Gli autori desiderano ringraziare George Farr e i membri del laboratorio di Horwich per le utili discussioni. Questo lavoro fu supportato dall'Howard Hughes Medical Institute.

Le procedure descritte qui per anestesia, eutanasia e perfusione cardiaca dei topi sono state eseguite secondo un protocollo approvato dal Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione di strumenti e soluzioni senza RNasi
<ol><li>La RNasi è un contaminante comune di tutte le superfici di laboratorio, inclusi piani di banco, micropipette e lo sperimentatore.<ol>
<li>Cambiare spesso o regolarmente i guanti con una soluzione di decontaminazione RNAse.</li>
		<li>Gli utensili di dissezione e le vetrerie in acciaio inossidabile possono essere resi senza RNasi riscaldando a >200 °C per 1 ora o più. Nota: la sterilizzazione a vapore non distrugge la RNasi. In alternativa, pulire con una soluzione di decontaminazione RNasi, quindi con etanolo e asciugare all'aria senza RNasi al 70%.</li>
		<li>Pulire i piani di banco, altre superfici di laboratorio e micropipettori con soluzione decontaminante RNasi, quindi con etanolo 70% privo di RNasi. Designare un banco di laboratorio o un'area di lavoro specifica per il recupero e l'analisi dell'RNA. Nota: rimuovere gli espulsori di punta prima di pulire gli alberi dei pipettor e lasciarli fuori, se possibile.</li>
		<li>Utilizzare tubi, tubi a microcentrifugo, pipette e punte di micropipette certificate dal loro produttore come libere da RNasi. Si consiglia l'uso di punte di rilegatura e microtubi molto bassi. Se possibile, utilizzare scatole o sacchetti appena aperti di questi componenti e tenerli separati dalla fornitura generale di laboratorio.</li>
		<li>Ottenere soluzioni senza RNasi [PBS (PBS) privo di calcio e magnesio di Dulbecco, etanolo, etanolo 70% privo di RNasi] da fonti commerciali. Utilizzare bottiglie appena aperte per ogni esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La fonte del colorante Azure B è fondamentale per il successo del recupero dell'RNA intatto. Testare ogni lotto di colorante prima di impegnare campioni preziosi per la colorazione e la raccolta. Raccogli alcune migliaia di neuroni da un animale non sperimentale, prepara l'RNA e determina l'integrità dell'RNA come descritto di seguito per trovarne uno che produca costantemente numeri RIN superiori a 8,5.<ol>
<li>Sciogliere il colorante Azure B (1%, wt/vol) in etanolo senza RNasi al 70%, in genere 0,3 g in 30 ml di etanolo in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare bene su un rocker a RT durante la notte o fino a quando tutte le particelle si sono sciolte. Un tubo di questa soluzione può essere utilizzato per macchiare più diapositive senza influire sull'intensità di colorazione.</li>
		<li>Per precauzione, utilizzare un diverso tubo di macchia per ogni replica biologica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare i criomoldi e O.C.T. per incorporare sezioni di corde senza ulteriore trattamento.</li>
	<li>Mantenere il criostato a -20-24 °C. Dopo la sessatura, posizionare le diapositive in un congelatore a -80 °C fino a quando non è stato preparato un numero sufficiente. Iniziare la preparazione dell'RNA il prima possibile dopo che le diapositive sono state fatte. Per la conservazione a lungo termine, mantenere i blocchi oct non sessati o parzialmente sessati, anziché le diapositive, a 80 °C.</li>
	<li>Fare il tampone di tiocianato di guanidina per la preparazione dell'RNA dai motoneuroni sezionati utilizzando le soluzioni fornite dal produttore del kit di preparazione dell'RNA secondo le sue indicazioni.</li>
</ol>2. Preparazione delle sezioni del midollo spinale dai topi (figura 1A)
