Gli autori riconoscono la Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgio, G.0601.11) e la KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ e LT beneficiare di una borsa di studio dalla FWO-Vlaanderen.

Nota: Tutte le azioni in cui sono coinvolte cellule devono essere effettuate in un ambiente sterile, lavorando in un flusso laminare. 1. Manutenzione della linea HEK293T cellulare <ol><li> Crescere le cellule HEK293T in un pallone T-75 a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Passaggio cellule quando viene raggiunta una confluenza del 80%. Nota: Questo richiede normalmente 3-4 giorni. Le cellule in coltura continua permettono 20-25 passaggi utilizzabili per lo screening. <ol><li> Posizionare tampone fosfato del Dulbecco (PBS) senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio,-tripsina-etilendiamminotetraacetico PBS acido (EDTA) (500 ml PBS arricchito con 10 ml di soluzione di tripsina-EDTA e 4,5 ml 4% EDTA) e terreno di crescita (500 ml mezzo di Eagle modificato da Dulbecco - alte concentrazioni di glucosio [DMEM] supplementato con 10% di siero fetale bovino [FBS] e 1 mm penicillina-streptomicina [PS]) a temperatura ambiente mezz&#39;ora in anticipo. </li><li> Rimuovereil vecchio terreno di crescita dalle cellule. Risciacquare le cellule morte con 3 ml di PBS e togliere la PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di PBS-tripsina-EDTA, incubare per 1 min a temperatura ambiente e rimuovere la soluzione Nota: La morfologia delle cellule cambierà da a-forma di sfera a forma di stella. </li><li> Allentare le cellule dal fondo del pallone picchiettando leggermente e raccogliere le cellule risciacquando le peggiori diverse volte con 10 ml di terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire 1 ml della coltura cellulare in un nuovo T-75 pallone contenente 14 ml di terreno di coltura fresco, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li></ol></li></ol> 2. Trasfezione transiente delle cellule HEK293T <ol><li> Crescere le cellule HEK293T in un pallone T-75 3 giorni prima del dosaggio effettivo mobilizzazione del calcio avviene. Assicurarsi di utilizzare tre T-75 palloni, uno per trasfezione con il costrutto recettore, una per trasfezione con un vettore vuoto di espressione, come controllo negativo, e one per il controllo trasfezione. Nota: Il passaging delle celle viene eseguita come descritto al punto 1.2. Quando più piastre a 96 pozzetti devono essere schermati, T-150 palloni possono essere utilizzati per ottenere un rendimento più elevato di cellule (per fare questo, doppie tutti i quantitativi indicati nei punti 1.2.5, 2.3, 3.1.3 e 3.1.4) . </li><li> Incubare le beute a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5% per 20-24 ore fino a che le colture cellulari avvicinano 50-70% di confluenza. </li><li> Co-trasfezione una popolazione di cellule con il vettore di espressione codificante la GPCR di interesse e l&#39;Gα 16 costrutto, il secondo pallone con il vettore vuoto e il costrutto Gα 16, e il terzo con il controllo e la trasfezione Gα 16 costrutto. Nota: In questo protocollo, il recettore Drosophila SNPF è stato clonato in un vettore di espressione di mammifero pcDNA3.1 13. JetPRIME stato utilizzato per eseguire la trasfezione, ma altri reagenti di trasfezione può essere utilizzato come bene. <ol><li> Aggiungi aotale di 7,8 mg DNA (3,9 mcg costrutto recettore o vettore vuoto, e 3,9 mg Gα 16 costrutto di espressione) in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 500 ml di buffer JetPRIME. Mescolare bene nel vortex la provetta e centrifugare a breve. </li><li> Aggiungere 37,5 ml di reagente JetPRIME, vortex e centrifugare per 1 minuto a 14.000 x g. Incubare la miscela di trasfezione 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere goccia a goccia la miscela di trasfezione al mezzo di coltura cellulare e assicurarsi di pipettare direttamente nel terreno evitando il contatto con le pareti del pallone di coltura. Incubare le beute a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5% per 20-24 ore. </li></ol></li></ol> 3. Calcio mobilitazione Assay <ol><li> Raccogliere le cellule transfettate e le sementi in, piatti trasparenti con fondo nero con pareti da 96 pozzetti. <ol><li> Posizionare il PBS, PBS-tripsina-EDTA e il supporto di trasferimento DMEM (500 ml DMEM supplementato con 10% FBS dializzatoe 1% PS) a temperatura ambiente mezz&#39;ora in anticipo. </li><li> Rivestire