Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, il Centre National de la Recherche Scientifique, l&#39;Université de Strasbourg, l&#39;Hôpital de Strasbourg, l&#39;Associazione pour la Recherche sur le Cancer, l&#39;Institut National du Cancer, l&#39;Agence Nationale de la Recherche e la regione dell&#39;Alsazia. Pietro Laneve è stata sostenuta dalla Fondation pour la Recherche Médicale. Attualmente, egli è destinatario di un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) borsa di studio. Spese di pubblicazione sono supportati dalla rete Neurex (TriNeuron - Programma Interreg IV Alto Reno)

1 Raccolta dei campioni <ol><li> Staccare 2 celle semi-aderente di Schneider, (1-5 x 10 6 cellule in media), pipettando e raccolta per centrifugazione (100 xg per 1 min). Nel caso di cellule aderenti coltivate in vitro, li trypsinize in condizioni standard o direttamente raccoglierli da piastre in una conveniente quantità di RNA reagente di estrazione, con l&#39;aiuto di un raschietto cellulare. </li><li> Per la raccolta degli embrioni, crescere i ceppi di Drosophila in gabbie fly e lasciare che gli embrioni si accumulano sui piatti deposizione delle uova. Pulire gli embrioni fuori da un pennello in acqua distillata (dH 2 O), eliminare i detriti da filtrazione setaccio, lavare e recuperare gli embrioni in un flaconcino 48. </li><li> Come tecnica alternativa, sezionare manualmente tessuti / organi. Isolare testicoli (un sistema preferenziale per l&#39;analisi piRNA) da Drosophila addome in tampone fosfato (PBS) allo stereomicroscopio (ingrandimento 20X), utilizzando aghi dissezione o pinze come visCrown perso- nalizzate a Sullivan et al 49. </li><li> Pestello omogeneizzare campioni sulla tossicodipendenza a 0,5 volumi di reagente di estrazione di RNA. </li></ol> 2. RNA Estrazione / Analisi <ol><li> Le istruzioni del fabbricante eseguire l&#39;isolamento di RNA attraverso reagenti in commercio. ATTENZIONE! Agenti di estrazione di RNA sono generalmente tossici e caustici. In alternativa, applicare un protocollo basato-proteinasi K per l&#39;isolamento dell&#39;RNA 50, come segue: <ol><li> Diluire i campioni in 400 ml di arresto Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Recuperare componenti idrosolubili di fenolo serie: cloroformio: alcool isoamilico e estrazioni cloroformio e di etanolo (EtOH) precipitazione / lavaggio. Aria asciugare i campioni e risospendere in dietilpirocarbonato (DEPC) -treated bidistillata (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Valutare la concentrazione di RNA mediante misurazione spettrofotometrica UV. Anche assicurare la purezza dell&#39;RNA è alta, vicino a 2.0, basEd su A 260 / A 280 lettura. </li><li> Controllare la preparazione di RNA su gel di agarosio denaturante come segue: <ol><li> In un bicchiere pulito, sciogliere 1,2 g di agarosio in 82 ml di DEPC-DDH 2 O, sotto continua agitazione. Far bollire fino a completa dissoluzione. </li><li> Lasciare che la soluzione di gel raffreddare; quando la temperatura raggiunge i 60 ° C aggiungere 10 ml di acido 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) tampone 1X a concentrazione finale (FC), e 8 ml di formaldeide al 37% al 3% FC. ATTENZIONE! La formaldeide è una sostanza cancerogena. </li><li> Versare il gel in una cella per elettroforesi orizzontale. Lasciare che il gel di solidificare sotto una cappa per almeno 1 ora. A seguito di solidificazione, immergere il gel in MOPS 1X. </li><li> Aliquota 2 mg di campione di RNA e 1 mg di Scala (utilizzare un marcatore RNA quando si desidera una valutazione accurata). Aggiungere 3 volumi di agarosio colorante di caricamento (ALD) per RNA e Ladder. Riscaldare a 70 ° C per 5 minuti e raffreddare immediatamente su ghiaccio. CATENZIONE! Contenuti di ALD (etidio bromuro e formammide, vedi Materiali) sono mutageno e corrosivo, rispettivamente. </li><li> Caricare i campioni ed eseguire il gel a 50 V per circa 1 ora con occasionali riciclo buffer. Controllare il modello di RNA frazionamento da visualizzazione UV o immagini gel. Riconoscere bande discrete corrispondenti a 28S e 18S rRNA e tRNA (vedi Figura 1). </li></ol></li><li> Procedere alla Northern Assay o negozio di RNA a -80 ° C. </li></ol> 3. Denaturing acrilamide Gel