<ol><li>Pulire tutti gli strumenti di dissezione, i vetrini, le lamette da barba e la piattaforma di dissezione cuocendo o pulendo con soluzione di decontaminazione RNasi, seguita da etanolo al 70% privo di RNasi. Lasciare asciugare per 2 minuti. Mantieni tutto privo di polvere coprendo con salviette da laboratorio.</li>
	<li>Le procedure di trattamento degli animali, tra cui anestesia, perfusione cardiaca ed eutanasia, dovrebbero essere eseguite secondo i requisiti del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali (IACUC), con l'obiettivo di portare rapidamente l'animale al punto di dissezione del midollo spinale.<ol>
<li>Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (ip) di una dose letale di ketamina (450 mg/kg).</li>
		<li>Una volta raggiunto un profondo livello di anestesia e confermato dalla mancanza di una risposta con le dita dei piedi, posizionare il lato ventrale del mouse su una piattaforma di dissezione (una tavola stirolo, ad esempio), aprire la cavità toracica per esporre il cuore e inserire l'ago a farfalla da 27 G di un'infusione impostata nel ventricolo sinistro (che si trova alla destra dell'investigatore). Intasare l'atrio destro con una flesso affilata e perfondere con PBS ad una velocità di 5-7 ml/min per circa 2 minuti utilizzando una pompa peristaltica. Il liquido che scorre dall'atrio dovrebbe essere in gran parte privo di sangue a questo punto.</li>
		<li>Rimuovere l'ago perfusione, decapitare il mouse e capovolgerlo sulla scheda di dissezione. Aprire la pelle per esporre la colonna vertebrale, utilizzare piccole forbici e pini per rimuovere le vertebre e sollevare il midollo spinale mentre si tagliano le radici nervose con una pinta affilata. Velocità e pratica sono essenziali per passare dall'inizio della perfusione alla rimozione del cavo; questo non dovrebbe richiedere più di 7 minuti.</li>
		<li>Risciacquare il cavo per 10 secondi in acqua priva di RNasi per lavare via qualsiasi sangue residuo. Posare il midollo spinale su uno scivolo di vetro privo di RNasi con una forza curva molto delicatamente ma rapidamente. Dividere il midollo spinale trasversalmente usando una lama di rasoio pulita in 9-10 pezzi.</li>
		<li>Posizionare i pezzi in un criomold riempito con O.C.T. usando le stesse pinie e allinearli verticalmente usando un ago pulito. Posizionare lo stampo in un vassoio poco profondo contenente 2-metilbutano preraffreddato con azoto liquido, quindi mettere il vassoio in un bagno di azoto liquido per congelare rapidamente i pezzi del midollo spinale per evitare la degradazione dell'RNA.</li>
		<li>Conservare il blocco incorporato nello Strumento di personalizzazione di Office a -80 °C per un massimo di 6 mesi prima della sezione. Il processo dal recupero del cavo attraverso il congelamento deve essere eseguito entro 5 minuti per mantenere l'integrità dell'RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criosezione del blocco incorporato O.C.T. a -20 °C con un criostato per produrre fette da 20 μm, ognuna contenente 9-10 sezioni trasversali del midollo spinale, su vetrini PEN-membrane 2 μm senza RNasi tenuti inizialmente a temperatura ambiente per garantire che le sezioni aderiscano allo scivolo. Ricongelare immediatamente la sezione su una superficie di -20 °C all'interno del criostato. Mantenere le diapositive a -80 °C fino a quando non vengono utilizzate.</li>
</ol>3. Colorazione delle sezioni del midollo spinale (figura 1A)
<ol><li>Su un rack pulito, disporre sei tubi conici da 50 ml. Riempirli tutti con 25-30 ml di etanolo 70% privo di RNasi, in modo che la profondità sia sufficiente per coprire tutte le sezioni su una diapositiva quando lo scivolo è immerso. Crea 30-35 ml di soluzione Azure B all'1% come descritto in precedenza e tienila sullo stesso rack per ridurre al minimo il tempo tra la modifica delle soluzioni durante il lavaggio o la colorazione. Tenere tre o quattro salviette da laboratorio davanti al rack per drenare rapidamente la soluzione extra.</li>