la 96-ben chiare piastre di fondo nero a parete con 60 ml di PBS con fibronectina (0,0025%) per pozzetto (5,85 ml di PBS e 150 microlitri fibronectina [0.1%] per piastra). Incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora con il coperchio. Rimuovere la soluzione dai pozzetti e incubare nuovamente le piastre per 1 ora senza il coperchio a temperatura ambiente. In alternativa, è possibile usare le piastre pre-sensibilizzate per l&#39;adesione delle cellule migliorata. </li><li> Togliere il vecchio mezzo di coltura dalle cellule e lavare le cellule morte off con 3 ml di PBS e rimuovere il PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di PBS-tripsina-EDTA, incubare per 1 minuto, quindi rimuovere la soluzione. Nota: La morfologia delle cellule cambia da stella a forma a sfera a forma di. </li><li> Allentare le cellule dal fondo del pallone picchiettando leggermente e raccoglierli risciacquando più volte con 10 ml di terreno DMEM trasferimento. Trasferire le cellule in una provetta Falcon da 50 ml. </li><li> Contare ilnumero di cellule per ml (eseguita con un NucleoCounter qui, ma una camera di Burker è accettabile). Aggiungere 100 microlitri della coltura cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 100 microlitri di buffer di lisi e mescolare toccando il tubo. Aggiungere 100 microlitri tampone stabilizzante e mescolare toccando. </li><li> Riempire un NucleoCassette con la sospensione cellulare e contare le cellule con il contatore. Moltiplicare il numero di celle da tre, come le cellule sono state diluite di un fattore tre quando si aggiunge la lisi e stabilizzante buffer nel punto 3.1.6. </li><li> Diluire le cellule ad una concentrazione finale di 600.000 cellule / ml e 150 ml di seminare le cellule per pozzetto in piastre rivestite per ottenere una densità cellulare di circa 90.000 cellule per / pozzetto. Evitare bolle d&#39;aria e toccare la piastra per diffondere uniformemente le cellule al fine di ottenere uno strato di cellule contigue. Incubare le piastre a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5% per 16-24 ore. </li></ol></li><li> Caricare le cellule con il colorante fluorescente e preparare il coPiastra mpound. <ol><li> Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / albumina sierica bovina (BSA) buffer: aggiungi 165 microlitri CaCl 2 soluzione stock (1 M CaCl 2 in acqua distillata [dH 2 O] - conservare a temperatura ambiente), Soluzione 500 HEPES microlitri magazzino (1 M HEPES in dH 2 O, pH 7,4 - conservare a temperatura ambiente), e 0,05 g BSA a 50 ml HBSS. Si noti che l&#39;acido grasso libero BSA è utilizzato per le prove di calcio, come acidi grassi possono attivare i recettori specifici, compromettendo il segnale di calcio del recettore di interesse. </li><li> Preparare la soluzione probenecid (100x, 250 mm): sciogliere 0,71 g di probenecid in 5 ml NaOH (1 M) e aggiungere 50 microlitri magazzino HEPES soluzione e 5 ml della / HEPES / Ca 2 + / tampone BSA HBSS - preparare sempre soluzione fresca. Nota: probenecid inibisce trasportatori di anioni inorganici che può rimuovere Fluo-4 dal citoplasma, riducendo così il segnale fluorescente. Si consiglia di eseguire il loading dye inla presenza e l&#39;assenza di probenecid per determinare se trasportatori di anioni inorganici presentano un potenziale problema nelle linee cellulari particolari in esame, come probenecid potrebbe anche diminuire il segnale agonista-mediata. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio: aggiungere 500 microlitri di soluzione probenecid a 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / tampone BSA, regolare il pH a 7,4 e filtrare la soluzione tampone. Sempre preparare tampone fresco, e 50 ml di tampone per è necessaria piatto. </li><li> Preparare una soluzione al 10% di acido Pluronic: mescolare 50 microlitri di acido Pluronic (20% w / v in dimetil-solfossido [DMSO]) con 50 microlitri DMSO - se si verifica la cristallizzazione, il calore a 37 ° C e preparare sempre soluzione fresca. </li><li> Preparare Fluo-4 soluzione AM (1mm): aggiungere 44 ul di soluzione al 10% di acido pluronico di una fiala che contiene 50 mcg Fluo-04:00 e vortex fino a quando non è completamente sciolto. Evitare l&#39;esposizione alla luce per evitare l&#39;imbiancamento del fluoroforo. </li><li> Preparare tampone di caricamento: aggiungere 8.8 ml DMEM Supplemented con HEPES 10 mM e 2,5 mM probenecid (pH 7,4) alla soluzione Fluo-4 