Questo approccio offre un modo efficiente per introdurre altri antigeni virali nel genoma HVT per il rapido sviluppo di vaccini ricombinanti. Un certo vantaggio di questa tecnica è che una cassetta di espressione GFP viene attaccata all'inserto prima per una facile visualizzazione e poi rimossa dal sistema Cre-LoxP. Lo stesso approccio può essere usato per inserire più geni virali in diverse posizioni del genoma HVT, o altri virus dell'herpes aviario per lo sviluppo di vaccini ricombinanti multivalenti.
A dimostrare la procedura sarà Katy Moffat, esperta nello smistamento delle celle. Na Tang, Yaoyao Zhang e Guanggang Qu, scienziati del mio laboratorio. Il giorno prima della trasfezione preparare i fibroblasti embrionale pulcino come delineato nel protocollo di testo.
Semina 1,3 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo in ogni pozzo di una piastra di sei pozza. Trasfezionare le cellule CEF con 0,5 microgrammi ciascuno dei due plasmidi RNA guida Cas9 e un microgrammo del plasmide donatore utilizzando un reagente di trasfezione appropriato secondo le istruzioni del produttore. Incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 12 ore.
12 ore dopo la trasfezione diluire lo stock di virus HVT con mezzo di coltura M199 a una concentrazione di 100.000 unità di formatura della placca per millilitro. Aggiungere 130 microlitri del virus diluito ad ogni pozzo di cellule trasfette. Impostare un pozzo di cellule non trasfette come controllo negativo e aggiungere la stessa quantità di virus.
Incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre giorni. Il giorno prima dello smistamento preparare due 96 piastre di pozzo seminando 20.000 cellule in ogni pozzo. Tre giorni dopo l'infezione recuperano le sei piastre del pozzo contenenti i CEF trasfettato e infetto.
Aspirare il mezzo da ogni pozzo e sciacquare il foglio cellulare con PBS. Aggiungere un millilitro dello 0,05% di tripside-EDTA a ciascun pozzo e incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per circa cinque minuti. Quindi, rimescolare le celle con 50 microlitri di FBS e trasferire questa sospensione in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Centrifuga a 200 volte la gravità per cinque minuti. Rimospendare le celle in un millilitro di PBS contenente 1%FBS. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la densità cellulare a un milione di cellule per millilitro.
Quindi, trasferire le celle in un tubo di smistamento in polistirolo attraverso il tappo del filtro. Utilizzando uno smistatore di celle ordinare le singole celle che esprimono GFP nelle piastre prese 96 poggiasto. Incubare le piastre con le cellule ordinate a 38,5 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per cinque giorni.
Dopo cinque giorni utilizzare il microscopio a fluorescenza per controllare le 96 piastre del pozzo e contrassegnare i pozzi che contengono una singola placca positiva GFP. Tripinare bene ogni GFP positivo con 50 microlitri di tripina-EDTA per tre minuti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura per rimostrare le cellule e trasferire questa sospensione in un pozzo di una piastra a sei pozzi con CEF.
Dopo tre giorni congelare una fiala di ciascuna della prima generazione di virus ricombinanti in mezzo di congelamento. Conservare questi virus raccolti in azoto liquido. Raccogli 100.000 cellule da ciascuna delle prime generazioni di virus.
Centrifugare le cellule a 2.000 giri/min per cinque minuti e scartare il supernatante. Conservare le cellule a -20 gradi Celsius fino a quando non sono pronte per eseguire l'estrazione del DNA. Quando è pronto per eseguire l'estrazione del DNA, utilizzare 50 microlitri di tampone di schiacciamento per scongelare e rimpiorsi il pellet cellulare.
Lisciviare i campioni a 65 gradi Celsius per 30 minuti e poi a 95 gradi Celsius per due minuti per inattivare la Proteinasi K.Eseguire una reazione PCR con tre primer di giunzione primaria utilizzando un microlitro di ogni campione di DNA come delineato nel protocollo di testo. Caricare due microlitri dei prodotti di amplificazione in un pozzo dell'1% di gel di agarosio per l'elettroforesi in gel. Per rimuovere il gene GFP dal virus ricombinante, utilizzare un reagente di trasfezione per trasfezionare due microlitri di cre recombinasi espressione plasmide nella piastra a sei pozzi che è stata presentata con cellule CEF.
