Tutti gli autori riconoscono il supporto infrastrutturale del NHMRC CTC, Università di Sydney, la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), l&#39;Australia e la Cooper Fondazione Rebecca, Australia. Questa ricerca è stata finanziata attraverso sovvenzioni dal Consiglio australiano Research (FT110100254) e la JDRF, Australia (CRN201314) per AAH WW, RJF e MVJ effettuato tutto bagnato laboratorio di sperimentazione, ASJ effettuata l&#39;analisi dei dati. WW ha scritto la prima bozza. AAH pianificato lo studio e analizzato i dati. Tutti gli autori hanno letto e hanno concordato la versione finale del manoscritto, figure e fogli di lavoro presentati per la pubblicazione.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Articolo costi di trasformazione / pubblicazione sono stati coperti da Life Technologies, dopo l&#39;accettazione di questo manoscritto per la pubblicazione.

Le fasi critiche all&#39;interno dei protocolli qPCR sonda-based per ottenere risultati accurati e riproducibili sono per assicurarsi che 1) lo stesso volume e la concentrazione di RT-prodotto viene caricato in ogni reazione qPCR, 2) i rapporti ei volumi corretti dei componenti necessari per reazione qPCR sono preparati e ben mescolato, 3) i volumi corretti e coerenti vengono aggiunti ogni reazione qPCR, e 4) la preparazione e caricamento di ogni campione e reazione mix è completato nel più breve lasso di tempo possibile, mentre ancora memore di i punti critici di cui sopra in precedenza. Le schede matrice microfluidica bisogno adatto centrifuga e secchi specifici. Ogni secchio può contenere fino a 3 schede (caricato / vuoto). Verificare sempre che tutti e 3 gli slot di un secchio sono occupati e il secchio è bilanciato mettendo bucket simile (questo secchio dovrebbe contenere anche 3 carte, vuote o piene) nella fessura opposta della centrifuga. Pur ponendo la scheda nel buckeSupporto t, accertarsi che le 8 serbatoi proiettano verso l&#39;alto e pozzetti di reazione di fronte la parete esterna di centrifuga. Spin carte a 331 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Dopo il primo giro, aprire la centrifuga e verificare visivamente la miscela di reazione è stato erogato attraverso i 384 pozzi. Ripetere il lancio a stesse impostazioni per 1 più tempo. Rimuovere la carta dal secchio e garantire che il livello della miscela di reazione in ciascuna delle 8 serbatoi è uniforme. Eventuali incoerenze nei volumi di liquido lasciato nei serbatoi rendono la scheda inappropriato utilizzare ulteriormente. Per avere la stessa concentrazione del RT-prodotto, stessa concentrazione di ingresso di RNA viene aggiunto in ciascuna reazione RT. La concentrazione di RNA totale viene misurata usando un micro-volumespectrophotometer. Il 260/280 rapporto osservato può essere a partire da 1.3 per l&#39;RNA isolato da plasma / siero; questo non sembra avere un effetto sul downstream processo qPCR correlati o dati generati 30. Analogamente, il rapporto di 260/280i campioni di RNA qui testati sono stati tra 1,3-1,7 senza effetti anomali nel qPCR osservati. Quando si utilizzano campioni a basso contenuto di RNA, come quelli di biofluidi, può essere difficile quantificare RNA prima dell&#39;elaborazione. Si consiglia l&#39;uso del sintetico spike-in presso l&#39;isolamento di RNA e le fasi di trascrizione inversa. Nella nostra esperienza, i candidati Arabidopsis thaliana miRNA (ATH-miR-159A e ath-miR-172 bis) è preferito su Caenorhabditis elegans miRNA (come CEL-miR-39 o cel-miR-54), che nella nostra esperienza può avere maggiore omologia di quelli A. thaliana. L&#39;uso di tale picco-in specifici per fase può spiegare la normalizzazione dei dati miRNA su più campioni analizzati in tempi diversi. Utilizzando un volume d&#39;ingresso fisso di RNA per reazione di sintesi cDNA è anche raccomandato 32,33. I tre protocolli sonda-based per miRNA quantificazione descritte richiedono quantità variabilidell&#39;ingresso RNA totale, diversi flussi di lavoro e costi. Ciascuno dei flussi di lavoro sono progettati per soddisfare diverse throughput in base al numero di bersagli