	<li>Togliere gli scivoli dal congelatore a -80 °C sul ghiaccio secco. Scongelare una diapositiva posizionandolo su un palmo guantato. Rimuovere la maggior parte dell'umidità e della condensa sullo scivolo pulerla con una salvietta da laboratorio, facendo attenzione a non toccare le sezioni. Mettere lo scivolo su essiccante fresco in gel di silice in una piastra di Petri per 30-40 secondi per asciugare completamente. Se l'umidità di laboratorio è elevata, è possibile utilizzare un breve trattamento in un essiccatore sottovuoto per asciugare lo scivolo più rapidamente.</li>
	<li>Lavaggio e colorazione.<ol>
<li>Immergere lo scivolo essiccato nel primo tubo di etanolo senza RNasi al 70%. Immergere la diapositiva per 30 secondi, quindi lavare la diapositiva per rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office immergendola su e giù per 45-60 secondi . Togliere lo scivolo dalla soluzione e drenare il liquido in eccesso sulle salviette da laboratorio. Ripetere lo stesso processo immergere lo scivolo nel secondo tubo del 70% di etanolo. Se lo STRUMENTO di personalizzazione di Office intorno alle sezioni del midollo spinale non è completamente sparito, ripetere il lavaggio nel terzo tubo.</li>
		<li>Dopo aver drenare il liquido in eccesso, immergere lo scivolo in soluzione Azure B all'1% in etanolo privo di RNasi al 70% per 30-45 secondi. Scolare l'Azure B in eccesso su una cancellazione di laboratorio; a questo punto, l'intera diapositiva sarà blu.</li>
		<li>Immergere lo scivolo nel tubo successivo del 70% di etanolo e immergere rapidamente su e giù 3-4 volte per rimuovere il colorante in eccesso e rendere visibile la colorazione specifica del motoneurone. Se le sezioni sembrano molto macchiate, ripetere il passaggio di destaining in un tubo fresco di 70% di etanolo. Se la colorazione sembra troppo leggera, riportare la diapositiva alla soluzione Azure B per altri 30 secondi e ripetere la colorazione. Pulire l'etanolo in eccesso e asciugare all'aria lo scivolo per ~ 40 secondi fino a quando tutto il liquido non è sparito. La materia grigia sarà azzurra, mentre i motoneuroni saranno macchiati di blu intenso, che è facilmente visibile. Avviare immediatamente la dissezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microdisezione di cattura laser (LMD) (Figura 1B)
<ol><li>Accendere il microscopio e scaricare il portatubi per fissare il tappo di un tubo di microfugo da 0,6 ml per la raccolta del campione. Mettere 30 μl di guanidina tiocianato lysis buffer nel tappo di un tubo di microfugo da 0,6 ml. Coprire la superficie del cappuccio con liquido diffondendo la soluzione utilizzando una punta di pipetta. In questo modo, tutti i neuroni raccolti verranno sciolti in soluzione solubilizzante man mano che vengono sezionati. Allineare il tappo al foro e l'obiettivo con il software del microscopio. Mantenere il cappuccio in posizione coperta fino all'avvio della cattura laser.</li>
	<li>Posizionare lo scivolo essiccato all'aria sul palco del microscopio LMD capovolto, in modo che la membrana dello scivolo PEN sia a faccia in giù. La membrana con sezioni dovrebbe affrontare il foro, sotto il quale c'è il tubo di raccolta.</li>
	<li>Accendere il laser 10 minuti prima di iniziare la preparazione dello scivolo. Concentrati su una sezione del midollo spinale con l'obiettivo 5X. Passare all'obiettivo 20X per la dissezione.<ol>
<li>Contrassegnare una regione "fittizia" con la penna leggera e consentire al laser di ritagliarla senza raccoglierla. Questo rilassa la membrana PEN e consente di contrassegnare e tagliare più regioni successivamente.</li>
		<li>Rifocalizzare e identificare i motoneuroni nella regione del corno ventrale. Questi neuroni sono riconoscibili per la loro posizione, la loro morfologia piramidale, le loro grandi dimensioni e la loro colorazione blu scuro con Azure B (Figura 2).</li>
