L'eterogeneità delle strutture scheletriche è un ostacolo nello studio dell'espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Questo protocollo fornisce un metodo per l'isolamento preciso di tessuti adiacenti ma diversi. Ottimizziamo la microdisezione di cattura laser per la cartilagine e l'osso utilizzando la colorazione viola cresile per visualizzare questi tessuti per una raccolta precisa mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per analisi successive.
Altri tessuti possono essere isolati se il viola cresile fornisce una distinzione sufficiente del tessuto bersaglio e la qualità dell'RNA rimane elevata dopo il nostro metodo di lavorazione. Tali tessuti includono suture craniofacciali e cervello. La criosezione è l'abilità più esigente in questo protocollo.
Assicurarsi che il tessuto sia sezionato e incorporato rapidamente per mantenere la massima integrità dell'RNA. Per iniziare questa procedura, sezionare l'embrione o il tessuto di interesse. Incorporare il campione in uno stampo di incorporamento monouso con un composto ottimale della temperatura di taglio e regolare l'orientamento del campione con una punta o un ago.
Congelare rapidamente i campioni in un ghiaccio secco e in un bagno di metil-2-butene. Successivamente, preparare un contenitore lidded con ghiaccio secco posizionando un foglio di foglio di alluminio sul ghiaccio secco per la conservazione temporanea di diapositive campione di dissezione durante la criosezione. Trasferire l'esemplare fresco congelato nel secchio di ghiaccio secco.
Posizionare uno strato di composto di temperatura di taglio ottimale su un supporto per campioni criostato e posizionare immediatamente il campione sopra il composto ottimale della temperatura di taglio con una pressione delicata. Quando il composto ottimale della temperatura di taglio è completamente congelato, fissare il supporto con il campione nel braccio di taglio del criostato. Lasciare il campione nel criostato per 15 minuti per equilibrarlo alla temperatura di taglio.
Quindi, sezionare il tessuto con uno spessore di 12 micrometri e raccogliere le fette sui vetrini a membrana PEN. Allineare sezioni consecutive sulla membrana. Una volta completato lo scivolo, lasciare asciugare le sezioni per alcuni minuti, quindi trasferire lo scivolo sulla lamina nel contenitore di ghiaccio secco fino a quando non vengono raccolti tutti gli scivoli richiesti.
Archiviare le diapositive a meno 80 gradi Celsius in una casella di diapositive. Per iniziare, preparare tre tubi di centrifuga da 15 millilitri etichettati. Aggiungere 45 millilitri di 80% di etanolo a ciascun tubo.
Metti tre tubi sul ghiaccio. Posizionare un tubo contenente 45 millilitri di etanolo al 95% e un tubo contenente 100% di etanolo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 45 millilitri di xilene a un tubo di centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente.
Scongelare brevemente uno scivolo a membrana PEN posizionandolo contro una mano guantata e lavarlo due volte per 30 secondi in ciascuno dei tubi contenenti 80% di etanolo con agitazione per rimuovere il composto ottimale della temperatura di taglio. Quindi, posare lo scivolo su un foglio di foglio di alluminio. Pipetta 8 millilitri di 1%viola cresile e 50% di etanolo sullo scivolo e macchia per 30 secondi.
Lavare lo scivolo nel terzo tubo contenente l'80%di etanolo per 30 secondi. Disidratare lo scivolo passandolo attraverso il tubo contenente il 95% di etanolo per 30 secondi, il tubo contenente 100%etanolo per 30 secondi e, infine, il tubo contenente xilene per 30 secondi. Successivamente, posizionare le diapositive su un delicato tergicristallo per cinque minuti per lasciare scolare lo xilene e lasciare asciugare le sezioni.
In primo luogo, accendere il microscopio a microdisezione di cattura laser, il laser e il computer. Accedere al computer e avviare il software. Quando la luce verde è attiva, premere il pulsante rosso per attivare il laser.