AM (44 microlitri) e vortice. Utilizzare sempre tampone fresca. </li><li> Scartare medio dalle cellule, lavare le cellule con 200 microlitri di PBS per pozzetto, e rimuovere PBS. </li><li> Aggiungere 55 microlitri di buffer di caricamento per pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Avvolgere la piastra in alluminio per evitare l&#39;esposizione della piastra alla luce. </li><li> Assicurarsi di asciugare i composti prima schermata se vengono disciolte in solventi che sono dannosi (ad esempio, acetonitrile) per il sistema di espressione cellulare. </li><li> Solubilizzare i peptidi in tampone di lavaggio in provette da 1,5 ml microcentrifuga siliconati. Preparare una serie di diluizioni per eseguire una analisi di concentrazione-risposta e per determinare il valore EC 50 di un ligando. Aggiungere 70 ml di ligando nel corrispondente pozzetto della piastra composto (piastre da 96 pozzetti a V) e comprendono controlli positivi (agonista endogeno) e negativi (tampone di lavaggio) su ciascuna piastra. Non<html> E: Se un composto non è solubile nel tampone di lavaggio, si può provare altri solventi non nocivi per le cellule in esame, come acqua o soluzioni che emulsionare solubilizzano oli e altre sostanze insolubili in acqua (per esempio, Kolliphor EL) . </li><li> Misurare tutti i campioni in triplice copia. Tenere presente che 50 ml di un ligando dal piatto composto saranno trasferiti in un pozzo con 100 microlitri di tampone di lavaggio della piastra di cella durante il dosaggio, così preparare i composti a 3 volte la concentrazione finale desiderata. </li><li> Eliminare il tampone di caricamento dalla piastra di cella e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra 15 min a temperatura ambiente ed evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Eliminare il tampone di lavaggio dalla piastra di cella e aggiungere 100 microlitri nuovo tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra di cella, la piastra di composto, e un rack punta (96 pozzetti, consigli per stazioni pipette) per 15 min a 37 ° C. </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 4. Saggio sul Dispositivo Stazione <ol><li> Creare e caricare il file di protocollo desiderato con il software e attivare l&#39;unità di controllo della temperatura nella camera di lettura. Qui, misurare le risposte di calcio a 37 ° C per 2 min una riga alla volta con 1,52 sec intervallo tra le letture successive (misurazione di una piastra a 96 pozzetti completa richiede circa 25 min) a 525 nm. Impostare l&#39;eccitazione di Fluo-4 488 nm e trasferire un volume totale di 50 microlitri di composto alla piastra di cella, 18 secondi dopo l&#39;inizio lettura, con la velocità di erogazione fissato a 26 ml / sec e un&#39;altezza di pipetta 135 microlitri. </li><li> Posizionare il composto e piastra di cella, e il rack punta nei cassetti appropriati del dispositivo ferroviaria. </li><li> Eseguire una singola lettura della piastra di cella alla stessa lunghezza d&#39;onda di eccitazione ed emissione in modalità ENDPOINT, prima di iniziare lo schermo attuale in modalità FLEX. Nota: Questa misura dà unità di fluorescenza relativa valori (RFU) e consente di rilevare la variabilità tra noills della piastra. Valori compresi tra 20.000 e 40.000 sono considerati accettabili. </li><li> Avviare il test e analizzare i dati con il software. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il calcio dosaggio mobilitazione basato sulla fluorescenza è stato applicato con successo per confermare la caratterizzazione funzionale del sistema di segnalamento peptidergico Drosophila SNPF, che è stata già eseguita da Mertens et al. con un saggio di bioluminescenza e da Feng et al. con un saggio 13,15 elettrofisiologico. I valori di EC 50 ottenuti con il test di fluorescenza nelle cellule HEK293T sono circa 10 volte inferiori a quelli ottenuti con il saggio di bioluminescenza eseguita in cellule CHO (Drome-SNPF-1: fluo = 2.04 nM, lumi = 51 nM; Drome-SNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 Nm; Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0.50 nM, lumi = 75 nM). Queste variazioni possono essere spiegate da diversi fattori, tra cui il fatto che uno dei sistemi di espressione utilizzati può essere più adatto per l&#39;espressione funzionale di un dato recettore, o la piegatura di alcuni recettori può essere meno efficiente in ctipi cellulari alune. I valori di EC 50 di tutte e