		<li>Utilizzando la penna leggera, selezionare lo strumento di disegno e contrassegnare lungo il bordo dei motoneuroni, facendo un contorno completo. Cerca di rendere il contorno il più vicino possibile al motoneurone per evitare la contaminazione da cellule diverse dal motoneurone. (Testare alcune sezioni in anticipo per vedere quanto è larga la linea di taglio laser e regolare il gioco in base alle esigenze.) Contrassegnare più celle prima del taglio; il software ricorderà le posizioni.</li>
		<li>Portare il tappo sotto la posizione di taglio cliccando sulla posizione del cappuccio. Fare clic sul pulsante start per avviare la dissezione del motoneurone con il laser. Raccogli tutti i motoneuroni da tutte le sezioni su uno scivolo nel tappo di un tubo di microfugo.</li>
		<li>Al termine della raccolta, togliere il tubo di microfugo dal supporto scaricando il vassoio e slogando delicatamente il tubo. Sciogliere completamente i motoneuroni nel tampone pipettando la soluzione su e giù. Spostare la soluzione nel corpo del tubo centrifugando a 14.000 x g per 2 min a 4 °C. Congelare immediatamente il campione nel ghiaccio secco e conservarlo a -80 °C. Questo processo, dalla colorazione dello scivolo attraverso la raccolta dei motoneuroni, deve essere eseguito entro 30 minuti per una diapositiva per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparazione dell'RNA dai motoneuroni
Scongelare tutti i neuroni raccolti da un animale e metterli insieme per estrarre l'RNA. I campioni possono apparire blu pallido a seconda del numero di motoneuroni (macchiati con Azure B) in essi. Estrarre l'RNA utilizzando un kit adatto secondo il protocollo previsto per il tessuto LMD, eluendo nel volume minimo possibile. Prendere 1 μl per verificare la quantità e l'integrità del campione. Congelare rapidamente l'RNA rimanente sul ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
6. Determinazione della qualità e della quantità dell'RNA
Determinare la qualità dell'RNA con il campione da 1 μl su un chip microfluidica di elettroforesi capillare secondo il protocollo del produttore. I preparati totali di RNA con un numero di integrità dell'RNA (RIN) superiore a 8,5 possono essere utilizzati per RNA-seq e qRT-PCR. L'output dei dati include anche in genere la concentrazione approssimativa del campione.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La misura più significativa di successo di questo protocollo per la produzione di RNA totale mediante microdisezione laser delle fette del midollo spinale è il valore RIN5. Per i campioni di RNA provenienti da eucarioti più elevati, valori superiori a 8,5 producono regolarmente sequenziamento di alta qualità e dati qRT-PCR. Se la resa è bassa ma la qualità è alta, ripetere la preparazione. Se l'integrità è inferiore (anche 7,5-8), tuttavia, è meglio trovare la fonte del problema e riprovare. Ci sono molti passaggi in cui qualcosa può andare storto, ma in realtà solo due fonti del problema: la contaminazione endogena della RNasi o la contaminazione esogena della RNasi. Il primo può essere affrontato dalla pratica, in modo che il tempo dal sacrificio del mouse al congelamento del suo cavo incorporato O.C.T sia ridotto al minimo. L'altro punto del protocollo in cui la RNasi endogena può contribuire a un risultato scadente è durante la preparazione delle fette. Ogni fetta dovrebbe aderire rapidamente a una diapositiva PEN a temperatura ambiente, ma si scioglierà (l'O.C.T diventa chiaro). Più velocemente la fetta può essere rifozen, meglio è. Il criostato che usiamo ha superfici piane all'interno della camera che sono a -20 °C, che usiamo per ricongelare rapidamente la fetta. Trova un punto simile nel criostato utilizzato e assicurati che la fetta diventi di nuovo opaca rapidamente.