12 ore dopo la trasfezione scongelare una fiala di virus ricombinante dall'azoto liquido. Resosticcare delicatamente il virus e seminare 50 microlitri in ogni pozzo di cellule trasfette, impostandone uno così come il controllo negativo con la stessa quantità di virus. Incubare a 38,5 gradi Celsius per tre giorni.
72 ore dopo l'infezione preparano le cellule per lo smistamento come descritto in precedenza. Ordinare le singole celle non fluorescenti in una piastra di 96 po 'prese con CEF. Quindi, tripinare le placche scelte e rimorsinare le celle corrispondenti come delineato nel protocollo di testo.
Passare metà delle cellule in ogni pozzo di una piastra di pozzo 96 che è stata prese con CEF come seconda generazione. Centrifugare le cellule rimanenti di ogni clone a 200 volte la gravità per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con 50 microlitri di tampone di schiacciamento per l'estrazione del DNA.
Quindi, eseguire PCR con cinque primer di giunzione primaria utilizzando un microlitro di modello di DNA come delineato nel protocollo di testo. Sulla base dei risultati PCR scegli da tre a cinque cloni positivi di HVT ricombinante per ulteriori passaggi e verifiche. In primo luogo, infettare i CEF con la seconda generazione di HVT ricombinante in una piastra di pozzo da 24 prese.
48 ore dopo l'infezione rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% nel PBS per fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere il fissatore e lavare lo strato cellulare tre volte con PBS.
Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri dello 0,1%Triton X-100 per permeabilizzare le celle. Dopo 15 minuti lavare lo strato cellulare tre volte con PBS. Aggiungere il buffer di blocco per un'ora per bloccare l'associazione non specifica.
Quindi, diluire l'anticorpo primario anti-VP2 anticorpo monoclonale HH7 o siero di pollo infettato da HVT a uno a 200 nel tampone di blocco. Aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario diluito ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Lavare lo strato cellulare tre volte con PBS.
Diluire l'anticorpo secondario capra anti-topo IgG Alexa 568 o capra anti-pollo IgG Alexa 488 a uno a 200 nel tampone di blocco. Aggiungere 200 microlitri di anticorpi secondari diluiti ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS.
Utilizzare il microscopio a fluorescenza per controllare l'espressione proteica. Il giorno prima dell'espansione del virus seme 2,6 milioni di cellule CEF in ogni pallone T25. Scongelare almeno tre cloni positivi e aggiungere una fiala di cellule o virus a ciascun pallone.
Incubare i contenitori a 38,5 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando non si osserva un effetto citopatico del 50%. Successivamente raccogliere le cellule in due millilitri di mezzo di coltura. Infettare 50 microlitri in un nuovo pallone T25 che è stato prese con cellule CEF per la prossima generazione.
Continuare a far passare il virus ricombinante per almeno 15 generazioni. Utilizzando PCR analizzare ogni generazione di virus per la presenza della sequenza VP2. Utilizzando un saggio di immunofluorescenza indiretta analizzare ogni generazione di virus di espressione VP2.
Dopo lo smistamento a singola cellula, il virus purificato ottenuto viene analizzato da tre PCR a giunzione primaria, che mostra un prodotto PCR delle dimensioni previste. Dopo l'escissione del reporter del GFP da parte di Cre ricombinasi oltre il 50% delle placche perse la loro espressione GFP. La placca purificata dopo l'escissione GFP è ottenuta mediante cernita a cella singola ed è ulteriormente confermata da cinque PCR a giunzione primaria che mostra il prodotto della dimensione prevista.
L'espressione proteica è quindi confermata da un test indiretto di immunofluorescenza con anticorpo monoclonale specifico VP2 e siero di pollo anti-HVT. Come previsto, le cellule infettate dall'HVT parentale possono essere macchiate solo da siero anti-HVT. Mentre le cellule infettate da HVT ricombinante mostrano chiaramente l'espressione del gene VP2.
Per generare un virus ricombinante è necessario un alto tasso di trasfezione per massimizzare la possibilità che il virus e l'inserto si incontrino nella stessa cella per la modifica. Seguendo questa procedura possono essere eseguiti esperimenti sugli animali per valutare l'immunogenicità e l'efficacia dei vaccini ricombinanti. Lo sviluppo di nuovi vaccini vettoriali multivalenti utilizzando la piattaforma di sistema CRISPR/Cas9 qui descritta sarà altamente vantaggioso per l'industria avicola per proteggersi da più malattie del pollame.