quattro peptidi Drome-SNPF sono nell&#39;intervallo nanomolare quando testati sulla loro recettore sia con la fluorescenza e il saggio di bioluminescenza, generalmente sostenere la rilevanza fisiologica della loro interazione peptide-recettore in vivo. Si noti che nessun controllo trasfezione con un recettore per cui il ligando attivazione è noto è stato incluso nella schermata presentata qui, perché il sistema di segnalamento Drosophila SNPF è normalmente il controllo trasfezione in apparati sperimentali. Il controllo positivo con un ligando endogeno delle cellule HEK293T (PAR 1) e il controllo negativo (tampone di lavaggio) sono stati inclusi nello schermo. I risultati del PAR 1 hanno dimostrato che le cellule erano in buone condizioni. Il controllo negativo (tampone di lavaggio) non ha provocato un segnale fluorescente, che indica che il mezzo in cui i peptidi sono disciolti era esente da qualsiasi contaminante che potrebbe influence i risultati. Il sistema di segnalazione Drosophila SNPF caratterizzato precedentemente è stato usato qui per spiegare la mobilitazione di calcio saggio basato sulla fluorescenza. A tal fine, serie concentrazione dei ligandi attivanti sono stati testati immediatamente. Tuttavia, quando un recettore orfano è portato a sovraespressione in un saggio di screening per testare una libreria contenente centinaia di composti, si raccomanda di primo schermo con relativamente elevate concentrazioni finali dei leganti (ad es., 10 o 1 mM). In seguito al rilevamento di un composto attivazione, una serie di diluizioni di tale composto può essere analizzato al fine di comporre una curva concentrazione-risposta e per determinare il valore EC 50. Una volta che il ligando attivazione di un recettore è determinato, la via di segnalazione intracellulare può esaminare ulteriormente adattato il protocollo. L&#39;analisi può essere eseguita come descritto sopra, ma senza co-trasfezione del G ^5; 16 subunità. Quando una risposta di calcio è misurata, significa che le coppie recettore endogeno attraverso una Gα q subunità del sistema di espressione cellulare. Quando si osserva alcun segnale fluorescente, possono essere applicati protocolli per misurare i cambiamenti nelle concentrazioni di altri messaggeri secondari (ad es., CAMP). Studi di relazione struttura-attività (SAR) possono anche essere effettuate per definire core sequenza del peptide necessaria per l&#39;attivazione del recettore. Primo, sequenze troncate vengono valutati per definire la minima sequenza aminoacidica del peptide che è ancora in grado di attivare il recettore. Successivamente, i peptidi possono essere testati in cui sistematicamente ogni amminoacido è stato sostituito da un residuo di alanina. Test sintetici serie alanina-sostituzione sul recettore permette di determinare l&#39;importanza di ciascuna delle amminoacidi per l&#39;attivazione del recettore 24,25. Nonostante il suo uso frequente ed effi comprovaticacia, va sottolineato che il saggio qui descritto potrebbe bisogno di alcuni adattamenti per ottenere risultati ottimali per i recettori specifici di interesse. La subunità Gα 16 ha il vantaggio che si lega alla maggior GPCR, ma può anche avere un effetto dominante negativo sui recettori che endogenamente coppia tramite Gα 22 q. In questo caso, può essere utile per testare diverse combinazioni di proteine ​​G durante l&#39;ottimizzazione di un saggio calcio romanzo e di confrontare i risultati Gα recettori accoppiati q-in assenza o presenza di Gα 16. Saggi alternativi che siano indipendenti dalla interazione proteina G per rilevare l&#39;attivazione del recettore possono anche essere eseguite, come la traslocazione di arrestina GFP-etichettata, o la rilevazione delle variazioni di potenziale di membrana (ad es., Dal FLIPR potenziale di membrana Kit Assay). Oltre al Fluo-04:00 qui utilizzato, una vasta gamma di altri fluorofori calcio-sensibili, ciascuno con la propria spettrale e chemicAL proprietà, è disponibile. Il fluoroforo più appropriato può essere selezionato in base alla cella del tipo GPCR e il lettore di piastre disponibili, ma verifica sperimentale è necessario. Le quantità di DNA trasfettate e la necessità rapporto reagente DNA / trasfezione da determinare per ogni combinazione linea del reagente-cell receptor-trasfezione. Infine, va tenuto presente che le cellule in coltura continua consentono solo 20-25 passaggi di utilizzo per eseguire i saggi di screening.

Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) costituiscono uno dei più grandi e più varie famiglie tra tutte le proteine ​​della superficie cellulare. La loro presenza nei vertebrati, invertebrati, piante, lieviti e muffe melma, nonché in protozoi e la prima diploblastic Metazoa indica che GPCR sono tra le molecole più antichi collegati con la trasduzione del segnale 1. I loro ligandi naturali attivazione comprendono una grande varietà di stimoli esterni, tra cui peptidi, ammine biogene, odoranti, glicoproteine, e fotoni 2. Come tali, questi sistemi di segnalazione recettore-ligando sono coinvolte in una grande varietà di processi fisiologici. L&#39;ampio spettro funzionale li rende particolarmente adatti per lo sviluppo di farmaci terapeutici che coprono una vasta gamma di malattie umane. Circa il 50-60% dei bersagli farmacologici attuali sono rappresentati da GPCR 3,4. Oltre alla loro grande importanza nel settore farmaceutico, GPCR sono anche sotto i riflettori per lo sviluppo di unnuova generazione di specie-specifici insetticidi 5,6 e pesticidi in genere. Poiché i ligandi naturali di molti GPCR sono ancora non identificati, sono classificati come GPCR orfani. La deorphanization di questi recettori migliorerà la comprensione dei loro ruoli fisiologici negli organismi e può scoprire bersagli putativi per le nuove applicazioni della droga 7. Dal momento che la genomica, la strategia farmacologia inversa viene ampiamente applicato per la deorphanization dei GPCR 8. L&#39;approccio implica che un recettore orfano viene utilizzato come un &#39;gancio&#39; a &#39;ripescare&#39; il suo ligando attivazione da un estratto biologico o da una libreria di composti sintetici. Il GPCR di interesse è quindi clonato e successivamente trasfettati in un sistema di espressione cellulare. Nei metodi più comunemente utilizzati, l&#39;attivazione del recettore è determinata dai cambiamenti nella concentrazione di molecole secondo messaggero misura 9 </sup&gt;. I principali saggi di screening recettore basano sulle proteine ​​bioluminescenti calcio-sensibili (ad esempio, equorina) 10 o indicatori calcio fluorescenti (ad esempio, Fluo-4) 11. I saggi basati sulla fluorescenza, in cui le cellule che esprimono i recettori sono caricati con un indicatore fluorescente calcio prima dello screening ligando, hanno il vantaggio che essi consentono screening ad alto rendimento grazie alla loro facilità di utilizzo, tempo di lettura breve, e la flessibilità dello screening molteplici recettori orfani su una singola piastra 12. Qui, il calcio test mobilitazione basato sulla fluorescenza è accuratamente descritto ed illustrato dal processo deorphanization della Drosophila melanogaster breve neuropeptide F (SNPF) recettore. Questo sistema di segnalamento neuropeptidergic stato originariamente caratterizzato da Mertens et al. nel 2002 13 con un saggio di bioluminescenza calcio eseguita in ovariche di criceto cinese (CHO)14 e da Feng et al. Nel 2003 con un saggio elettrofisiologico utilizzando ovociti di Xenopus 15. La presenza del sistema di segnalazione SNPF sembra essere limitata al phylum degli Arthropoda, dove è implicato in una vasta gamma di processi compreso il regolamento di alimentazione, la crescita, reazioni di stress, la locomozione, e ritmi circadiani 16. La ricerca sui sistemi di segnalamento neuropeptidergic negli insetti può non solo portare a nuovi bersagli per lo sviluppo di insetticidi, ma la conoscenza del loro funzionamento può anche essere estrapolati verso gli altri organismi, come molti sistemi di segnalamento sono stati generalmente ben conservati nel corso dell&#39;evoluzione 17. Negli ultimi dieci anni, sono stati compiuti grandi progressi nel processo deorphanization di GPCR neuropeptide insetti. Nonostante questi sforzi, solo un piccolo numero di recettori sono stati abbinati al loro legante affine, e carichi di informazioni di sequenza pernuove GPCR orfani è diventato disponibile a causa della forte espansione della genomica 18. La disponibilità di / approcci di screening high-throughput medio, come il calcio mobilitazione test basato sulla fluorescenza, che ha dimostrato di essere una tecnica ampiamente applicata 9,18, è quindi prezioso. Il calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza come qui descritto viene eseguita in 293T rene embrionale umano (HEK293T) linea cellulare e utilizza una sonda fluorescente per determinare le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio all&#39;attivazione recettoriale. Per garantire un&#39;elevata espressione e livelli di traduzione del recettore, una sequenza di consenso Kozak 19 viene aggiunto all&#39;estremità 5 &#39;della sequenza codificante-recettore, che viene successivamente clonato in un vettore di espressione (ad esempio, serie vettore pcDNA per linee cellulari di mammifero). Poiché è difficile