La spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie è stata stabilita per la determinazione del ligando proteico in modo a media produttività. Sono presentate diverse affinità per le varianti del sito di legame della stessa molecola, in particolare per gli oligosaccaridi ferro-leganti ad alta maniere sui virus. SPR è una tecnica label-free per studiare in tempo reale il legame macromolecolare dei recettori immobilizzati di superficie.
Le interazioni multisito sono riconosciute nell'analisi cinetica mediante legame competitivo indipendentemente dalle dimensioni del Le aree specifiche nella ricerca che utilizzano SPR sono lo sviluppo di farmaci per la ricerca di inibitori o caratterizzazione anticorpale. Le costanti cinetiche e le affinità sono calcolate direttamente dalla risposta del sensore. Per iniziare, trasferire 100 microlitri della soluzione su piastre di agar LB e distribuirla delicatamente utilizzando uno spargitore di cellule sterili.
Avviare una serie di reazioni campione utilizzando concentrazioni multiple di DNA a doppio filamento che vanno da cinque a 50 nanogrammi mantenendo costante la concentrazione del primer. Quindi aggiungere l'enzima di restrizione DpnI sotto la sovrapposizione di olio minerale e incubare immediatamente a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire il DNA a doppio filamento superarrotolato parentale. Per scongelare le cellule supercompetenti XL1-Blue, aliquotare le cellule in un piccolo tubo inferiore rotondo pre-raffreddato.
Successivamente, trasferire un microlitro di DNA a singolo filamento trattato con DpnI da ciascuna reazione di controllo e campione ad aliquote separate delle cellule supercompetenti che sintetizzano il filamento complementare. Dopo aver ruotato attentamente le reazioni di trasformazione per mescolare, incubare le reazioni sul ghiaccio per 30 minuti. Applicare un impulso di calore alle reazioni di trasformazione a 42 gradi Celsius per 45 secondi, quindi posizionare le reazioni sul ghiaccio per due minuti.
Quindi aggiungere 0,5 millilitri di NZY+Brodo e incubare le reazioni di trasformazione a 37 gradi Celsius agitando a 225-250 RPM per un'ora. Successivamente, placcare il volume corretto di ciascuna reazione di trasformazione sulle piastre di Agar dell'ampicillina LB come dimostrato in precedenza. Per una coltura di semi, inoculare una piccola quantità di ampicillina contenente LB media con una singola colonia dalla piastra trasformata.
Utilizzando la coltura durante la notte, inoculare la coltura di espressione con additivi tra cui 10 millimolari di cloruro di magnesio, 10 millimolari di solfato di magnesio e 20 millimolari di glucosio, diluendo la coltura di semi a uno per 100. Successivamente, far crescere le cellule con un vigoroso scuotimento a 37 gradi Celsius a un assorbente di 600 nanometri tra 0,4 e 0,6 prima di raffreddare le cellule a 20 gradi Celsius e indurre con un IPTG millimolare e crescere durante la notte. Quindi raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Dopo aver risospeso il pellet cellulare in tampone salino tamponato fosfato, recente rifugio a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante con una pipetta. Quindi, risospendere il pellet rimanente in 10 millilitri di tampone di lisi e incubare la sospensione per un'ora a 37 gradi Celsius.
Quindi separare le frazioni solubili e insolubili mediante centrifugazione a 4.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Inoltre, utilizzare HIS-Select Ni2 + Affinity Gel in tubi da 14 millilitri per legare e risospendere la sua cianovirina-N espressa in modo ricombinante marcata in soluzioni tampone con 20 millimolari imidazolo e 250 millimolari imidazolo, rispettivamente. Incubare in batch per almeno 30 minuti tra questi passaggi.
Aggiungere il tampone di eluizione contenente 250 millimolari di imidazolo alla proteina eluita. Trasferire le soluzioni proteiche in provette di centrifugazione con un filtro Dalton da 10 kg e concentrarle centrifugando per 10 minuti a 4.500 g e quattro gradi Celsius. Aggiungere il tampone di corsa SPR a un fattore di diluizione da uno a 10 e centrifugare quattro volte al volume iniziale per 10 minuti a 4.500 g e quattro gradi Celsius.
Successivamente, determinare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile NanoDrop basato sul coefficiente di estinzione calcolato per la proteina principale CVN2L0 che mostra una dimensione di 23.474 Dalton. Per il sistema SPR a doppio canale, utilizzare HBSCP plus come tampone di funzionamento, acido cloridrico glicina 10 millimolari di pH da 1,5 a 1,6 come tampone di rigenerazione e accendere il degasatore dello strumento, l'autocampionatore e la pompa. Quindi lavare l'intero sistema con acqua distillata due volte per un'ora.