Rintracciare le fonti di RNasi esogena può essere difficile, perché ci sono così tante possibilità. Gli unici reagenti utilizzati che non sono espressamente liberi da RNasi sono O.C.T. e Azure B. Se Azure B ha funzionato in modo soddisfacente in precedenza, provare una bottiglia fresca di O.C.T., anche se questo reagente non è mai stato un problema. Anche i reagenti senza RNasi possono essere sostituiti, anche da un fornitore diverso. Una fonte molto più probabile è l'investigatore. Oltre a una pulizia accurata dell'area di lavoro, è spesso utile che un altro membro del laboratorio segua e osservi tutti i passaggi della procedura. Anche se si tratta di una persona che non esegue regolarmente questa procedura, un nuovo set di occhi può raccogliere una fonte di contaminazione altrimenti inosservata.
L'estensione di questo protocollo al recupero dell'RNA da altre cellule del midollo spinale, dalle cellule del midollo spinale di altre specie o da tipi di cellule specifiche in altri organi richiederà modifiche in diverse aree volte a ottenere una chiara identificazione delle cellule di interesse evitando, o almeno minimizzando, l'impatto della RNasi endogena. Nel protocollo qui, la rapida rimozione e congelamento del cavo, insieme alla colorazione Azure B in etanolo al 70%, ha permesso sia la minimizzazione della degradazione dell'RNA che la facile identificazione dei corpi cellulari dei motoneuroni. Azure B è una macchia istochimica ben consolidata per i neuroni che sembra legarsi all'RNA3 ed è stata utilizzata per valutare il contenuto di RNA dei neuroni nei campioni di autopsia del tessuto cerebrale da pazienti con malattia neurodegenerativa6. In particolare, la colorazione di Azure B non ha influito né sull'integrità dell'RNA purificato né sulla sua capacità di essere trascritta e analizzata inversamente. Altri coloranti, come il cresyl violet7 e il toluidina blue8 sono stati utilizzati in protocolli LMD simili. La raccolta dei corpi cellulari direttamente nella soluzione di tiocianato di guanidina mentre venivano sezionati ha fornito il passaggio finale che ha portato al recupero di routine dell'RNA intatto.
Approcci simili possono essere previsti per altre cellule e organi, riconoscendo che identificare le cellule di interesse riducendo al minimo o, preferibilmente, prevenendo la degradazione dell'RNA da parte delle RNasi endogene è il requisito fondamentale per un'analisi di successo. Nei tessuti che hanno alti livelli di RNasi, come il pancreas, la manipolazione rapida e la bassa temperatura sono stati combinati per consentire il recupero dell'RNA da β-cellule, sfruttando la loro autofluorescenza naturale per la visualizzazione9. Anche le procedure che utilizzano la colorazione degli anticorpi perl'identificazione sono state riportate 10, ma non hanno avuto pieno successo nelle nostre mani. Infine, sono disponibili molti modelli ditopi che esprimono proteine di fusione fluorescenti (ad esempio GFP, YFP, RFP) in cellule di interesse, che potrebbero essere utilizzate per identificarle in sezioni tissutali al microscopio LMD. Infatti, i ceppi di topi che abbiamo analizzato con questo protocollo esprimono una proteina di fusione tra SOD1 e YFP11e i loro motoneuroni del midollo spinale sono altamente fluorescenti. Non siamo stati in grado, tuttavia, di trovare una serie di lavaggi di etanolo e / o condizioni di disidratazione che rimuovevano simultaneamente l'O.C.T., inibiscono l'attività della RNasi e mantenevano costantemente una fluorescenza YFP sufficiente per consentire la visualizzazione dei motoneuroni e il loro recupero da parte dell'LMD. Forse una nuova proteina fluorescente o una variante di quelle disponibili che mantiene la fluorescenza nei solventi organici possono essere trovate per superare questa limitazione.