Quando la luce diventa rossa, il laser è pronto per l'uso. Inserire il cappuccio di un tubo PCR da 5 millilitri nel raccoglitore. Pipettare 50 microlitri di tampone di estrazione nel tappo e inserire il dispositivo di raccolta al microscopio.
Nella finestra del dispositivo raccoglitore di modifiche, fate clic sul pulsante Sposta al punto di riferimento per spostare il raccoglitore nel punto di riferimento. Regolare lo stato attivo per visualizzare chiaramente il punto di riferimento. Fare quindi clic sul pulsante di scaricamento a sinistra sulla barra degli strumenti per abbassare il supporto della diapositiva.
Posizionare lo scivolo nel supporto con la sezione tissutale rivolta verso il basso e inserire di nuovo il supporto nel palco. Fare clic su continua nella finestra cambia campione. Per impostare i parametri laser, selezionare l'opzione di controllo del menu laser o fare clic sull'icona del laser.
Regola i seguenti parametri come desiderato, la potenza, che è la potenza del laser, l'apertura, che è la larghezza del laser, e la velocità, che è la velocità di taglio in modalità di disegno e taglio. Inizia con un obiettivo 5X per trovare le aree di interesse e passa all'obiettivo che meglio mostra l'area di interesse. Scegliete il tubo per la raccolta facendo clic sul segno nel raccoglitore, quindi scegliete spostarlo e tagliarlo o disegnarlo e tagliarlo.
Una volta completato il taglio, il tessuto bersaglio con membrana PEN cadrà nel tappo del tubo di raccolta per gravità. Ripetere questo processo di selezione e taglio per estrarre più aree di interesse, se necessario. Successivamente, scaricare il collettore e chiudere con cura il tubo PCR.
Posizionare i tessuti microssacsecati sul ghiaccio secco. Scongelare i tessuti microsacrati a temperatura ambiente, quindi centrifugare brevemente e incubare i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, ruotare il tampone dilisi nel tubo PCR da 5 millilitri.
Eseguire il trattamento della DNasi e l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, seguendo le istruzioni del produttore. In questo studio viene eseguita una microdissezione ottimizzata di cattura laser della cartilagine e dell'osso, evidenziando l'uso della colorazione viola cresile in una procedura rapida per visualizzare cartilagine e ossa per una precisa raccolta dei tessuti mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per analisi successive. L'osservazione delle diapositive mostra che tutte le cartilagine esaminate sono magenta macchiate e tutti i tessuti mineralizzati sono macchiati di marrone o nero.
Sia la cartilagine che l'osso si distinguono facilmente dagli altri tessuti in più siti anatomici. Cartilagine di Meckel, cartilagine condilare e regioni ossee mandibolari sono selezionate e isolate dalla microdisezione di cattura laser. Per ottenere RNA sufficiente per il sequenziamento, tirare 10 regioni della Cartilagine di Meckel, 10 regioni di cartilagine condilare o quattro regioni di osso mandibolare rispettivamente in tre singoli tubi di raccolta.
L'RNA viene quindi estratto e l'RNA totale viene analizzato utilizzando un bioanalizzatore. Questo protocollo di microdisezione di cattura laser viene utilizzato su vari tessuti in diversi stadi di sviluppo e le misurazioni del numero di integrità dell'RNA indicano un'alta qualità dell'RNA. Viene quindi eseguita l'analisi dell'espressione genica differenziale.
Ci sono 4.006 geni espressi in modo significativo e diverso tra l'osso mandibolare e la Cartilagine di Meckel. I geni specifici degli osteoblasti o degli osteociti sono più espressi nell'osso mandibolare mentre i geni specifici dei condrociti sono più espressi nella Cartilagine di Meckel. Inoltre, i marcatori osteoclasti sono più espressi nell'osso mandibolare, indicando un isolamento riuscito dei tessuti mirati.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'analisi dell'espressione genica, inclusi qPCR e RNA-seq. Questi metodi possono analizzare l'espressione genica del trascrittoma in tessuti specifici o regioni di interesse all'interno di tessuti eterogenei.