Preparazione <ol><li> Utilizzare un piccolo apparato per elettroforesi verticale per questo passo frazionamento (dimensioni piastra circa 8 cm x 9 cm, pettine spessore di 0,75 millimetri). </li><li> Montare bicchieri puliti insieme in una cornice di casting. </li><li> Preparare 10 ml di 10% di acrilammide / bis-acrilamide (19: 1) soluzione in MOPS 1X, 7 M urea. Immediatamente prima di versare, aggiungere 100 ml di 10% di persolfato di ammonio e 10 ml di TEMED e rapidamente mescolare la soluzione. ATTENZIONE! L&#39;acrilammide è neurotossico e cancerogeno. </li><li> Versare il gel tra lastre di vetro e inserire con cautela il pettine bene per evitare bolle. Lasciate che il gel di polimerizzare a temperatura ambiente per almeno 45 minuti prima dell&#39;uso. In alternativa, conservare il gel O / N, avvolto in carta da filtro imbevuta di acqua e sigillati in involucro di saran. </li></ol> Preparazione del campione 4 <ol><li> Aliquotare 0,5-20 mg di RNA totale per ogni campione. Se il volume supera 3-4 microlitri, vuoto asciugare il campione. </li><li> Per la determinazione della dimensione, eseguire una aliquota (20-30 cps) del radiomarcato scala della gamma bassa in parallelo ai campioni, come marcatore (vedere paragrafo 4.3 e 4.4 per la preparazione). Trattare in parallelo ai campioni, come descritto al punto 4.5. </li><li> Scala: istituito una reazione in avanti fosfato con 0.1 mg di una scala di 10 bp-passo. Incubare a 37 ° C per 30 minuti e interrompere la reazione aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 20 FC mM. </li><li> Purificare da EtOH precipitazione / lavatrice, aria secca erisospendere in DDH 2 O (circa 100 ml). ATTENZIONE! 32 P è una sorgente radioattiva. </li><li> Per ogni campione aggiungere un uguale volume di acrilammide colorante blu (ABD). Denaturare da riscaldamento a 80 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare su ghiaccio fino caricamento. ATTENZIONE! Formammide (contenuto in ABD) è corrosivo. </li></ol> 5. elettroforetica Frazionamento <ol><li> Rimuovere le lastre di vetro dal supporto colata e correttamente li assemblano in cella elettroforesi. Riempire sia camera interna e esterna con sufficiente tampone di corsa (RB). </li><li> Rimuovere delicatamente il pettine e pre-eseguire il gel a 200 V per 10 min. Prima di caricare i campioni, lavare via i depositi di urea dai pozzetti spruzzando qualche RB attraverso una siringa. </li><li> Utilizzare punte piatte per stratificare i campioni attentamente dal punto 4.5 al fondo di ciascun pozzetto. Controllare i collegamenti anodo e catodo per evitare il funzionamento invertito. Dopo i campioni entrano nel gel a 100 V per 5 minuti, iaumentare l tensione di 200 V. </li><li> Per una lunghezza frazionamento di circa 7 cm, 45 min-lungo periodo è sufficiente. Evitare di blu di bromofenolo (un pigmento inseguimento in ABD) traboccare il gel. </li><li> Visualizza on-gel i frazionati lunghi RNA di etidio bromuro (EtBr) colorazione, come un passaggio facoltativo: <ol><li> Tagliare 2 cm dalla parte superiore del gel e sciacquare brevemente la fetta in DDH 2 O. </li><li> Incubare la fetta gel a temperatura ambiente per 15 minuti con dolce Shacking in RB, EtBr 0,5 mg / ml FC. </li><li> Destain il gel per 15 minuti in RB, visualizzare lunghi rRNA di irradiazione UV o immagini gel. Verificare la presenza di RNA di carico e di qualità (vedi Figura 1, pannello 7). ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno. </li></ol></li><li> Procedere frattempo assorbente la parte inferiore del gel contenente piccole specie di RNA. </li></ol> 6. Gel Blotting <ol><li> Tagliare 6 pezzi di carta assorbente per adattarsi all&#39;area blotting e un pezzo di uncharge equivalentemembrana di nylon d. Inumidire fogli di carta, membrana e 2 pastiglie blotting in RB. Assicurati di immergere completamente le pastiglie ripetutamente spremitura a RB. </li><li> Rimuovere il gel dall&#39;apparecchio e aprire gli occhiali per mezzo di una spatola. Utilizzare un cutter pulito per rimuovere i pozzi. Mettere un foglio di carta Whatman bagnato sul gel e sollevare delicatamente verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare la membrana di nylon sulla faccia libera del gel. Segna un angolo per orientare