Nei tessuti di mammiferi composti da più tipi di cellule diverse, l'avvento della strumentazione di microdisezione di cattura laser (LMD) ha offerto la possibilità di selezionare un tipo di cellula specifico per l'analisi a livello di RNA o proteine. Attualmente, le tecniche di amplificazione e sequenziamento di nuova generazione consentono l'uso di un pool di RNA totale da alcune migliaia di cellule per ottenere un inventario relativamente completo del trascrittoma, compresa la valutazione dei livelli relativi di RNA e l'identificazione di varie forme spliced. Ad oggi, le analisi proteomiche di alcune migliaia di cellule raggiungeranno solo specie più abbondanti. Ad esempio, abbiamo identificato <1.000 delle proteine più abbondanti da 3.000-4.000 corpi cellulari dei motoneuroni (non mostrati), e Zhu e colleghi hanno recentemente riferito di identificare 2.665 proteine da ~ 15.000 cellule tumorali1. Con ulteriori sviluppi della spettrometria di massa, tuttavia, è probabile che tali analisi si estenderanno a una profondità molto maggiore.
Qui, presentiamo un protocollo specifico utilizzato per l'LMD dei corpi cellulari dei motoneuroni dal midollo spinale dei topi, seguito dalla preparazione dell'RNA. Questo protocollo è stato utilizzato nel contesto del confronto degli RNA dai motoneuroni di superossido mutante transgenico presintomatico dismutasi (SOD)1 topi di sclerosi laterale amiotrofica (ALS) con RNA preparati da un ceppo transgenico SOD1 di tipo selvatico sia da RNA-seq che da qRT-PCR convalida2. In particolare, i motoneuroni, nel corno anteriore della materia grigia nel midollo spinale, costituiscono il <10% della popolazione cellulare totale, circondati da un mare di astrociti e, come tali, il loro profilo trascrizionale non può essere facilmente sconvoluto dagli studi dell'intero cordone. Un approccio di cattura laser è quindi ideale per analizzare l'espressione dell'RNA in queste cellule, con la fisiologia preservata mediante rapida accisa e congelamento del cavo a seguito di una breve perfusione salina intracardiaca. I somata dei motoneuroni sono grandi e sono quindi facilmente rilevabili, qui utilizzando un colorante che ha una forte affinità per i neuroni3. Inoltre, con tali dimensioni, queste cellule forniscono una quantità relativamente grande di RNA per cellula catturata. La procedura utilizzata, come descritto di seguito, potrebbe essere facilmente regolata per ottenere altri tipi di cellule neuronali, così come potenzialmente altri tipi di cellule, specificamente identificate sia con tecniche di colorazione dei coloranti che con la colorazione degli anticorpi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

La preparazione di RNA di alta qualità da cellule di interesse è fondamentale per un'analisi precisa e significativa delle differenze trascrizionale tra i tipi di cellule o tra lo stesso tipo di cellule in salute e malattia o dopo trattamenti farmacologici. Nel midollo spinale, tale preparazione dai motoneuroni, bersaglio di interesse in molte malattie neurologiche e neurodegenerative, è complicata dal fatto che i motoneuroni rappresentano il <10% della popolazione cellulare totale. La microdisezione di cattura laser (LMD) è stata sviluppata per affrontare questo problema. Qui, descriviamo un protocollo per recuperare, congelare e seminare rapidamente il midollo spinale del topo per evitare danni all'RNA da parte di RNasi endogene ed esogene, seguito dalla colorazione con Azure B nel 70% di etanolo per identificare i motoneuroni mantenendo inibita la RNasi endogena. LMD viene quindi utilizzato per catturare i neuroni macchiati direttamente nel tampone di lisi tiocianato di guanidina, mantenendo l'integrità dell'RNA. Le tecniche standard vengono utilizzate per recuperare l'RNA totale e misurarne l'integrità. Questo materiale può quindi essere utilizzato per l'analisi a valle delle trascrizioni da RNA-seq e qRT-PCR.

