Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio, e Virginia Espina, il Dott. Emanuel Petricoin e il Dr. Lance Liotta per l&#39;assistenza con LCM. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e la George Mason University Provost Ufficio s (EPRI).

Commenti generali sul LCM di Drosophila periferiche neuroni Lasciare da 6 ore, fino a una settimana o più per LCM a seconda del tipo di tessuto e il numero di cellule necessario. Tutte le procedure vengono svolte in stretto RNasi-free seguenti condizioni procedure standard. Le larve che ha espresso 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP o PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP giornalista linee transgeniche sono state usate per questi esperimenti. 1. Preparare le larve <ol><li> Raccogliere 30-40 pari età larve terzo instar e lavarli in DDH 2 O seguito da risciacqui breve RNAse Away (Sigma-Aldrich), e un lavaggio finale in DDH 2 O per rimuovere RNAse Away. Wick l&#39;eccesso DDH 2 O completamente con un Kimwipe pulito prima di incorporare le larve in ottobre </li><li> Prendere un pulito stampo embedding dei tessuti e lo strato con un sottile (1,5-2mm) strato di ottobre, appena sufficiente per coprire un singolo strato di larve. </li><li> Prima di incorporare le larve, se necessario, raffreddare il ottobre a 0 ° C in formelle del tessuto. A tale scopo, ponendo lo stampo contenente ottobre su un blocco di ghiaccio. Ciò contribuirà a ridurre il movimento delle larve durante il processo di incorporamento. </li><li> Posizionare le larve pulito sul pre-raffreddata ottobre e disporle in parallelo l&#39;uno all&#39;altro. Una volta che le larve sono state disposte, lentamente, riempire lo stampo con OCT senza disturbare la disposizione larvale. Snap congelare lo stampo ponendolo su un blocco di ghiaccio secco. [Punto Critico:. Snap-congelare le larve immediatamente per ridurre il movimento] Questo metodo permette alle larve di essere in un unico piano, massimizzando il numero di cellule disponibili per sezione per la cattura. </li></ol> Se è necessario per preservare la morfologia dei tessuti per identificare le cellule di interesse, o se il numero previsto di cellule per sezione è risultato essere soddisfacente quindi procedere direttamente al passaggio 11. In alternativa, se le cellule sono etichettati in modo specifico e può essere identificato con un marcatore facilmente identificabile come GFP o RFP, ma il numero di cellule per sezione si trova ad essere bassi, Piazza di Maggio 05-10 poi essere utile per aumentare il numero di cellule disponibili per l&#39;acquisizione di ogni sezione. Si tratta di passi opzionali e devono essere considerati solo se necessario, come metodo per aumentare il numero di neuroni da LCM disponibili per ogni sezione quando l&#39;altro metodo non riesce a fornire risultati favorevoli. [Attenzione: questo metodo possono turbare la morfologia generale del tessuto e rendono l&#39;identificazione dei tessuti sulla base di specifici localizzazione spaziale molto difficile.] <ol start="5"><li> Lavare 50-70 larve terzo instar come descritto al punto 1. Mettere le larve in un tubo da microcentrifuga 1,5 ml contenente 500 ml di RNasi libero PBS 1X. </li><li> Dounce le larve con un pestello in polipropilene (USA scientifico), con 6-7 colpi lenti potenti. </li><li> Centrifugare la soluzione a 16.000 (x) g per 5-10 secondi (fino a quando le cuticole larvali stabilirsi sul fondo della provetta da microcentrifuga]. Scartare il sopranatante. Il pellet deve essere principalmente costituito da cuticola larvale a cui il PNS, compresi i neuroni da , è strettamente aderito. </li><li> Lavare la cuticola pellet 2-3 volte in PBS 1X e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS 1X. Spin la soluzione a 16.000 (x) g per 1 minuto a formare un compatto pellet. Aspirare il surnatante completamente con una multa pipetta Pasteur. </li><li> Rimuovere con attenzione il pellet dal tubo microcentrifuga con una spatola pulita e stoppino l&#39;eccesso di PBS con un tessuto pulito Kimwipe. [Nota: è importante mantenere il pellet il più compatto possibile per aumentare il rendimento delle cellule]. Posizionare il compatto cuticola pellet su uno stampo di plastica contenente un sottile strato di ottobre (circa 1mm). </li><li> Allargare delicatamente il pellet in una zona sottile circolare. Riempire lo stampo con ottobre, e congelare i tessuti, come descritto al punto 4. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare sezioni congelate a 5-8 micron di spessore normale, etichettato, senza accusa, lastre di vetro libero microscopio RNAsi. [Fase critica: Posizionare le sezioni di tessuto vicino al centro della diapositiva.] </li><li> Conservare le diapositive direttamente su ghiaccio secco o a -80 ° C in un ambiente pulito slide-box fino al momento microdissezione. LCM eseguire preferibilmente entro una settimana dopo il sezionamento dei tessuti. </li></ol> PAUSA PUNTO 2. Rimozione disidratazione e cuticola da congelati sezioni larvali [Punto Critico: Tutte le soluzioni per la disidratazione deve essere preparato fresco prima di ogni sessione LCM. Disidratazione completa di sezioni di tessuto congelato larvale è essenziale per raggiungere l&#39;efficienza ottimale microdissezione] <ol><li> Rimuovere i vetrini contenenti le sezioni congelate di tessuto larvale dal freezer ° -80 C e disporli sul ghiaccio secco. </li><li> Rimuovere una singola diapositiva da ghiaccio secco e subito posto direttamentein una provetta da 50 ml conica riempita con fissativo etanolo al 70%, seguito da un breve risciacquo in RNasi libero DDH 2 O secondo i tempi indicati nella tabella 1. </li><li> La presenza della cuticola larvale nelle sezioni congelate può compromettere l&#39;efficienza di cattura, impedendo efficiente LCM cap-cellula contatto che può portare a non specifici di cattura. Se necessario, effettuare le seguenti operazioni (4-5) per eliminare la cuticola da sezioni di tessuto. </li><li> Delicatamente pipetta 50 ml di 2,5% tripsina direttamente sul sezioni di tessuto e incubare per 5-30 secondi a temperatura ambiente. [Punto Critico: Questa fase può richiedere di ottimizzazione. Il tempo di incubazione dipende dal tessuto da microdissezionate e lo spessore della sezione. Più lungo di incubazione può cancellare tutto comprese le cellule di interesse, mentre una breve incubazione può essere insufficiente a rimuovere la cuticola] </li><li> Sciacquare le sezioni brevemente in un tubo da 50 ml conica contenente RNasi-free DDH 2 O per rimuovere tripsina, e frammenti di cuticola liberamente aderito. </li><li> Immergere i vetrini in sequenza in ciascuno dei rimanenti etanolo e xilene soluzioni per i tempi consigliati (Tabella 1) per completare il processo di disidratazione. </li><li> Seguendo il gradiente di disidratazione, le diapositive sono brevemente secco sotto flusso di aria mite per 60-120 secondi a temperatura ambiente prima di eseguire LCM. [Attenzione: Secco lo xilene completamente dalle sezioni di tessuto prima di eseguire LCM. Lo xilene è noto per sciogliere la calotta LCM polimero con conseguente fallimento microdissezione]. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 70% di etanolo (fissativo) </td><td> 3-10 secondi </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 5-10 secondi </td></tr><tr><td> Tripsina incubazione 2,5% </td><td> 5-30 secondi </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 5-10 secondi </td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td><td> 60 secondi </td></tr><tr><td> 95% di etanolo </td><td> 60 secondi </td></tr><tr><td> 100% di etanolo </td><td> 120 secondi </td></tr><tr><td> 100% di etanolo </td><td> 120 secondi </td></tr><tr><td> 100% Xilene </td><td> 120 secondi </td></tr><tr><td> 100% Xilene </td><td> 120 secondi </td></tr><tr><td> Aria secca in un flusso di aria mite </td><td> 60-120 secondi </td></tr></tbody></table> Tabella 1: procedura raccomandata per la disidratazione LCM di sezioni di tessuto congelato larvale. 3. Laser Capture Microdissezione PixCell IIe strumento LCM dotato di Fluor 300 epifluorescenza ottica ottimizzata per EGFP è stato utilizzato per eseguire il LCM. [Fase critica: se possibile, effettuare la microdissezione in una umidità controllata spazio per evitare una riduzione in termini di efficienza microdissezione a causa di un aumento dell&#39;umidità. L&#39;umidità della stanza è un fattore critico influenzano l&#39;efficienza microdissezione. Camera bassa umidità può causare un aumento statico-si aggrappano con conseguente non specifici cattura, mentre la camera alta umidità può provocare in termini di efficienza microdissezione bassa. Abbiamo raggiunto la massima efficienza LCM tra il 25-50% di umidità relativa.] <ol><li> Accendere il microscopio e per il controllo casella di laser. </li><li> Caricare il tappo di montaggio CapSure titolare con HS LCM tappi (Molecular Devices): Due cartucce di tappi LCM possono essere caricati in una sola volta. </li><li> Aprire il software Molecular Devices e inserire i dettagli dell&#39;esperimento, comprese numero di diapositiva e numero di lotto Cap. </li><li> Caricare una nuova HS tappo LCM dalla cartuccia sullo strumento