Quindi, far cadere l'olio ad immersione sul rilevatore e montare un chip sensore di vetro rivestito con una sottile pellicola dorata. E sul lato superiore, funzionalizzato con carbossimetildegrato destrano idrogel direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Quindi fissare l'impostazione tirando verso il basso la gestione.
Per immobilizzare i ligandi proteici ai chip del sensore, aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Modulo nella barra dei menu ed eseguire l'editor della tabella nel software di collegamento automatico SPP integrato. Quindi scegliere e fare clic su Immobilizzazione di base dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e seguire i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer. Quindi, fare clic su Sample Set Editor nella sezione del modulo per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi.
Fare clic su Controllo diretto autocampionatore come strumento nella barra dei menu per portare i rack avanti o indietro a casa e scegliere quattro gradi Celsius come temperatura operativa. Avviare la pompa per infondere acqua bidistillata facendo clic su strumenti e controllo diretto della pompa. E registra i dati facendo clic su SPR Instrument Direct Control.
E ogni volta, inizia nella finestra appena apparsa. Dopo aver aggiunto i reagenti di accoppiamento in flaconcini da 300 microlitri, inserirli nei rack dell'autocampionatore e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Esegui. Per la semplice interazione proteina-proteina, dopo aver riempito nuovamente la pompa a 25.000 microlitri al minuto, eseguire la regolazione della linea di base per 30 secondi.
Attendere la successiva regolazione della linea di base con acqua distillata doppia per 1,5 minuti prima di spegnere la superficie del chip attivato con un molare etanolammina cloridrato, pH 8,5. Quindi passare i tubi dal campionatore liquido al degasatore dall'acqua bidistillata nella bottiglia con HBS-EP + Click on Form, scorrere verso il basso e passare a Post-Processing facendo clic su questa modalità operativa. Quindi fare clic su Aggiungi per selezionare le curve di binding generate nel tempo nella piattaforma dati per ciascuna cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scrub.
Quindi, fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio del file e ottenere curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale ligando. Le singole iniezioni di CVN2L0 e varianza V2 e V5 sono state testate per la prima volta per il legame al chip del sensore accoppiato all'emoagglutinina per stimare le capacità di legame utilizzando l'autocampionatore e l'editor della tabella di esecuzione. Le iniezioni ripetute sono state automatizzate a varie concentrazioni nell'intervallo nanomolare e micromolare nel sistema nel tempo, dimostrando che non è stata raggiunta alcuna saturazione sulla superficie del chip né alcun legame di equilibrio.
La concentrazione rispetto alla risposta è stata tracciata per il legame wild-type CVN a RBD, assumendo un targeting specifico di carboidrati possibilmente conservati sulla subunità RBD S1 con affinità più debole avente una costante di velocità di dissociazione di 260 micromoli. Lo stesso grafico di affinità per il legame di CVN2L0-V4 al DM diventa non più analizzabile a causa della sostituzione dei legami disolfuro che interferiscono con il legame ad alta affinità a piccoli peptidi glicosilati e produce una risposta superiore al valore massimo di risposta. Il legame di tipo selvatico CVN a RBD su SARS-CoV-2 mostra un legame alla proteina S e RBD con una costante di rabbia di dissociazione di 18,6 micromoli e 260 micromoli, rispettivamente.
Sebbene la risposta SPR per le concentrazioni di analita si traduca in unità ad alta risposta e sensorigrammi SPR tipici per CVN wild-type e legame E41A. Tuttavia, il mutante è instabile quando diluito. Il biorilevamento SPR sta affrontando il legame ad alta e bassa affinità delle proteine purificate e delle sue varianti ai ligandi.
Nel nostro caso, glicoproteine che sfruttano la lettura ottica e il sistema di flusso a doppio canale sulla superficie del chip del sensore. Il saggio immunoassorbente dell'enzima è un metodo immunologico alternativo che riconosce gli epitopi proteici ma fornisce anche dati sulla concentrazione di peptidi e piccole molecole da matrici complesse. Il test delle proteine espresse in modo ricombinante mediante saggi di legame SPR ha incorporato il biorilevamento dei cambiamenti di conferma che è utile per la verifica e la previsione della stabilità delle proteine dal lato proteico computazionale.