Il protocollo sopra descritto e nella figura 1 dovrebbe produrre 50 ng o più di RNA totale con un RIN di >8,5 da 3.000-4.000 corpi cellulari del motoneurone del midollo spinale sezionati dalle fette da 9-10 20 μm su circa 20 diapositive PEN. Poiché questo numero di diapositive rappresenta meno del 10% di un blocco incorporato o.C.T. di un midollo spinale del mouse, è possibile tornare al blocco, che è stato memorizzato a -80 °C, e tagliare più fette per passare attraverso un altro ciclo di preparazione dell'RNA. Se sono necessarie maggiori quantità di RNA per un'analisi, è meglio fare solo il numero di diapositive (ad esempio 20)contemporaneamente che possono essere elaborate attraverso la dissezione e la preparazione dell'RNA in pochi giorni, quindi fare più diapositive per un secondo round e combinare i prodotti. Assicurati prima di controllare il RIN di ogni preparazione per evitare di combinarne uno buono con un cattivo. I metodi RNA-seq stanno diventando più sensibili e le nuove tecnologie PCR promettono una sensibilità maggiore rispetto a quelle attuali. Pertanto, sarà richiesto meno RNA da meno corpi cellulari neuronali, consentendo una maggiore profondità di sequenziamento e una convalida più completa di colpi interessanti. D'altra parte, la piena aderenza alle raccomandazioni MIQE per l'analisi e la convalida qRT-PCR4 può richiedere quantità maggiori per consentire le reazioni di controllo necessarie per gli RNA a bassa abbondanza.
La figura 2 mostra una serie tipica di immagini di una porzione di sezione del corno ventrale del midollo spinale dopo la colorazione e la dissezione di Azure B. Nel pannello A, i corpi cellulari grandi e macchiati di scuro sono motoneuroni, confermati dalla colorazione2degli anticorpi anti-Chat , e sono facilmente differenziabili dalle cellule vicine più piccole. Il pannello B mostra la stessa regione con i singoli corpi cellulari delineati con la penna luminosa e numerati dal software del microscopio. I contorni seguono da vicino i margini dei corpi cellulari, con una piccola tolleranza per la larghezza di taglio del laser. Questa spaziatura deve essere determinata per ogni impostazione di potenza laser per ridurre al minimo l'inclusione di materiale estraneo evitando la perdita di citosolo del motoneurone. I pannelli C e D mostrano la sezione dopo che il laser ha tagliato e i singoli corpi cellulari sono caduti nel cappuccio di raccolta. Si noti che il margine di taglio non segue esattamente il contorno della penna leggera nel pannello C, ma rimane in gran parte al di fuori di esso. Questa irregolarità è evidente nel pannello D, così come l'area oscurata intorno ad ogni taglio, che riflette il danno termico al tessuto causato dal laser. Per questo motivo, se due corpi cellulari sono molto vicini l'uno all'altro, è meglio delinearli per un singolo taglio, piuttosto che cercare di tagliarli separatamente e perdere un po 'di RNA per danneggiare il calore nella loro regione di contatto ravvicinato.