miRNA e il numero di campioni da analizzare. Con l&#39;aumento della velocità (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), il costo per reazione diminuisce con un aumento della quantità di dati ottenuti in una unità di tempo. Poiché tutte queste piattaforme TaqMan utilizzano la chimica, la qualità dei dati ottenuti si può aspettare che sia simile. TaqMan qPCR è un metodo consolidato per identificare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di siero / plasma 9,11,27. Anche se i tre piattaforme discussi qui condividono la stessa chimica, una diminuzione del volume di reazione porta ad una diminuzione della gamma dinamica di rilevamento trascrizione (Farr RJ et al., Dati non pubblicati). La piattaforma qPCR 96-bene è un rendimento più basso, ma la piattaforma alta sensibilità e, a nostro avviso, il &quot;gold standard&quot; per tutti i probe-based (o la tintura a base) piattaforme PCR. Tuttavia, questo puònon essere la piattaforma più economico o efficiente se diverse centinaia o migliaia di campioni vengono analizzati e per più microRNA. Microfluidics (TLDA) e nanofluidica piattaforme (OA) sono piattaforme high-throughput / contenuti progettate per consentire l&#39;acquisizione di dati più grandi in un tempo più breve. Anche se le differenze lotti sono state osservate nelle carte TLDA, questo può essere minimizzato richiedendo carte TLDA dallo stesso lotto. Osserviamo che la piattaforma TLDA (Figura 3) ha mostrato variazioni significative nel 17% dei media - miRNA bassa abbondanza durante il test con lo stesso campione in diversi lotti di carte TLDA. Si consiglia pertanto di utilizzare gli stessi numeri di lotto per l&#39;analisi utilizzando carte TLDA. Questa variazione potrebbe anche essere dovuto alla variabilità tecnica, comprese eventuali potenziali errori di caricamento e di pipettamento. Tuttavia, si consiglia di ordinazione / richiesta dello stesso lotto di carte TLDA. Nessuna variazione lotto significativo è stato osservato sulla piattaforma OA. Nonostante questo, TaqMan speri baseTal qPCR avvicina offerta facilità di misurare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di plasma / siero. Gli approcci di throughput a bassa, media e alta discussi qui offrono la flessibilità necessaria per analizzare una serie di campioni e miRNA con un (a basso rumore di fondo) chimica altamente efficiente, riproducibile e pulita.

I microRNA (miRNA) sono ~ 22 nucleotidi non codificanti (nc) RNA, funzionante come regolatori dell&#39;espressione genica 1-3. La maggior parte dei miRNA negli animali funzionano attraverso specifiche-sequenza di basi accoppiamento con un mRNA, targeting 3 &#39;UTR, che porta a regolazione negativa dell&#39;espressione genica 2-4. Questo di solito avviene attraverso l&#39;inibizione della traduzione mRNA o ribosomiale drop-off. miRNA in circolazione hanno dimostrato di essere nuovi biomarcatori nella ricerca e campo clinico per una varietà di malattie, come il diabete 5-7, ovaie 8, 9 prostata e della mammella 10,11, l&#39;epatite B 12 e di altre malattie autoimmuni 13. La ricerca è stata condotta per identificare miRNA abbondanti in cellule o tessuti differenti, così come in circolazione dal plasma umano e campioni di siero, che è più accessibile e meno invasivo 9,11-15. Diversi metodi di quantificazione miRNA sono stati estituito utilizzando più piattaforme, come ad esempio la piattaforma piastra standard 96 pozzetti 4,12,16-18, la piattaforma di carta microfluidica 12,18-23 e la piattaforma nanofluidica matrice 17,24. Quantitativa real-time PCR (qPCR) offre la possibilità di misurare i numeri relativi o assoluti di trascrizioni con multipla (di coloranti o sonda-based) chimiche. Base-Probe real-time PCR chimica offre il vantaggio di sfondo bassa fluorescenza e alta sensibilità per rilevare una singola copia trascrizione. E &#39;relativamente conveniente, semplice da usare e altamente riproducibile, che lo rende un metodo preferito per quantificare e determinare miRNA 25. Metodo qPCR base-Probe prevede generalmente due fasi: trascrizione inversa (RT) e qPCR 4,26,27. RT è dove