PixCell IIe LCM e posizionarlo correttamente con riguardo al joystick per garantire il corretto posizionamento del tappo in relazione alla zona di cattura. </li><li> Posizionare il vetrino contenente appena disidratato sezioni di tessuto larvale sul palco microscopio per microdissezione. </li><li> Individuare le cellule marcate utilizzando il oculari o lo schermo del computer. A causa della elevata specificità di PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP linea giornalista transgenico, la classe IV da neuroni possono essere facilmente identificati da GFP fluorescenza. </li><li> Oggetto del tessuto di LCM con CapSure HS LCM tappi [per una serie dettagliata di istruzioni per la configurazione dello strumento, focalizzando il laser e l&#39;esecuzione di LCM vedi riferimento 22]. </li><li> Regolare il &quot;Power&quot; e &quot;Durata&quot; i parametri degli impulsi laser per ottenere un punto preciso polimero fuso, le cui dimensioni corrispondono alle dimensioni selezionate spot laser. Regolare le impostazioni per personalizzare le dimensioni del polimero fuso zona. I seguenti parametri sono stati usati per microdissecting singola classe IV da neuroni: diametro spot 7,5 micron, la resistenza laser 30-50 mW, il tempo di laser e 2-4 e 1-2 ms scotta per cella sono stati utilizzati. [Fase critica: i parametri laser necessari per un posto giusto può variare con lo spessore del tessuto e le condizioni di umidità ambiente. Regolare il &quot;Power&quot; e &quot;Durata&quot; le impostazioni per ottenere la necessaria dimensione del punto polimero fuso per microdissecting cellule singole o multiple.] </li><li> Per massimizzare la specificità, microdissect cellule con sovrapposizione minima e una forte fluorescenza. Ogni cuffia è in grado di catturare numerosi corpi cellulari. [Fase critica: per evitare la degradazione dell&#39;RNA, limitare il tempo totale di analisi tra cui la disidratazione e microdissezione a meno di 45 minuti] </li><li> Una volta che tutte le cellule di interesse sono stati catturati, sollevare il coperchio HS LCM con le cellule microdissezionate e lo mise su un vetrino pulito per confermare la presenza delle cellule catturato e ispezionare visivamente il tappo per la presenza di cellule indesiderate o detriti. </li></ol> 4. Isolamento dell&#39;RNA da LCM cellule derivate <ol><li> Fissare il tappo che contiene le cellule microdissezionate ad un ExtracSure (Molecular Devices) del dispositivo. Aggiungere 12μl di RNA tampone (PicoPure, Molecular Devices) per la superficie del cappello che contiene le cellule e collegare un invertito a parete sottile tubo di reazione (GeneAmp, Applied Biosystems) al dispositivo ExtracSure. Posizionare il gruppo su un vassoio di allineamento (Molecular Devices) e coprire con un blocco di incubazione (Molecular Devices) pre-riscaldato a 42 ° C all&#39;interno di un incubatore. </li><li> A seguito di una incubazione di 30 minuti, centrifugare le provette contenenti gli estratti a 800 (x) g per 2 minuti. Chiudere i tubi e conservare il estratti cellulari a -80 ° C fino al momento per la purificazione di RNA. </li></ol> PAUSA PUNTO <ol start="3"><li> Estrarre e purificare l&#39;RNA colonna in base alla PicoPure (Molecular Devices) Istruzioni kit di estrazione di RNA. DNAsi trattamento è facoltativo, e può essere eseguita su colonna durante la purificazione dell&#39;RNA, se necessario. Se necessario, i campioni di LCM multiple possono essere raggruppate durante la purificazione in una sola colonna per aumentare la resa finale di RNA e può essere eluiti in un piccolo volume (11-30 mL) di tampone di eluizione (PicoPure, Molecular Devices) e conservati a -80 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. Se lo si desidera un 1 microlitri aliquota può essere utilizzato per valutare la qualità totale RNA su un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Rappresentante Risultati Microdissezione laser capture (LCM) è stato utilizzato per isolare singole, specifiche della classe o più neuroni da Drosophila dalla terza larve instar (Figura 1). LCM consente un elevato grado di precisione e specificità nell&#39;isolamento della Drosophila da corpi cellulari dei neuroni (Figura 2a-c). Inoltre, l&#39;RNA totale purificato da questi neuroni isolati da è risultata essere di ottima qualità, come indicato dalla presenza di forte 5.8S, 18S e 28S picchi di RNA ribosomiale se analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) (Figura 2d). Per valutare l&#39;neuronali specifici per l&#39;arricchimento delle nostre cellule isolate abbiamo eseguito in tempo reale quantitativo