il filtro secondo il campione di carico. Completa il &quot;sandwich&quot; (3 pezzi di carta ogni lato). Roll un asta di plastica sulla superficie blot, per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Posizionare la macchia tra due pastiglie blotting e poi nella cassetta assorbente. Montare la cassetta nel modulo assorbente, riempire la camera con RB e verificare il corretto orientamento (membrana di nylon deve stare tra il gel e il capolinea positivo). </li><li> Trasferimento a 20 V per 20 min. Nota: al fine di garantire condizioni omogenee, dopo 10 min aprire il modulo assorbente e rotate il panino di 180 ° prima di completare il trasferimento. </li></ol> 7 Membrana reticolazione <ol><li> Preparare 6 ml di soluzione di reticolazione fresca (XLS). Saturare di 10 cm x 10 cm (più grandi rispetto membrana di nylon) pezzo di carta assorbente con XLS. ATTENZIONE! HCl (un componente di XLS) è altamente corrosivo. </li><li> Smontare la macchia e posizionare la membrana sulla carta da filtro 3MM bagnato. Nota: RNA non deve essere a contatto diretto con la carta satura. Posizionare il filtro e la carta tra due lastre di vetro e avvolgere in saran-wrap. </li><li> Riscaldare la membrana a 60 ° C per 2 ore, seguita da un DDH 2 O lavaggio. Conservare a -20 ° C o procedi alla ibridazione. </li></ol> 8 Membrana prehybridization <ol><li> Se RNA di carico è stata controllata (passo opzionale 5.5), procedere direttamente al ibridazione. Oppure, asportate a 1 cm dalla parte superiore del filtro di nylon, per evitare sonda trasversale hybridizations a lunghi RNA frazionati. </li><li> Preriscaldare 10 ml di soluzione di ibridazione (HS) a 37 ° C. Denaturare 1 mg di sperma di salmone a 95 ° C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio e aggiungere al HS. </li><li> Incubare il filtro in HS a 37 ° C per almeno 1 ora, in rotazione in un fornetto. Controllare che l&#39;RNA-lato del filtro facce HS. </li></ol> 9 Sonda Sintesi <ol><li> Impostare una reazione in avanti fosfato, il 10 pmol di specifici oligonucleotidi antisenso, come descritto in 4.3. </li><li> Aggiungere 5 volumi di Tris-EDTA-NaCl (TEN) tampone di reazione e purificare il primer marcato da nucleotidi non incorporati mediante cromatografia di esclusione gel su colonne G-25 Sephadex (o anche da EtOH precipitazione). L&#39;attività della sonda può essere valutata scintillazione Contatore Liquid. </li></ol> 10 Membrana Ibridazione <ol><li> Sostituire la HS esaurito con un nuovo 10 ml aliquota (preparata e completato come descritto sopra). Riscaldare la sonda a95 ° C per 10 minuti, raffreddare su ghiaccio e aggiungere al romanzo HS. Incubare il filtro a 37 ° C ON. </li></ol> 11 Membrana di lavaggio <ol><li> Recuperare la soluzione di ibridazione e conservarlo a -20 ° C in una scatola-radioattività di schermatura. </li><li> Sciacquare il filtro in lavaggio Buffer (WB) e lavarlo accuratamente per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un rivelatore Geiger Mueller per il controllo radioattività residua agli angoli del filtro. Quando emissione sfondo è di circa 5 cps, procedere alla membrana esposizione. </li></ol> 12 Rilevamento segnale <ol><li> Esporre il filtro sui film autoradiografia o su uno schermo imager ON molecolare. Rivela segnali di elaborazione fotografica o conversione digitale. </li><li> Analizzare l&#39;intensità della banda da un software dedicato quantificazione (ImageJ o Optiquant). </li></ol> 13 Membrana Stripping <ol><li> Per rimuovere i segnali primari, immergere la membrana in 500 ml di soluzione bollente Spogliarello, Poi incubare a temperatura ambiente per 1 min. Procedere al romanzo (pre) ibridazione o conservare il filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anche se il nostro apprezzamento per il sofisticato intreccio attraverso il quale l&#39;RNA regola la neurogenesi è in continuo aumento, le implicazioni meccanicistiche di circuiterie di RNA che influenzano neurali biologia delle cellule staminali, differenziamento neuronale / integrazione funzionale, sviluppo di patologie neurali e tumori rimangono inesplorate. Il mantenimento di tali reti attraverso regni rende il potenziale dei sistemi genetici come Drosophila melanogaster strumentale per svelare vie cellul...