prevedere il endogeno proteina G accoppiamento di un GPCR orfano basato su informazioni di sequenzada solo, il secondo molecole messaggere (ad esempio, calcio o cAMP) che sono modulati dopo l&#39;attivazione del recettore spesso rimangono sconosciute prima dell&#39;identificazione ligando. Per aggirare questo problema, promiscui proteine ​​G della famiglia G q (ad esempio, murino Gα 15 o Gα umano 16 [usato qui]) o proteine ​​chimeriche G (ad esempio, Gα qi5) che interagiscono con la maggior parte dei GPCR e inducono il rilascio di calcio può essere co-espressi 20,21,22. Dopo il legame del ligando al suo recettore, il GPCR subisce un cambiamento conformazionale che porta all&#39;attivazione di specifiche vie intracellulari. La guanosina difosfato (GDP) molecola, legata in condizioni di riposo alla subunità Gα 16, sarà sostituito da un trifosfato guanosina (GTP) molecola. Questo provoca la dissociazione della proteina eterotrimerica G in un Gα 16 e Gβγ subunità. La subunità Gα 16 attiva la fosfolipasi C &amp;# 946; (PLCβ), che a sua volta idrolizza il legato alla membrana fosfatidilinositolo bifosfato (PIP 2) con conseguente diacilglicerolo (DAG) e inositolo trifosfato (IP 3). IP 3 si diffonderà in tutto il citoplasma e attiva IP canali del calcio 3-dipendenti presenti nella membrana del reticolo endoplasmatico, che induce il rilascio di calcio nel citoplasma. Il rilascio del calcio su attivazione del recettore avviene in pochi secondi e può essere rilevato da celle di carico prima del saggio di screening con un colorante sensibile al calcio, come Fluo-4 acetossimetilico (AM) 11. Il gruppo estere AM consente il fluoroforo di attraversare la membrana cellulare e viene tagliata fuori dalle esterasi citoplasmatiche volta all&#39;interno della cellula. Di conseguenza, le cariche negative dei coloranti fluorescenti vengono smascherati, impedendole di diffondere fuori dalla cellula e permettendogli di interagire con ioni calcio. Il segnale o fluorescentef Fluo-4 è trascurabile in cellule in condizioni di riposo solo contenenti concentrazioni di calcio nell&#39;intervallo nanomolare. Tuttavia, quando il calcio viene rilasciato in seguito ad attivazione del recettore, il segnale può aumentare concentrazione-dipendente per più di 100 volte, garantendo così un elevato rapporto segnale-rumore. Fluo-4 presenta anche una vasta gamma dinamica della notifica [calcio] intorno a un K d (calcio) di 345 nM, che lo rende adatto per misurare le variazioni di calcio fisiologicamente rilevanti in una vasta gamma di celle. L&#39;eccitazione di Fluo-4 avviene a 488 nm e l&#39;emissione di fluorescenza viene misurata a 525 nm 11. Fluorimetri come il lettore di piastre fluorescenza (FLIPR) 23, il NOVOSTAR, o il FlexStation (per stazioni) 12 sono / sistemi high-throughput medio che consentono aggiunta del composto simultanea e il rilevamento del segnale di Fluo-4 all&#39;attivazione dei recettori per ogni pozzo in una piastra di saggio. Il saggio mobilizzazione del calcio qui descritto si basa sulla stazioneDispositivo 96 pozzetti sistema micropiastra. Il software SoftMax Pro (software) è utilizzato per azionare il dispositivo ferroviaria nonché per l&#39;analisi dei dati. Il programma visualizza subito i risultati come grafici in formato a 96 pozzetti. Pozzi multipli possono essere selezionati contemporaneamente per confrontare i risultati di questi pozzetti nello stesso grafico. Valori dell&#39;unità fluorescente relativa (RFU) di pozzetti in ogni colonna sono misurati contemporaneamente per un periodo di due minuti, partendo prima dell&#39;aggiunta di composti ai pozzetti e continua dopo la misurazione del segnale di fluorescenza dopo l&#39;attivazione del recettore. Tipicamente, l&#39;andamento di una curva agonista allinea con la linea di base fino a un composto attivazione viene aggiunta alle cellule, con un conseguente rapido aumento del segnale fluorescente. L&#39;altezza di picco è correlata con la concentrazione agonista finale nel pozzo. Dopo il picco, il segnale fluorescente scende lentamente verso il livello basale. La misura RFU can essere convertito in curve concentrazione-risposta per determinare il valore EC50 (concentrazione efficace massimale metà) di un ligando. In generale, almeno tre schermi indipendenti, ognuna con tre repliche di una serie di concentrazioni, deve essere eseguita a comporre una curva di concentrazione-risposta affidabile. Si raccomanda di includere diversi controlli positivi e negativi nel disegno sperimentale. Prima di tutto, un controllo trasfezione, cioè l&#39;attuazione di un recettore con un ligando noto, deve essere testato. Ciò consente di verificare se l&#39;agente trasfezione era operativa. Incorporazione di un esperimento di controllo con un agonista di un recettore endogeno della linea cellulare e un controllo negativo (ad esempio, tampone di lavaggio) Si