PCR di trascrizione inversa (QRT-PCR) utilizzando il neuronale gene specifico marcatore, ELAV. Per la qRT-PCR analisi, abbiamo calcolato i livelli relativi di espressione ELAV nel LCM microdissezionate neuroni e normalizzato da questa espressione a quella del nostro controllo endogeno (rp49) e relativi a RNA totale isolato da larve di tutto con il metodo ΔΔCt 23. Queste analisi hanno rivelato l&#39;arricchimento oltre 2,5 volte nei livelli relativi di ELAV in LCM micro-sezionato da campioni neurone rispetto agli animali interi (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: LCM di Drosophila neuroni periferici. (A) Età abbinati larve terzo instar vengono selezionate, lavate e (b) incorporato in un cryomold con OCT e congelati a -80 ° C, (c) 8μm sezioni di tessuto di serie sono creati usando un criostato standard e (d) sono collocati in modo uniforme su lastre di vetro pulito. I vetrini con le sezioni di tessuto apposto sono conservati a -80 ° C prima di LCM di elaborazione. (E, f) che precede immediatamente LCM, le sezioni di tessuto sono scongelati e brevemente fissato in etanolo al 70% seguita da risciacquo breve DDH 2 O. (g) Le diapositive sono brevemente incubati con tripsina e risciacquati con DDH 2 O per rimuovere le cuticole (nero) dalle sezioni larvale. (h, i) sezioni di tessuto senza cuticola larvale sono poi ulteriormente disidratato in un gradiente di etanolo e, infine, eliminato in xilene . (j) Il tappo LCM con un polimero termolabili è posto sulla sezione di tessuto e il laser pulsato è sul corpo selezionato cellule fluorescenti. L&#39;impulso laser si scioglie il polimero e avvolge il corpo selezionato di celle. Il tappo polimero, insieme al corpo cellulare catturato viene sollevato, e (k) </strong&gt; tampone di estrazione RNA è aggiunto alla cella. La cella catturato, insieme con il tampone di estrazione di RNA viene incubata a 42 ° C per 30 minuti e possono essere conservati a -80 ° C, o direttamente elaborati per la purificazione di RNA. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: LCM facilita la cattura di alta precisione di neuroni da. (A) l&#39;immagine di un rappresentante disidratati e tripsina trattati 8 micron sezione di tessuto prima di LCM spettacolo, che mostra due classi IV neuroni da etichettati con GFP dal PPK-GAL4, UASmCD8:: ceppo giornalista GFP. Nota, uno dei neuroni è evidenziato (punta di freccia) per l&#39;acquisizione. (B) corpo cellulare del neurone evidenziato (freccia) è pulito micro-sezionato con elevata specificità dalla sezione di tessuto. (C) End-on vista di una sola classe -IV da neurone catturato sul tappo LCM. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) elettroferogramma di RNA totale isolato da LCM neuroni derivati ​​da, mostrando ottime qualità dell&#39;RNA, come indicato dalla presenza di 5.8S taglienti, 18S , e picchi di rRNA 28S. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. QRT-PCR rivela arricchimento sostanziale di espressione neuronale gene marcatore in LCM catturato da neuroni rispetto alla intero animale qRT-PCR analisi di neuroni specifici per l&#39;espressione del gene marcatore (ELAV) in LCM catturato da neuroni (21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP) e animali interi in età corrispondente larve terzo instar è stata eseguita in triplice copia. Livelli relativi di espressione ELAV in LCM catturati da neuroni sono stati normalizzati al controllo endogeno (rp49) e relativi alle larve tutto con il metodo ΔΔCt 23. Un arricchimento 2,5 volte nei livelli relativi di ELAV in LCM catturato da campioni neurone è stato osservato rispetto ai animali interi. Risoluzione dei problemi Problema: degrado, o di bassa qualità RNA. Garantire condizioni di libera RNAse tutto esperimento. Provare a ridurre quantità di tempo speso per LCM per diapositiva a 30 minuti. Tenere le diapositive e campioni in ghiaccio secco, tranne quando si eseguono LCM. Evitare di scongelare le sezioni di tessuto, una volta che vengono tagliati. Problema: La maggior parte delle cellule sono persi dalla diapositiva durante il trattamento con tripsina (passo 17-18). Provare a ridurre il tempo di trattamento tripsina. Provare a ridurre la concentrazione di tripsina. Problema: Presenza di cuticola e altri non specifici frammenti di tessuto sul polimero cap. Prova a rimuovere i frammenti di tessuto tamponando la superficie polimerica con il lato cattivo gusto di una nota adesiva 22. Problema: bassa efficienza LCM. Prova ad aumentare il tempo di incubazione in 100% di etanolo e xilene. Ridurre l&#39;umidità ambiente utilizzando deumidificatori.