RNA biochimica ha sperimentato progressi spettacolari negli ultimi anni 1. La nostra comprensione del potenziale RNA nel controllo dell&#39;espressione genica è stata scoppiata dall&#39;identificazione dei potenti non codificanti Ribo-regolatori 2, dalla scoperta di nuovi a base di RNA-meccanismi regolatori 3,4 e da una caratterizzazione più profonda di eventi post-trascrizionali già noti 5. Tutti biologia dell&#39;RNA insieme questi studi hanno permesso di rendere drammaticamente la scena, diventando un importante soggetto di ricerca nel panorama scientifico attuale. In particolare, negli ultimi anni stiamo ottenendo un senso di impatto pervasivo del &quot;mondo RNA&quot; in neurobiologia molecolare 6, uno dei settori di ricerca più dinamiche della moderna scienza della vita. Nell&#39;ultimo decennio del secolo scorso, lo scenario scientifico generale è stata rivoluzionata dalla scoperta del RNA interference 7,8 e dei piccoli RNA regolatori 9,10con particolare riguardo alle microRNA 11, endogenamente espressi piccoli RNA non codificanti implicati nel controllo di quasi tutte le funzioni cellulari come regolatori pleiotropici e combinatorie di espressione genica. Quasi 10 anni dopo la scoperta iniziale miRNA in Caenorhabditis elegans di Ambros e laboratori di Ruvkun, rinnovata attenzione è stata rivolta al campo quando un alto numero di miRNA sono stati identificati in Drosophila e in cellule umane e 12-15. Da allora, grazie ad approcci transgenici versatili, Drosophila melanogaster è distinto come un contesto biologico prezioso per approfondire miRNA biosintesi e di attività. Drosophila miRNA hanno rivelato funzioni distinte in processi specifici insetti o evolutivamente conservati, che vanno dall&#39;invecchiamento al metabolismo, vie di segnalazione , il comportamento e, naturalmente, neurogenesi. Lungo questa direzione, abbiamo recentemente presentato un link romanzo 16 nella co intriganterrelation che si verificano tra il gene maestro GCM / planata e il percorso di RNA. Il fattore di trascrizione mosca Gcm / Glide 17-19 costituisce un esempio unico del destino delle cellule determinante, che condiziona la scelta destino neuronale gliale vs in multipotenti vola precursori neurali 20. Venti anni di lunghe ricerche su questo argomento ha chiaramente sottolineato la presenza di molteplici e sovrapposte ingressi di regolazione dell&#39;espressione genica convergenti su gcm / glide 21-28 per stabilire i livelli di soglia richiesti per bilanciare il delicato rapporto tra controparti neuronali e gliali durante lo sviluppo neurale. Abbiamo scoperto che la regolamentazione tramite DMEL-miR279 il targeting rappresenta un ulteriore livello di controllo che contribuiscono alla post-trascrizionale messa a punto di GCM / espressione 16 planare. Globalmente, queste linee di ricerca sono necessari miglioramenti metodologici specifici: lungo anni, diverse tecnologie sviluppate originariamente per analizzare tradRNA transitorie, sono stati convertiti per quantificare piccoli RNA non codificanti, come come saggi di RNase protection, array di cDNA 29-31, real-time PCR metodi 32-35 e sequenziamento 36,37. Dall&#39;altro lato, ricalibrazione degli approcci tecnici ha favorito continui progressi nel campo. Northern Blot test (NB, o gel RNA blot) costituisce un esempio rappresentativo: è in gran parte utilizzato per il profilo accumulo di RNA, in quanto garantisce sia a livello di espressione quantitativa nonché la determinazione dimensione. Tuttavia, la scarsa sensibilità intrinseca del metodo è limitante quando è applicato a bassa abbondanti espressione genica accordatori, come piccoli RNA. Una conseguenza dannosa è il requisito di grandi quantità di RNA totale, il che rende difficile la sua applicazione a campioni biologici specifici. Per tali ragioni, le varianti NB specifici per il rilevamento di piccoli RNA sono stati sviluppati 38-40: abbiamo approfittato di una migliore proc NBedure 41 (ENB, avanzato Blot Nord), mentre chiarire la suddetta interazione tra DMEL-miR279 e GCM / planata. Questo metodo si basa su un gradino chimica di reticolazione basato sull&#39;attività di un derivato carbodiimmide [1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide, EDC] fissare acido nucleico su supporti solidi. Carbodiimide è un linker croce versatile conosciuta per catalizzare la formazione di legami ammidici tra attivati ​​gruppi carbossilici o fosfato e gruppi amminici 42. Questa proprietà può essere sfruttata per coppia covalentemente piccoli RNA attraverso il loro gruppo 5&#39;-idrossile mono-amino fosforilata a gruppi sulla superficie delle membrane di nylon. La configurazione risultante attaccamento aumenta l&#39;accessibilità dell&#39;acido nucleico immobilizzato e, a sua volta, l&#39;efficienza di ibridazione sonda-bersaglio, che si traduce in notevole miglioramento rilevamento 43. La tecnica assume particolare relevance in studi molecolari Drosophila, dal quale, al verificarsi di nuovi e distintivi classi di piccoli RNA non codificanti sta emergendo 44. Tra questi, rasiRNAs 45,46 costituiscono uno specifico sottotipo di RNA-piwi interagenti (piRNAs 47), coinvolti nella sequenza-specifico silenziamento genico. Dettagli operativi di questo metodo sono descritti e visualizzati in appresso, relative all&#39;analisi del DMEL microRNA-miR279 e DMEL-miR286 e, per la prima volta, di una rasiRNA, rasi4. Abbiamo spinto all&#39;estremo questo metodo, che ci ha permesso rivelare bersagli poco espressi da quantità minime di RNA (meno di 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Gli ultimi decenni hanno visto l&#39;esplosione di interesse scientifico intorno a meccanismi di controllo dell&#39;espressione genica a livello di RNA. Questa branca della biologia molecolare è stato notevolmente alimentata dalla scoperta di RNA non codificanti come principali attori regolazione post-trascrizionale. Tale prospettiva rivoluzionaria è stata accompagnata e innescata dallo sviluppo di tecnologie avanzate per la profilazione dell&#39;espressione RNA breve, sia a livello di high-throughput (identificazione genome-wide) o come l&#39;analisi singolo candidato (accumulo stato stazionario di determinate specie). Anche se diverse strategie state-of-art sono attualmente disponibili per il dosaggio o la visualizzazione di tali molecole in fuga, saggio Northern blot rimane l&#39;approccio ammissibile in biologia molecolare per la valutazione immediata e precisa di espressione dell&#39;RNA. Esso rappresenta un primo passo verso l&#39;applicazione delle più sofisticate tecnologie, costose e, in molti casi, rimane un metodo preferenziale per guadagnare facilmente intuizioniin RNA biologia. Qui PANORAMICA un protocollo efficiente (Enhanced Northern Blot) per rilevare microRNA debolmente espresse (o altre piccole specie di RNA regolatori) da Drosophila melanogaster embrioni interi, sezionato manualmente tessuti / adulti larvali o in cellule coltivate in vitro. È necessaria una quantità molto limitata di RNA e l&#39;uso di materiale dal flusso citometria cellule isolate possono essere anche previsto.

Seguendo la procedura generale descritta nel testo e schematicamente rappresentato in figura 1, abbiamo valutato l&#39;espressione piccoli RNA da campioni di RNA complessi di diversa origine. Nell&#39;esperimento illustrato nella figura 1, l&#39;RNA è stato isolato da di Drosophila Schneider 2 celle di estrazione proteinasi K, controllato per l&#39;integrità (passaggio facoltativo: denaturante di agarosio gel frazionamento) e caricato in doppio. Una metà del gel è stato can...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

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Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...