raccomanda inoltre di monitorare la salute e la vitalità delle cellule e di escludere la possibilità che il tampone di lavaggio è stato contaminato con un fattore che potrebbe provocare un auto-fluorerisposta profumo. Agonisti usati sono un peptide derivato dalla proteasi-activated receptor-1 (PAR 1), che agisce come un agonista selettivo PAR 1, o carbacolo, che attiva il recettore dell&#39;acetilcolina. Cellule trasfettate con un vettore di espressione vuota dovrebbero essere testati per escludere che i composti attivi interagiscono con i recettori endogeni della cellula. Ottimizzazione dei diversi parametri descritti nel protocollo di seguito può essere richiesto per sistemi diversi di segnalamento. Una figura schematica del calcio completa mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza è illustrato nella Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale del calcio dosaggio mobilitazione basato sulla fluorescenza. Automatizzato di gestione dei liquidi e fluorescenza simultanea misurazioni vengono effettuate con la stazioneLettore di dispositivo di micropiastre, guidato dal software. Il dispositivo della stazione contiene tre cassetti: uno per la piastra di cella, piatto composto e punta rack. I trasferimenti Pipettatore build-in composti da una colonna della piastra composto alla colonna corrispondente della piastra di cella (passo 1). Ciascun pozzetto della piastra di cella contiene un monostrato di cellule HEK293T che sono state co-trasfettate con il GPCR di interesse e la subunità promiscua Gα 16. Quando un composto attiva il recettore, il Pil Gα 16-bound viene sostituito da GTP. La subunità Gα 16 dissocia successivamente dal complesso Gβγ e attiva la fosfolipasi Cβ (PLCβ), che a sua volta idrolizza fosfatidilinositolo bifosfato (PIP 2) con conseguente diacilglicerolo (DAG) e inositolo trifosfato (IP 3). IP 3 attiva IP canali presenti nella membrana del reticolo endoplasmatico calcio 3-dipendente, inducendo il rilascio di int calcioo il citoplasma. L&#39;interazione di calcio con Fluo-4 (con cui le cellule vengono caricati prima complicare aggiunta) si traduce in un segnale fluorescente (passaggio 2). Il software presenta i risultati come unità di fluorescenza relativa valori (RFU) in funzione del tempo, e altezze correla con la concentrazione del ligando in modo concentrazione-dipendente. Questi dati possono poi essere convertiti in una curva concentrazione-risposta per determinare il valore EC 50 di una coppia ligando-recettore (passaggio 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

Per più di 20 anni, farmacologia inversa è stata la strategia preminente per scoprire i ligandi attivazione di orfani G proteine ​​recettori accoppiati (GPCR). L&#39;inizio di un saggio farmacologia inversa è la clonazione e successiva trasfezione di un GPCR di interesse in un sistema di espressione cellulare. Il recettore eterologo espresso viene poi sfidato con una libreria di composti di ligandi candidati per identificare il ligando (s)-recettore attivazione. Attivazione del recettore può essere valutato dai cambiamenti nella concentrazione di molecole di secondo messaggero del reporter, come il calcio o cAMP misura. Il calcio mobilitazione test basato sulla fluorescenza qui descritto è un mezzo di throughput di uso frequente inversione dosaggio farmacologia. Il GPCR orfano viene transitoriamente espresso in 293T embrionali renali umane (HEK293T) cellule e promiscua Gα 16 costrutto è co-trasfettate. A seguito del legame al ligando, l&#39;attivazione della subunità Gα 16 induce il rilascio di calcio fRom Il reticolo endoplasmatico. Prima dello screening ligando, le cellule che esprimono i recettori sono caricati con un indicatore di calcio fluorescente, Fluo-4 acetossimetilico. Il segnale fluorescente di Fluo-4 è trascurabile in cellule in condizioni di riposo, ma può essere amplificato più di 100 volte sull&#39;interazione con ioni di calcio che vengono rilasciati dopo l&#39;attivazione del recettore. La tecnica descritta non richiede la creazione richiede tempo di linee cellulari stabilmente trasfettate in cui il materiale genetico trasfettate è integrato nel genoma della cellula ospite. Invece, una trasfezione transiente, generando espressione temporanea del gene target, è sufficiente per eseguire il test di screening. La configurazione permette di medio-capacità di proiezione di centinaia di composti. Co-trasfezione del promiscua Gα 16, che si accoppia alla maggior GPCR, permette la via di segnalazione intracellulare da reindirizzare verso il rilascio di calcio, indipendentemente dalla via di segnale nativo in sett endogenoIngs. Le cellule HEK293T sono facili da gestire e hanno dimostrato la loro efficacia nel corso degli anni nel recettore saggi deorphanization. Tuttavia, l&#39;ottimizzazione del saggio per i recettori specifici può rimanere necessaria.