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USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato nel presente documento descrive il nostro metodo ottimizzato per l&#39;isolamento dei neuroni Drosophila periferiche mediante LCM. Anche se questo protocollo LCM è stato progettato per l&#39;isolamento specifico di singole, specifiche della classe o più neuroni da Drosophila dal terzo stadio larvale instar di sviluppo, piccole modifiche del protocollo può essere facilmente adattato per la cattura di altri tipi di cellule di Drosophila da ogni sviluppo fasi distinte ...

Attrezzatura: <ul><li> Criostato </li><li> Tubo da 50 ml per la fissazione di diapositive, il risciacquo, il trattamento tripsina e l&#39;etanolo / disidratazione xilene </li><li> -80 ° C congelatore </li><li> Incubatrice </li><li> PixCell IIe strumento LCM con Fluor 300 ottica epifluorescenza ottimizzato per EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

laser capture microdissection of drosophila peripheral neurons

L&#39;arborizzazione dendritica (bis) i neuroni del sistema nervoso periferico Drosophila (PNS) forniscono un eccellente sistema modello in cui studiare i meccanismi molecolari alla base specifiche della classe 1,2 morfogenesi dendrite. Per facilitare l&#39;analisi molecolare di specifiche della classe da neurone sviluppo, è vitale per ottenere queste cellule in una popolazione pura. Anche se una serie di cellule diverse, e tessuto-specifica delle tecniche di isolamento dell&#39;RNA esistono per le cellule di Drosophila, compresi magnetico purificazione tallone cellula base 3,4, Fluorescente cell sorting attivato (FACS) 5-8, e le proteine ​​RNA binding strategie basate 9, nessuno dei questi metodi possono essere facilmente utilizzati per isolare una o più specifiche della classe Drosophila da neuroni con un alto grado di precisione spaziale. Microdissezione cattura laser (LCM) è emerso come uno strumento estremamente potente che può essere utilizzato per isolare specifici tipi cellulari da sezioni di tessuto con un alto grado di risoluzione spaziale e di precisione. RNA ottenuti da cellule isolate possono poi essere utilizzati per le analisi incluse qRT-PCR e microarray il profilo di espressione all&#39;interno di un dato tipo di cellula 10-16. Fino ad oggi, LCM non è stato ampiamente applicate all&#39;analisi dei tessuti e delle cellule di Drosophila 17,18, compresi i neuroni da al terzo stadio larvale instar di sviluppo. Qui vi presentiamo il nostro protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento di Drosophila neuroni da utilizzare la porta a infrarossi (IR) classe di LCM. Questo metodo consente la cattura di singoli, i neuroni specifiche della classe o da più con alta specificità e risoluzione spaziale. Di pari età larve terzo instar esprimendo un UAS-mCD8:: GFP 19 transgene sotto il controllo sia della classe IV da neurone specifico ppk-GAL4 20 driver o il pan-da neurone specifico 21-7-21 GAL4 autista sono stati utilizzati per questi esperimenti. RNA ottenuto dal neuroni isolati da è di qualità molto elevata e possono essere direttamente utilizzate per applicazioni a valle, tra cui qRT-PCR o analisi di microarray. Inoltre, questo protocollo LCM può essere facilmente adattato per catturare altri tipi di cellule di Drosophila uno diverse fasi di sviluppo dipende dal tipo di cellule specifiche, GAL4-driven pattern di espressione di GFP.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per isolare singoli o multipli<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni da dalla terza larve instar utilizzando la cattura a infrarossi (IR) classe di Microdissection Capture laser (LCM). RNA ottenuto dal neuroni isolati può essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle compresa qRT-PCR o analisi di microarray.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

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JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

13.4K Views.  George Mason University. In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per isolare singoli o multipli Drosophila Neuroni da dalla terza larve instar utilizzando la cattura a infrarossi (IR) classe di Microdissection Capture laser (LCM). RNA ottenuto dal neuroni isolati può essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle compresa qRT-PCR o analisi di microarray.

Video: Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Ricerca

Neuroscienze

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione