Ringraziamo Janice Fischer per la fornitura del plasmide UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. L&#39;anticorpo mAB24B10 è stato ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Banca sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Biologia. Lo stock repo-GAL4 (BL7415) è stato ottenuto dal Bloomington Stock Center presso l&#39;Indiana University. Supporto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) alla Purdue University Center for Cancer Research è riconosciuto con gratitudine. Jingqun Ma è supportato da una ricerca agricola presso la Purdue assistentato in alimentazione e l&#39;agricoltura presso la Purdue University.

1. Generazione e caratterizzazione di EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Autista Croce Gal4 vola UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vola. In alternativa, mosche ricombinanti che portano sia il driver GAL4 e il transgene UAS-EGFP :: Msp-300 KASH possono essere generati utilizzando tecniche genetiche standard. Questo secondo approccio è vantaggioso se sono necessarie grandi quantità di progenie. </li><li> Caratterizzare l&#39;espressione del marcatore EGFP :: KASH utilizzando tecniche di microscopia standard. Nota: espressione EGFP può essere osservato mediante tecniche di microscopia normali in sezionati, fissi tessuti di Drosophila, o in tutta larve, e non richiede l&#39;uso di un anticorpo. <ol><li> Determinare il modello di espressione della EGFP :: marcatore KASH in tutto l&#39;organismo sotto un microscopio a fluorescenza dissezione (vedi Materiali PDF). Nota: Molti piloti GAL4, compreso il conducente repo-GAL4 illustrato nella figura 1, mostra nmodelli onspecific di espressione in altri tessuti larvali come la ghiandola salivare (vedi risultati). </li><li> Analizzare il pattern di espressione EGFP :: KASH nel tessuto sezionato di interesse utilizzando la microscopia confocale. <ol><li> Fissare il tessuto di interesse utilizzando formaldeide ad una concentrazione finale del 4%, e macchia DNA utilizzando DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml di visualizzare la localizzazione della EGFP :: KASH tag rispetto al DNA. </li><li> Acquisire immagini utilizzando un obiettivo 40X / 1,30 olio per immersione o un obiettivo 20X / 0,75 olio di immersione, a seconda delle dimensioni del tessuto di interesse. Le seguenti condizioni di eccitazione / emissione possono essere usate per l&#39;acquisizione delle immagini: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolare Nuclei di Drosophila larvali tessuti <ol><li> Preparare attrezzature per la dissezione dei tessuti larvale e successivo isolamento nuclei. Si noti cheinteri embrioni dechorionated potrebbero anche essere utilizzati come materiale di partenza se desiderato. Si raccomanda di usare tessuti larvali parzialmente sezionato anziché intero larve se il tipo cellulare di interesse è presente in un tessuto specifico quale il disco immaginale. Questo riduce il legame non specifico, ed elimina anche i problemi che possono essere causati da espressione di alcuni driver GAL4 nelle cellule non bersaglio. <ol><li> Preparare due paia di pinze taglienti (vedi Materiali PDF), una lastra di vetro siliconato 9-bene (vedi Materiali PDF) e PBT (1x PBS, pH 7.4, 0.1% Tween-20). </li><li> Prebind l&#39;anticorpo GFP alle biglie magnetiche. Questo passaggio deve essere avviato prima di iniziare la dissezione. Aggiungere 10 ml di biglie magnetiche (Invitrogen, vedere Materiali PDF) e 2 mg di anticorpo GFP (Roche, vedi Materiali PDF) a 400 ml di tampone di lavaggio (1x PBS, pH 7,4; 2,5 mM MgCl 2) in una provetta da 1,5 ml . La quantità di perline e anticorpo utilizzato può essere ottimizzato se necessario, in base alla quantità di destinazione nel samPLE e l&#39;affinità di legame dell&#39;anticorpo ai talloni. </li><li> Incubare le perline e anticorpo con rotazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline e anticorpi nel rack magnetico (vedi Materiali PDF) e permettere le perle di legarsi magnetico per circa 1-2 min. Rimuovere il surnatante contenente l&#39;anticorpo non legato e tampone di lavaggio usando una pipetta 1 ml. Le perle resteranno vincolati alla parete della provetta da 1,5 ml sul lato adiacente al magnete. </li><li> Sciacquare le perle due volte con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere la provetta da 1,5 ml dal rack magnetico e invertire brevemente per mescolare le perline e tampone di lavaggio durante ogni