Serie di concentrazioni che vanno da 50 micron a 0.001 nm sono stati testati per tutti e quattro i peptidi Drosophila SNPF (Drome-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) su HEK293T cellule che esprimono il recettore transitoriamente Drosophila SNPF e la subunità promiscua Gα 16. Il GPCR è stato attivato da tutti e quattro i peptidi in concentrazioni finali fino a 0,1 nM, e l&#39;attivazione del recettore era dipendente dalla concentrazione. Figura 2 mostra i grafici corrispondenti a uno dei tre repliche della serie Drome-SNPF-1 concentrazione. Il controllo negativo (tampone di lavaggio) non ha indotto un segnale fluorescente, mentre il controllo positivo (PAR 1 - 1 pM) ha provocato forte attivazione della proteasi endogene-activated receptor-1, portando ad un segnale fluorescente alta (± 30.000 RFU). Va notato che una deviazione dila curva tipica può indicare anomalie. Ad esempio, un aumento costante della curva senza ritornare al basale potrebbe essere collegato ai segnali-non-recettore mediata, come la presenza di ionofori del calcio, o un doppio strato lipidico perturbato causando perdite di calcio. Il software consente l&#39;immissione di formule per determinare la percentuale di attivazione o gli errori standard dei differenti concentrazioni tra gli altri. I dati risultanti vengono usati per comporre preliminari curve concentrazione-risposta per stimare i valori di EC 50, come mostrato per i quattro peptidi Drome-SNPF in Figura 3. Le curve di figura 3 comprendono anche i dati per il controllo negativo in cui la serie di concentrazione i peptidi Drome-SNPF sono stati testati su HEK293T cellule trasfettate con un pcDNA3.1 vettore vuoto. I risultati indicano che l&#39;aggiunta di peptidi a queste cellule non hanno effetto sui recettori endogeni, ma anzi activmangiato il recettore di interesse. Il calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza è stata poi ripetuta tre volte in modo indipendente. Sulla base dei preliminari curve concentrazione-risposta della schermata iniziale, le concentrazioni testate sono state adattate per coprire la gamma dinamica della curva (Figura 4). I valori di EC50 di Drome-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [95% intervallo di confidenza]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5,55 ± 3,95 nm) e Drome-SNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) sono simili, che indica che essi sono ugualmente potenti per attivare il recettore. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Figura 2. Graphical uscita del software per una risposta di fluorescenza mediato da recettore di una serie di concentrazioni. Dodici (concentrazioni finali che vanno da 50 mM a 0.001 nM) of Drome-SNPF-1 peptide sono stati testati sul recettore Drome-SNPF. L&#39;attivazione è espresso in unità di fluorescenza relativa valori (RFU). Il grafico superiore dà i risultati dei sei concentrazioni più alte e grafico inferiore dei sei concentrazioni più basse. Il controllo positivo (+) è PAR 1 (1 micron) e il controllo negativo (-) è tampone di lavaggio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Figura 3. Preliminari curve concentrazione-risposta di peptidi Drosophila SNPF determinata da un singolo calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza. Le curve concentrazione-risposta del recettore Drosophila SNPF transitoriamente espresso in cellule HEK293T per i quattro peptidi Drosophila SNPF sono mostrati in blu. Per i controlli negativi (indicati in rosso), peptidi sono stati testati su HEK293Tcellule trasfettate con un pcDNA3.1 vettore vuoto. Le risposte fluorescenti sono mostrati come relativa (%) al valore massimo (100% di attivazione). Le curve sono il risultato di un esperimento in cui ciascuna serie di concentrazioni è stata misurata in triplicato. Le barre verticali rappresentano gli errori standard della media (SEM), che a volte sono più piccoli i simboli utilizzati (in questo caso, solo i simboli sono raffigurati). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Figura 4. Curve concentrazione-risposta e corrispondenti valori di EC 50 di peptidi Drosophila SNPF determinata da tre saggi mobilizzazione del calcio basato sulla fluorescenza indipendenti. Le curve concentrazione-risposta del recettore Drosopihla SNPF transitoriamente espressi in cellule HEK293T per i quattro peptidi Drosophila SNPF sono il risultato di tre me indipendenteasurements ogni eseguita in triplice copia (n ≥ 9). Le risposte fluorescenti sono mostrati come relativa (%) al valore massimo (100% di attivazione). Gli asterischi indicano le concentrazioni per i quali n ≤ 9. Barre di errore indicano SEM, che a volte sono più piccoli dei simboli utilizzati (in questo caso, solo i simboli sono raffigurati). CE 50 valori sono visualizzati con i loro intervalli di confidenza al 95%.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l&#39;identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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39.4K Views.  KU Leuven.  La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR). 

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In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Ricerca

Biologia

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...