il primer stem-loop RT è ibridato ad una molecola di miRNA maturo o primario e convertito complementare (c) del DNA. La quantificazione del prodotto cDNA viene quindi effettuata utilizzando miRNA-specifici primer PCR26-28. Il principio di base di sonda qPCR è basato sul rilevamento di estensione filamento complementare in tempo reale, che comporta l&#39;idrolisi della sonda fluorescente-tag. Queste sonde sono progettate per contenere un reporter fluorescente e un quencher che sono solo parte per consentire FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Rilevamento delle emissioni dal giornalista di fluorescenza (emettitore) è mascherato dalla vicinanza della molecola quencher. Quando Taq polimerasi (pol) si estende dal primer monte e raggiunge una forcella (estremità 5 &#39;della sonda), la Taq attività esonucleasi pol idrolizza la sonda, portando ad una fisica di dissociazione / separazione dell&#39;emettitore fluorescente dal quencher. Questa versione di una singola molecola di fluorescenza emettitore è registrato dal rivelatore e presentato come un aumento incrementale nel segnale di fluorescenza da tale bene / reazione. L&#39;aumento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di prodotto di PCR generato, permettendo una accurata quantification del 26,28 bersaglio amplificato. Con l&#39;aumento della domanda in miRNA quantificazione, medio tecnologie high-throughput sono stati sviluppati per consentire a un maggior numero di campioni da elaborare in un breve lasso di tempo. TaqMan Low Density Array (TLDA) è un mezzo throughput microfluidica disegno innovativo basato su sonda basata qPCR chimica offrendo un aumento del numero di miRNA analizzati su una piastra. TLDA comporta l&#39;uso di una piscina predefinito di RT-primers utilizzati per sintetizzare il cDNA. Questi cDNA vengono poi filata in una misura 384 carta e micro-fluidico per determinare l&#39;espressione di più miRNA utilizzando qPCR 22,26,29. Ogni pozzetto della card contiene asciugato primer e sonde per amplificare specifici miRNA (s), quindi fino a 384 reazioni possono essere trasformati in carta singola TLDA 26. L&#39;array nanofluidics è una piattaforma ad alta produttività che viene utilizzato per il rilevamento di trascritti genici <sup&gt; 24 utilizzando la stessa chimica probe-based. Si utilizza una matrice proprietaria offre interazioni idrofobiche-idrofilo per facilitare il caricamento della miscela di reazione 33 nanolitri in una matrice di 3072 fori passanti su uno scivolo 24 in acciaio inossidabile. Questo articolo si concentra su che dimostra come vengono eseguiti questi metodi per quantificare miRNA nel siero / plasma ed i fattori critici che devono essere considerati quando si esegue e interpretare tali dati. Preso di conto, i loro benefici individuali e limitazioni saranno discussi in questo articolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Base-Probe PCR quantitativa (qPCR) è un metodo preferito per misurare trascrizione abbondanza, poiché è uno dei metodi di rilevamento più sensibili che fornisce un&#39;analisi accurata e riproducibile. Chimica a base-Probe offre lo sfondo minimo di fluorescenza rispetto ad altri (di tipo dye) chimiche. Attualmente, ci sono diverse piattaforme disponibili che la chimica a base di probe uso per quantificare trascrizione abbondanza. qPCR in una piastra ben 96 è il metodo più utilizzato di routine, ma solo un massimo di 96 campioni o miRNA può essere testato in un unico passaggio. Questo richiede tempo e noioso se un gran numero di campioni / miRNA sono da analizzare. High-throughput piattaforme sonda-based come microfluidica (es TaqMan carte Array) e gli array nanofluidica (es OpenArray) offrono facilità per rilevare riproducibile ed efficiente l&#39;abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in breve tempo. Qui, dimostriamo il setup sperimentalend protocollo per miRNA quantificazione da siero o campioni di plasma EDTA, utilizzando la chimica probe-based e tre piattaforme differenti (96 pozzetti, microfluidica e array nanofluidica) offrono livelli crescenti di throughput.

