1. standard protocollo operativo 1.1 Impostazione dello strumento e la preparazione dei campioni <ol><li> Collegare lo strumento a un computer con il software Izon Control Suite installata. </li><li> Scegliere la dimensione nanoporo da utilizzare: per le dimensioni e la concentrazione di misurazione EV un NP150 (target gamma di dimensioni 85-300 nm) o NP200 (target gamma di dimensioni 100-400 nm) sono più spesso utilizzati. Quando si lavora con EVs che sono stati isolati utilizzando un protocollo che comporta la rimozione dei veicoli elettrici più grandi, ad esempio facendo passare il campione attraverso un filtro a 220 nm, un poro NP100 (target gamma di dimensioni 70-200 nm) può essere utilizzato. Quando si lavora con veicoli elettrici in un campione biologico o veicoli elettrici isolati utilizzando un protocollo diverso, l&#39;NP200 può essere utilizzato, in quanto sarà intasarsi meno spesso. Altri nanopori come l&#39;NP300 (target range dimensioni 150-600 nm) o il NP400 (gamma di dimensioni di destinazione 200-800 nm), o nanopori ancora più grandi, possono essere utilizzati per grandi tipologie di veicoli elettrici. </li><li> Scegliere il Taratura polistiroloparticelle zione che completano il nanoporo selezionata al punto 1.1.2. Per un NP100, NP150 e NP200 nanopore utilizzano il CPC100, particelle CP100 e CPC200 rispettivamente. Per la stima formato esatto, in modo che le particelle di calibrazione hanno una dimensione simile a quella delle particelle sconosciute. </li><li> Per garantire l&#39;omogeneità delle particelle di taratura, vortice brevemente (30 sec). Facoltativamente, si applicano sonicazione per rimuovere aggregati. </li><li> Diluire le particelle di calibrazione in PBS alla concentrazione di destinazione in un volume di almeno 40 ml. Nota: La concentrazione target varia in base al nanoporo selezionato al punto 1.1.2. Le concentrazioni target sono forniti con i nanopori. </li><li> Applicare e rimuovere direttamente 78 ml di PBS sulla cella fluido inferiore; questo bagnatura del fluido cella inferiore riduce il rischio di formazione di bolle d&#39;aria sotto il nanoporo quando si applica un elettrolita alla cella fluido inferiore quando nanoporo è in posizione. </li><li> Posizionare il nanoporo sui 4 bracci dello strumento. Usale pinze digitali per misurare la distanza tra due bracci opposti e inserire la distanza in mm nel campo di immissione &quot;Stretch&quot; e fare clic su &quot;calibrare stretch&quot; per calibrare il tratto nanoporo. </li><li> Stretch nanoporo a 47 mm, ruotando la ruota lato e quindi aumentando la distanza tra i bracci opposti dello strumento, prima di riapplicare 78 microlitri di PBS alla cella fluido inferiore. Nota: Le interferenze elettriche possono influenzare notevolmente la qualità delle misure. Quando si utilizza un computer portatile per eseguire il software Izon Control Suite, assicurarsi che il computer sia collegato alla rete elettrica con una presa di messa a terra e spina. I telefoni cellulari tenuti vicino allo strumento può anche essere una fonte di interferenze elettriche. Le interferenze elettriche è osservato come i picchi costantemente utilizzate nel corso di base, spesso con quadratico medio (RMS) del rumore&gt; 10 pA. Nota: Quasi ogni buffer può essere utilizzato per diluire le particelle di calibrazione e veicoli elettrici per TrPs caratterizzazionezione. La presenza di sali è un prerequisito per la creazione di una corrente elettrica. Per le misurazioni EV utilizzare PBS come buffer. Particelle di taratura devono essere sempre diluiti nello stesso tampone come i veicoli elettrici per garantire misure accurate. </li></ol> 1.2. Determinare le impostazioni ottimali per la misurazione Nota: Prima della registrazione, è importante per stabilire le impostazioni di misura ottimali. L&#39;entità blocco causato da una particella che passa attraverso il nanoporo dipende dal tratto applicata e la tensione applicata. Per misurazioni affidabili il rumore RMS dovrebbe essere &lt;10 pA e la modalità di blocco grandezza deve essere&gt; 0,1 nA. <ol><li> Posizionare la cella di liquido superiore e schermatura gabbia sul nanoporo e introdurre 40 ml di particelle di taratura diluiti nella cella liquido superiore. Utilizzare la VPM per applicare ≥0.8 kPa pressione positiva. </li><li> Ridurre il tratto applicato