fase di lavaggio. </li><li> Conservare le perle anticorpo legato a tampone di lavaggio fino al momento di continuare con la fase 2.7. Le perle non dovrebbe essere permesso di asciugare in qualsiasi fase del protocollo. </li></ol></li><li> Sezionare tessuti larvali in PBT e trasferire i tessuti dissezionati diun pozzetto del piatto 9-bene. Tipicamente, la dissezione del lobo ottico e l&#39;occhio disco immaginale da 100 larve terzo instar fornisce materiale sufficiente per downstream analisi di espressione genica in seguito isolamento nuclei. </li><li> Risciacquare il tessuto isolato in tampone di estrazione nucleare (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM MgCl 2; KCl 10 mM) in una provetta da 1,5 ml. Trasferire isolati tessuti larvali a un 1 ml Dounce Omogenizzatore (vedi Materiali PDF) sul ghiaccio che contiene 1 ml di tampone di estrazione nucleare fresco. Incubare in ghiaccio per 5 min. Non è necessario aggiungere inibitori della proteasi se RNA deve essere estratto dopo isolamento nuclei. </li><li> Distruggere il tessuto da 20 colpi con il pestello sciolto e poi incubare il campione in ghiaccio per 10 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi. Estrarre i nuclei delle cellule utilizzando 15 colpi con il pestello stretto. Il numero di colpi con i pestelli allentato e stretto deve essere ottimizzato per diversi tessuti e tipi di cellule; eccesso omogeneizzazione può provocarenuclei tosata, mentre omogeneizzazione insufficiente non estrarrà tutti i nuclei dal tessuto. </li><li> Filtrare l&#39;omogeneizzato, che contiene i nuclei e detriti cellulari, attraverso una dimensione dei pori del filtro 40 micron (vedi Materiali PDF) che è stato prerinsed con tampone di omogeneizzazione nucleare. Raccogliere il omogenato filtrato in una nuova provetta. </li><li> Raccogliere campioni di pre-isolamento per successive analisi per determinare la resa nuclei, l&#39;integrità nuclei, e di determinare livelli di trascrizione dei geni bersaglio prima di nuclei isolamento. <ol><li> Trasferire 50 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml con una pipetta. Questo è il campione pre-isolamento. Aggiungere 500 ml di Trizol reagente (vedi Materiali PDF, ATTENZIONE), miscelare e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento di RNA (punto 3.1). </li><li> Trasferire 20 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml. <ol><li> Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e inccampione Ubate in ghiaccio per 10 min. </li><li> Trasferimento nuclei DAPI colorati con un coprioggetto rivestito poli-lisina, e mettere su un vetrino da microscopio. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. </li><li> Verificare l&#39;integrità nuclei, e la presenza di nuclei GFP-tagged di interesse utilizzando microscopio a fluorescenza. Nota: Non è necessario fissare i nuclei, o colorare per GFP se queste diapositive sono analizzate in tempi ragionevolmente rapidi dopo la preparazione (entro 24 ore). </li></ol></li><li> Trasferimento 10 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml e aggiungere 90 ml di tampone di lavaggio (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM MgCl 2). Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e incubare in ghiaccio per 10 min. Determinare la resa nuclei nel campione pre-isolamento con un emocitometro per contare i nuclei DAPI-positivi con epifluorescenza sotto un obiettivo 10X aria. </li></ol></li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound (preparati nella sezione 2.1.6) in un rack magnetico,e consentire alle sfere magnetiche di legarsi magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere il tampone di lavaggio dai branelli legata all&#39;anticorpo usando una pipetta 1 ml, e aggiungere l&#39;omogenato filtrato dal punto 2.5 al provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml. </li><li> Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per mescolare e incubare a 4 ° C per 30 minuti con end-over-end agitazione. Evitare bolle nel tubo se possibile, in quanto questi possono causare aggregazione dei nuclei. </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound e omogenato in un rack magnetica, e permettono le sfere magnetiche di legarsi al magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere l&#39;omogeneizzato contenente la frazione non legata nuclei con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare il campione 3x con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta. Rimuovere il tubo da 1,5 ml contenente le perline, nuclei legati e lavare tampone dal rack e miscelare diverse volte, quindi inserire il tubo nel rack magnetico come descrittonel passo 2.9 e rimuovere il surnatante con una pipetta 1 ml. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio per le perline, che dovrebbero essere legati ai nuclei bersaglio. Questo è il campione post-isolamento. Preparare i campioni per le analisi di microscopia e di estrazione di RNA successiva. <ol><li> Trasferire 20 ml di campione post-isolamento per una nuova provetta da 1,5 ml e macchia con DAPI e analizzare come descritto nella sezione 2.6.2. Contare il GFP + / DAPI + e + GFP-/DAPI nuclei catturate da perline magnetiche per determinare la purezza della GFP + arricchito nuclei nel campione post-isolamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di Trizol reagente al resto del campione post-isolamento, miscelare, e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento dell&#39;RNA (passo 3.1). Nota: I campioni in Trizol possono essere conservati per diverse settimane, se necessario, a -20 ° C. Non è necessario per eluire i nuclei dalle perline magnetiche prima estrazione di RNA utilizzando Trizol reagente, because le perline non interferiscano con il successivo isolamento dell&#39;RNA. </li></ol></li></ol> 3. Determinare livelli di trascrizione nei nuclei isolati da tessuti larvali <ol><li> Isolare l&#39;RNA dai campioni pre-e post-isolamento isolamento preparati in sezioni 2.6.1 e 2.11.2 utilizzando il protocollo standard descritto per l&#39;estrazione di RNA-based Trizol (vedi Materiali PDF) con le seguenti modifiche: <ol><li> Dopo precipitazione del pellet di RNA, aggiungere 19,2 ml di acqua priva di RNasi e 0,8 ml di reagente RNASecure (vedi Materiali PDF) al pellet e incubare a 60 ° C per 20 minuti per inattivare RNasi. </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di RNA con un colorante fluorescente vincolante-RNA, come il kit Qubit saggio RNA (vedi Materiali PDF) usando l&#39;2.0 Fluorometro QubitR seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Sintetizzare cDNA utilizzando una trascrittasi inversa amplificando come il EpiScript Reverse kit trascrittasi e primer oligodT seguendo le istruzioni del produttore. Nota: in genere, 50 a 100 ng di RNA genera cDNA sufficiente per eseguire le analisi di espressione genica aerei. Quantità equivalenti di pre-isolamento e post-isolamento dell&#39;RNA dovrebbero essere usati per generare cDNA. </li><li> Aggiungere 180 ml di acqua priva di nucleasi al campione di cDNA 20 microlitri per diluire questo 10 volte prima di real-time PCR quantitativa (qPCR) analisi. Questa diluizione è un passo importante, perché campioni di cDNA non diluiti possono inibire la qPCR. </li><li> Preparare una master mix qPCR con polimerasi e dNTP, 4 pmoli ciascuno di avanti e indietro innesco, fatta con acqua sterile al volume finale di reazione di 20 microlitri. <ol><li> Disegnare primer qPCR per indirizzare geni suscettibili di essere espresso nel tipo cellulare di interesse, e allo stadio di sviluppo in cui il tessuto viene raccolto. Primer design per attraversare un introne, se possibile, in modo che genomica eprodotti cDNA PCR possono essere distinti. Nota: Se il profilo di espressione genica del tipo di cellula bersaglio non è noto, primers contro eGFP, che deve essere espressa specificamente nella popolazione nuclei targhetta, possono essere usati per ottimizzare il protocollo per un tipo particolare e tessuti (Tabella 1) cellule. </li></ol></li><li> Determinare i livelli di trascrizione relative di ciascun gene di interesse nei campioni pre-e post-isolamento isolamento rispetto ad una serie di diluizioni di cDNA preparato da tutto il tessuto. Livelli di trascrizione dei geni bersaglio dovrebbero essere normalizzati a un gene di riferimento, come Rpl32 (o, preferibilmente, più geni di riferimento). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo può essere utilizzato per isolare o altamente arricchire specificamente nuclei contrassegnati da popolazioni di cellule miste in Drosophila embrionale o tessuti larvali. Usando questo protocollo, i nuclei possono essere isolate dai tessuti sezionati in circa 1 ora. La purezza e resa dei nuclei isolati devono essere determinati sperimentalmente per ogni tipo di cellula. Può essere difficile quantificare i nuclei del tallone con associazione nella fase post-isolamento del protocollo utilizzand...