La figura 3 mostra i risultati tipici di un'analisi elettroforetica dell'integrità dell'RNA di un campione di RNA preparato da ~4.000 corpi cellulari del motoneurone del topo raccolti dall'LMD. Il pannello superiore è l'elettroferogramma prodotto da 1 μl dell'RNA totale; l'inserto a destra è un'immagine del gel. In entrambi, si notano i picchi di RNA ribosomiale prominente. Il pannello inferiore è l'elettroferogramma della corsia contenente gli standard di dimensione dell'RNA. Il software di analisi ha calcolato un RIN di 9,8 per questo campione, con una concentrazione di 4,9 ng/μl. Un totale di 13 μl di questa soluzione era disponibile dopo l'analisi, fornendo 64 ng di RNA per la convalida qRT-PCR a valle degli importi di trascrizione. Per una tipica analisi qRT-PCR di trascrizioni moderatamente abbondanti, 0,15-0,20 ng di RNA totale è sufficiente per produrre una quantificazione accurata2, quindi la quantità di RNA disponibile da questa preparazione è sufficiente per convalidare un certo numero di trascrizioni con più set di primer, comeraccomandato 4. Naturalmente, grandi quantità di RNA di input possono essere utilizzate per consentire la convalida di trascrizioni rare. Questa quantità è anche più che sufficiente per consentire la preparazione della libreria e l'RNA-seq di nuova generazione.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Figura 1. Panoramica della produzione di fette del midollo spinale e della microdissezione di cattura laser dei corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale. A)Principali fasi di produzione e colorazione delle fette. B)Vista cartoon della sezione del midollo spinale e dissezione laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Figura 2. Immagini prima e dopo di una dissezione laser dei corpi cellulari dei motoneuroni macchiati di Azure B. A) Una porzione del corno ventrale di una sezione macchiata. Si notano le quattro grandi celle macchiate di scuro. Ci sono anche alcune cellule leggermente macchiate e un po ' più piccole, che non sono motoneuroni (confermati dalla colorazione degli anticorpi anti-Chat; non mostrati, ma vedi Bandyopadhyay2) e che non saranno selezionati per la dissezione. Le molte piccole macchie scure sono probabilmente processi neuronali (dendriti e assoni), ma questo non è stato confermato. B) I quattro corpi cellulari delineati con la penna leggera. Si noti che i contorni seguono da vicino i margini delle celle, con una distanza minima tra di esse. Questa spaziatura dovrebbe essere stabilita empiricamente per ogni microscopio e laser. Il software conta i singoli neuroni, il che semplifica la tenuta traccia di quanti sono stati raccolti. C e D) Dopo che il laser ha tagliato e i pezzi contenenti i corpi cellulari sono caduti nel cappuccio di raccolta. Si noti che il foro lasciato dietro è un po 'più grande del contorno ed è irregolare. Ciò riflette la larghezza del raggio laser e la sua efficienza di taglio leggermente variabile a seconda della composizione locale del tessuto. È evidente anche il bordo del tessuto oscurato che circonda ogni foro a causa dei danni al riscaldamento locale causati dal laser. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Figura 3. Analisi elettroforetica dell'integrità dell'RNA preparata da campioni LMD. A) Un'aliquota di 1 μl dell'RNA preparata da ~4.000 corpi cellulari dei motoneuroni dal protocollo precedente è stata analizzata mediante elettroforesi microcapillare su un chip microfluidica. L'elettroferogramma è mostrato, con picchi di RNA ribosomiale prominenti. A destra c'è un'immagine del gel stesso. B)Viene mostrato l'elettroferogramma degli standard di dimensione, con la corrispondente corsia di gel a destra. Il software dello strumento ha calcolato un RIN di 9,8 per questo campione e una concentrazione di 4,9 ng/μl. Fare clic qui per <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">visualizzare un'immagine più grande.</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

L'RNA totale di alta qualità è stato preparato da corpi cellulari di motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser dopo aver macchiato sezioni del midollo spinale con Azure B nel 70% di etanolo. L'RNA sufficiente (~40-60 ng) viene recuperato da 3.000-4.000 motoneuroni per consentire l'analisi dell'RNA a valle mediante RNA-seq e qRT-PCR.

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Views.  Yale School of Medicine. L'RNA totale di alta qualità è stato preparato da corpi cellulari di motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser dopo aver macchiato sezioni del midollo spinale con Azure B nel 70% di etanolo. L'RNA sufficiente (~40-60 ng) viene recuperato da 3.000-4.000 motoneuroni per consentire l'analisi dell'RNA a valle mediante RNA-seq e qRT-PCR.

Video: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

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Neuroscienze

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Comprendere le risposte dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Autore in primo piano: Avanzamento della stimolazione del midollo spinale - Esplorazione delle risposte cellulari dei motoneuroni attraverso l'elettrofisiologia del patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...