identificate placche incolori coerenti con il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L prima della selezione nelle cellule RK13+E3L +K3L che sono generalmente necessarie per selezionare ricombinanti senza cicatrici. Probabilmente a causa dell'identità di sequenza estesa tra la cassetta di ricombinazione mCherry-E3L e il gene E3L inserito in VC-R4. In media il 12,6% dei virioni di progenie è stato sottoposto a ricombinazione con il plasmide trasfetto, simile alle frequenze precedentemente riportate.
Qui viene mostrata la frequenza delle placche incolori rispetto alle placche totali RK13+E3L+K3L, dimostrando che la velocità di collasso e la perdita del marcatore di selezione mCherry-E3L si sono verificate ad una frequenza di circa l'1,8%. Nella prima fase l'utilizzo di cellule competenti PKR garantisce che tutte le placche con virus ricombinante contenuto. Nella seconda fase l'utilizzo di cellule carenti di PKR consente il rilevamento di virus ricombinante con un collasso mCherry-E3L locus.
Questo approccio ci consente di generare rapidamente virus contenenti geni esogeni, ad esempio, per la produzione di vaccini offrono l'espressione di diversi antagonisti virali della PKR. facilitare l'analisi delle interazioni specifiche delle specie con PKR provenienti da vari host.