Tessuti Drosophila come il sistema nervoso centrale contengono una miscela complessa di tipi cellulari. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, è prima necessario isolare una popolazione omogenea di cellule specifiche in quantità sufficienti per consentire applicazioni a valle. Metodi per isolare cellule da tessuti intatti includono microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) di cellule intere. Mentre FACS è stato usato per isolare cellule e nuclei da embrioni di Drosophila e da Caenorhabditis elegans per l&#39;espressione genica e cromatina profiling 1-3, FACS e microdissezione laser possono essere difficili da eseguire con successo nei tessuti che contengono tipi cellulari altamente mescolati tra loro o che le cellule contengono con morfologia irregolare, come i neuroni. Per superare questa difficoltà, nuclei piuttosto che cellule possono essere isolate da specifici tipi cellulari e utilizzati per la successiva generazionee profili di espressione. È importante sottolineare che, in base microarray-mRNA analisi di espressione utilizzando campioni di RNA nucleari mostra i risultati generalmente comparabili con quelli eseguiti utilizzando RNA totale 4, 5. Inoltre, l&#39;analisi di espressione genica utilizzando RNA nucleare è stato usato con successo per studiare l&#39;espressione genica in organismi multipli compresi C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, e gli esseri umani 4, 5 2, 3. Diversi approcci sono stati recentemente descritto per l&#39;isolamento di specifiche popolazioni di nuclei etichettati da tessuti di Drosophila che sono adatti per l&#39;analisi di espressione genica e / o immunoprecipitazione della cromatina. L&#39;isolamento lotto di cromatina tessuto-specifico per il metodo di immunoprecipitazione (bit-Chip) utilizza FACS per isolare nuclei fissati sulla base di cellula-tipo particolare espressione di GFP nucleare localizzata 2. Questo approccio è stato successfully utilizzato per analizzare la distribuzione delle modificazioni degli istoni e fattori di trascrizione con cromatina immunoprecipitazione di nuclei isolati dal mesoderma di Drosophila embrioni 2. Tuttavia, gli approcci basati FACS possono essere meno adatti per isolare nuclei etichettati che costituiscono solo una piccola parte di una popolazione mista a causa della maggiore tempo liste necessario avere numeri adatti per applicazioni a valle. Per superare queste limitazioni, diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di isolamento a base di affinità per purificare nuclei che sono etichettati con un epitopo specifico in un particolare tipo di cellula. L&#39;isolamento dei nuclei contrassegnati in tipi cellulari specifici metodi (intatto) sviluppati per l&#39;utilizzo in Arabidopsis thaliana 6, 7 è stato recentemente adattato per l&#39;uso in Drosophila 8. In questo metodo, una proteina dell&#39;involucro fusione nucleare che è un substrato per in vivo biotinylation è coexpressed con l&#39;Escherichia coli biotina ligasi Bira in tipi cellulari specifici. Nuclei marcati con biotina possono essere successivamente purificati da popolazioni miste che utilizzano basato streptavidina-isolamento affinità. Usando questo approccio, i nuclei sono stati etichettati con successo e isolato dal mesoderma di embrioni di Drosophila in cui una proteina dell&#39;involucro fusione nucleare è stato espresso sotto il controllo di un potenziatore specifico mesoderma 8. Gli autori hanno anche generate proteine ​​dell&#39;involucro di fusione nucleare che possono essere espressi in qualsiasi tipo di cellula sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS 9. Questo approccio è in grado di isolare rapidamente sottoinsiemi di nuclei etichettati da popolazioni miste, ma richiede tre costrutti transgenici separati e può quindi essere inadatto per applicazioni particolari genetici. Recentemente, un approccio è stato descritto in cui SUN (S AD1 e C-84 ONU)-dominio contenente proteine ​​che localizzano alla membrana interna dell&#39;involucro nucleare sono stati contrassegnati conproteine ​​fluorescenti ed espresso sotto il controllo del sistema Gal4/UAS 10. I nuclei sono stati isolati in presenza di detergente non ionico per rimuovere la membrana esterna della membrana nucleare, e purificati per affinità utilizzando biglie magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP. Questo approccio è stato utilizzato con successo per isolare piccole popolazioni di nuclei etichettati da specifici sottotipi neuronali all&#39;interno del cervello adulto di Drosophila 10. Qui, un protocollo per l&#39;isolamento di nuclei etichettati da una popolazione mista di cellule di Drosophila tessuto larvale è descritto. Questo metodo è stato sviluppato in modo indipendente, ma è simile a quello descritto da Henry et al. 10 In primo luogo, i nuclei sono stati etichettati con un tag fluorescente che viene espresso solo in specifici tipi cellulari in Drosophila melanogaster per facilitare il successivo isolamento di nuclei contrassegnate da popolazioni miste utilizzando un approccio basato affinità. Per etichettare nuclei,il dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omologia) è stato utilizzato. Il dominio KASH è un dominio transmembrana