Il volume consigliato per un saggio basato sonda miRNA reazione qPCR è di 20 ml. NOTA: Abbiamo confermato che un volume di reazione di 5 microlitri può produrre risultati simili a quelli ottenuti usando 20 ml di volume 4,7,30. Abbassando il volume di reazione di 5 microlitri consente una diminuzione del 75% dei costi dei reagenti senza perdita apprezzabile sensibilità. Come illustrato nella figura 2, volumi di reazione di 20 microlitri e 5 microlitri mostrano una forte co-relazione entro 39 cicli (con r 2 di 0,92, p = 0,0002). Matrice Microfluidics fornisce uno strumento per ottenere dati su 754 miRNA espressi in un campione di circa 5 ore (per la scheda A e Scheda B), che è un modo più efficiente di analizzare più campioni rispetto ai tradizionali 96 PCR pozzetti. Abbiamo confrontato miRNA carte di array microfluidica per lo stesso campione (campione A e campione A ripetizione) Figura 3A -. B mostra un grafico Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) e Correlazione plot (3B) per tutti i 754 miRNA testati per questi campioni. Ci sono 3 differenti miRNA controllo (U6, RNU44 e RNU48) disposte casualmente su entrambe le schede (scheda A e B) in più posizioni. Quando i valori di soglia ciclo U6 (R) sono confrontati tra le 2 piste, non abbiamo osservato differenze significative tra i valori (Tabella 4). E &#39;anche importante notare qui che U6 è espresso in maggiore abbondanza (valore Ct inferiore) nel campione valutato. Abbiamo quindi confrontato tutti i miRNA che hanno valori Ct tra 0-19,99 in entrambe le corse (n = 150), che avevano simile espressione dei miRNA nel complesso con un coefficiente di determinazione del 98% (Figura 3C-D). Di tutti i 277 miRNA che hanno valori Ct tra 20 e 29.99 in entrambe le corse, 16 miR differivano significativamente tra l&#39;originale e la ripetizione piste (Figura 3E - F) Il numero di miRNA con differenza significativa betwee.n le corse sono aumentate (89 su 327) in cui sono stati selezionati i valori Ct tra 30-40 per entrambe le corse (Figura 3G - H). La piattaforma nanofluidics matrice fornisce dati per 754 miRNA da ciascun campione di siero / plasma testati, come rappresentato nella Figura 4A È importante esaminare queste curve di amplificazione -. Come è con tutto qPCR - garantire che il risultato è indicativo della vera amplificazione. Ognuna delle 48 sottoarray (figura 1), contiene anche un saggio per i tre più popolari &quot;pulizia&quot; ncRNAs:. U6, RNU44 e RNU48 figura 4B mostra un raggruppamento tipico di U6 replica da un unico campione. Queste repliche mostrano bassa deviazione standard (SD &lt;0,5) e quindi sono un indicatore di affidabilità. In alternativa, la figura 4C mostra la maggiore variabilità dei replicati U6 (SD&gt; 0,5) in un secondo campione. Questo non nega la validità of rimanenti saggi, sebbene non richiedere una critica più approfondita. U6, come con la maggior parte dei miRNA &quot;pulizia&quot; nei fluidi biologici, può avere una espressione variabile. Va notato che uno dei campioni, illustrate nella Figura 4C, visualizza 4 volte minore contenuto U6 quello illustrato nella figura 4B. Poiché il livello di U6 in campione presentato in 4C è del 75% inferiore a cominciare da quello presentato nel 4B pannello, maggiore variabilità tecnica è previsto a causa della distribuzione di Poisson di trascritti, aggravata dal piccolo volume di reazione 17. Un altro strumento utile è le immagini di controllo di qualità (QC), disponibili per l&#39;esportazione una volta che la corsa è stata completata. Una lista di questi utilizza la fluorescenza ROX, colorante passivo trovato nella miscela reagente qPCR, per confermare che ciascun foro passante è stato caricato correttamente (Figura 5). Un foro passante, o addirittura un en<html> pneumatici subarray, non può caricare a causa di volume del campione insufficiente, l&#39;evaporazione, bolle presenti nei pozzetti della piastra del campione 384-bene, la mancata rimuovere completamente il sigillo piatto del campione, o difetti nel sistema Accufill o dei suoi suggerimenti. Qualsiasi scaricati fori passanti devono essere identificati per evitare miRNA etichettatura come &quot;non rilevabile&quot;, quando in realtà il test è stato mai caricato. Se si verifica questo problema, verificare che almeno 5 ml di campione / mastermix viene caricato in ciascun pozzetto della piastra campione di 384 pozzetti, piatto del campione sia correttamente centrifugato prima del caricamento, il sigillo di alluminio è completamente rimosso, e il OpenArray caricata scivolo è sigillata ed eseguire entro il tempo previsto per tutte le esecuzioni successive. Se i problemi di carico persistono, questi possono essere più probabile di pertinenza di gruppo specifico o sacco di array o di consumo correlati e in seguito si debba sollecitare assistenza attraverso il produttore. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Layout di campioni per il flusso di lavoro Array Nanofluidics: (A) Ogni piatto del campione da 384 e può contenere i campioni per un massimo di 8 matrici nanofluidica. (B) diluito, pre-amplificato cDNA viene inserito in 8 pozzi (2 colonne di 4 righe), con Pool A e Pool B in gruppi da 8 e adiacenti. Ogni cerchio rappresenta un pozzetto. (C) Ciascun pozzetto della piastra campione verrà caricato in uno sottomatrice dell&#39;array nanofluidics. Ogni piccolo quadrato rappresenta una subarray. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi Co-relazione per convenzionali 96 pozzetti piattaforme PCR: Co-relazione tra 20 ml e 5 volumi di reazione microlitri di TaqMan Real-time qPCR utilizzando una piattaforma standard 96 pozzetti in valori CT (39 cicli). Abbiamo confrontato 4 microRNA differenti (miR-375, miR-30c, miR-30d e miR-7) in 4 diversi campioni di siero e plasma umano. Solo 11 punti dati vengono tracciati dal momento che le altre erano rilevabili. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figura 3: circolazione miRNA profiling utilizzando carte di microfluidica array utilizzando 2 schede microfluidica (carta-A e carta-B), viene generato un profilo di 754 miRNA (A - B). Come mostrato qui, abbiamo usato lo stesso campione per 2 array di microfluidica corre per verificare la riproducibilità dei risultati delle carte microfluidica. Abbiamo osservato una simile espressione dei miRNA nel complesso, con valori Ct tra 0-19,99 (C - D). Ci sono pochi miRNA (16 su 277), con valori Ct tra 20-29,99 e significative differenze tra piste di ripetizione (E - F). L&#39;ottanta nove di 327microRNA con valori Ct più alti (30-40) hanno mostrato differenze significative tra le due piste (G - H). &#160; I dati vengono analizzati utilizzando il test T abbinato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figura 4: Profilo Rappresentante di curve PCR prodotto di amplificazione: è una figura rappresentativa delle curve (A) di amplificazione combinati di tutti i bersagli miRNA per un campione di plasma umano. Un test per U6 (a comune controllo ncRNA) è posto in ogni subarray. Il campione in (B) dimostra bassa variabilità (SD &lt;0,5), mentre (C) mostra alta deviazione standard (SD&gt; 0.5) entro U6 replica. Entrambi i campioni sono total RNA isolato dal plasma umano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figura 5: Analisi QC di nanofluidica Array: controllo della qualità (QC) immagini di un nanofluidica matrice caricato correttamente (a sinistra) e un nanofluidica matrice erroneamente caricata (a destra). Il colorante passiva, ROX (presente nella miscela reagente qPCR), fluorescenza per indicare un corretto caricata foro passante. La matrice di destra ha diverse sottoarray / fori passanti che non sono caricati con la miscela dei reagenti qPCR e questi dovrebbero essere identificati come reazioni falsi negativi PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td></tr&gt; <tr><td> Tampone RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mm) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase inibitore </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Trascrittasi inversa </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabella 1A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td><td> Volume per 20 microlitri di reazione (ml) </td></tr><tr><td> Veloce Mastermix PCR (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR assay (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Senza Nucleaseacqua </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Volume totale: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Componente saggio basato sulla miRNA selezionato testato. Tabella 1B: qPCR componenti della miscela di reagente in un 5 o 20 microlitri qPCR preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ml) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello TLDA miRNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2B: preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello TLDA miRNA. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ml) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello nanofluidica miRNA probe-based. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3B:. Preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello nanofluidica miRNA sonda-base NOTA: Il supplementare interattivo fogli di calcolo Excel previste per le tre piattaforme, rappresenta già l&#39;aggiunta del 5% per compensare pipettaggio errore. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Campione A </td><td> Campione A ripetizione </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: circolazione miRNA U6 profiling utilizzando microfluidica carta array. Utilizzando due carte di matrice microfluidica (A e B). Ct-valori di miRNA controllo U6 da Campione A (totale = 8). Controllo U6 coerente miRNA abbondanza osservata tra le piste.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l&#39;abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Views.  The University of Sydney.  MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti. 

Video: Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Approcci sperimentali di ingegneria dei tessuti

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...