che localizza alla membrana esterna della busta nucleare, in parte attraverso le interazioni con SUN-dominio contenenti proteine ​​all&#39;interno dello spazio perinucleare 11. Il dominio KASH C-terminale delle proteine ​​come Drosophila Msp-300 e Klarsicht ancore queste proteine ​​alla membrana nucleare esterno, mentre i loro domini N-terminale interagiscono con proteine ​​del citoscheletro actina o come microtubuli nel citoplasma 12-14. Costrutti sono stati generati in cui il dominio KASH di Drosophila Msp-300 è stata fusa al C-terminale della EGFP, sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS nel vettore pUAST-attB 15, 16. Utilizzando integrazione sito-specifica phiC31, sono stati generati moscerini transgenici in cui le UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgene è stato inserito nel attP2 loci sul cromosoma3L 17. Il UAS-EGFP :: Msp-300 KASH aria può essere attraversato con le mosche che esprimono il conducente GAL4 in un particolare tipo di cellula, con conseguente espressione mirata di EGFP sulla membrana nucleare esterno nel tipo cellulare di interesse. Nuclei etichetta possono essere purificati da popolazioni di cellule miste che utilizzano anticorpi contro GFP accoppiati a sfere magnetiche. In questo approccio, l&#39;uso di detergente non ionico non è necessaria perché il tag EGFP è localizzato sul lato citoplasmatico della membrana nucleare esterno, ed è quindi accessibile agli anticorpi. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzata per isolare / arricchire nuclei EGFP-etichettata specifici tipi cellulari in Drosophila tessuti larvali, per quantificare la purezza e resa di nuclei isolati, e per estrarre RNA nucleare adatto per trascrizione inversa reazione polimerasica a catena quantitativa (qRT -PCR) analisi di espressione genica. L&#39;isolamento e l&#39;affinità purificazione dei nuclei (esclusi Tissue dissezione) può essere eseguito in meno di un&#39;ora. I risultati sono presentati mostrando che i nuclei gliali possono essere isolati con successo dal lobo ottica larvale e occhio disco immaginale, e utilizzati per la successiva analisi di espressione genica. Si prevede che questo approccio possa essere utile per l&#39;isolamento / arricchimento di nuclei etichettati da tessuti embrionali e larvali in cui le cellule bersaglio costituiscono meno del 5% della popolazione totale. Tutte le scorte Drosophila e plasmidi ottenuti da questo studio sono disponibili su richiesta degli autori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Tessuti embrionali e larvali Drosophila melanogaster spesso contengono una miscela altamente eterogeneo di tipi di cellule, che può complicare l&#39;analisi di espressione genica in questi tessuti. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, potrebbe essere necessario isolare specifici tipi cellulari con elevata purezza e con rese sufficienti per applicazioni a valle come profiling trascrizionale e cromatina immunoprecipitazione. Tuttavia, la morfologia cellulare irregolare in tessuti come il sistema nervoso centrale, insieme con la rara popolazione di specifici tipi cellulari in questi tessuti, può porre problemi per i metodi tradizionali di isolamento cellulare come microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) . Qui, un approccio alternativo alla caratterizzazione dei profili di espressione genica specifica delle cellule utilizzando a base di affinità isolamento dei nuclei con tag, piuttosto che cellule intere, è descritto. Nuclei in c specificatipo ell di interesse sono geneticamente etichettati con un tag EGFP busta localizzato nucleare utilizzando il sistema di espressione binario Gal4/UAS. Questi nuclei EGFP-tag possono essere isolate utilizzando anticorpi contro GFP che sono accoppiati a biglie magnetiche. L&#39;approccio descritto in questo protocollo consente un isolamento uniforme di nuclei di specifici tipi cellulari nel sistema nervoso centrale larvale Drosophila ad elevata purezza ed a livelli sufficienti per l&#39;analisi di espressione, anche quando questi tipi cellulari rappresentano meno del 2% della popolazione totale di cellule nella tessuto. Questo approccio può essere utilizzato per isolare i nuclei da un&#39;ampia varietà di Drosophila embrionale e tipi cellulari larvali utilizzando specifici driver di GAL4, e può essere utile per isolare i nuclei da tipi di cellule che non sono adatti per FACS o microdissezione laser.

Il driver repo-GAL4 (Bloomington archivio numero 7415) è specificamente espresso in cellule gliali del sistema nervoso Drosophila, a diversi stadi di sviluppo 18. Le mosche sono stati generati che esprimono stabilmente UAS-EGFP :: Msp-300 KASH sotto il controllo del guidatore repo-GAL4 utilizzando tecniche genetiche standard. Per caratterizzare il profilo di espressione del transgene EGFP :: KASH in queste mosche, il pattern di espressione GFP nel lobo ottica se...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l&#39;espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l&#39;analisi dell&#39;espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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14.6K Views.  Purdue University.  Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.