lentamente verso 44 millimetri, mentre analizzando gli eventi del blocco causati dalla calibrazioneparticelle. Nota: Quando si riduce il diametro dei pori il movimento delle particelle attraverso il nanoporo sarà meno probabile e quindi il tasso di particelle diminuisce. Tuttavia, a causa della maggiore blocco relativo del poro si verifica un evento di blocco più grande con conseguente miglioramento del rapporto segnale-rumore. Aumentando la tensione può aumentare ulteriormente la grandezza blocco ma può anche aumentare il rumore RMS. </li><li> Ridurre il tratto fino a quando gli eventi del blocco appropriate (Figura 1c) si osservano nel pannello &quot;Signal Trace&quot;. (Mode&gt; 0,1 nA) e il tasso di particella corrispondente è&gt; 100 / min. Nota: Il tasso di particelle è una meno rigorosa cut-off, tuttavia, come misura di almeno 500 particelle sono ideali, i tassi di particelle di &lt;100 / min causeranno la registrazione durata di almeno 5 minuti. Tassi di particelle superiori a 2.000 / min possono comportare misure meno accurate (se presente, diluizione del campione deve essere eseguita). </li></ol> 1.3 Misura di TaraturaParticelle, lavaggio della Cellula Fluid Uper e misurazione del campione <ol><li> In questa sezione EVs dal supernatante di coltura cellulare di glioblastoma multiforme linea cellulare U87-MG / EGFRvIII sono caratterizzati. L&#39;isolamento e la preparazione di questi veicoli elettrici è stato precedentemente descritto e visualizzato 18. </li><li> Posizionare le particelle di calibrazione nella cella liquido superiore. Applicare una pressione (per esempio 0,8 kPa) con il VPM e registrare&gt; 500 particelle. </li><li> Se si esegue una misurazione multi-pressione, aumentare la pressione applicata (per esempio a 1,0 kPa) e registrare un secondo file di calibrazione. Nota: Un minimo di 0,2 kPa differenza è richiesto. </li><li> Rimuovere il campione di calibrazione dalla cella liquido superiore. Lavare la cella fluido superiore 3 volte con 100 microlitri di PBS per rimuovere le particelle residue. Prima dell&#39;introduzione del campione nella cella di fluido superiore, utilizzare il tessuto privo di lanugine per rimuovere eventuali residui di PBS dalla cella liquido superiore. </li><li> Introdurre il campione alla cella del fluido superiore. Assicurarsi che la corrente di base è entro il 3% della corrente di base osservata quando si misurano le particelle di calibrazione. Se non nel raggio di 3%, applicare la strategia descritta di seguito per stabilizzare la corrente di base. Applicare le pressioni esatte applicati alle particelle di taratura e registrare i file di esempio. Nota: il tasso trama particella dovrebbe visualizzare rivelazione di particelle costante (Figura 2a). In caso di improvvisa interruzione di rivelazione di particelle, un improvviso calo della corrente di base, o un improvviso aumento del rumore RMS, il poro potrebbe essere intasato; quindi, mettere in pausa la registrazione. Al fine di ripristinare la linea di base, toccare o torcere il cappuccio schermatura, applicare lo stantuffo, o rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua deionizzata e sostituirlo sullo strumento. Nota: In alternativa, aumentare il tratto nanoporo a 47 mm in combinazione con la pressione massima del VPM per circa 5 min. </li></ol> Analisi dei dati 1.4 <ol><li> Clicca sul &quot;; Analizza scheda Dati &quot;per entrare nella sezione di analisi del software. Elaborare la taratura e file di esempio cliccando col tasto destro del &quot;Lordo Files&quot; e selezionando &quot;Process Files&quot;. </li><li> Fare clic sulla casella di controllo accanto al campione nella colonna &quot;calibrata&quot; per accoppiare i file di esempio per le registrazioni di calibrazione. Selezionare file di esempio e di taratura corrispondenti e fare clic su &quot;OK&quot;. Nota: quando si utilizza l&#39;opzione di calibrazione multi-pressione selezionare la scheda &quot;Calibrazione multi-pressione&quot; a sinistra per paio di campioni multipli per più file di calibrazione. </li><li> Una volta accoppiato con successo, il software Izon Control Suite mostrerà diverse caratteristiche del campione, come una dimensione di distribuzione (Figura 2b), la durata di base, larghezza metà del massimo (FWHM) e una analisi di concentrazione. Facoltativamente: Per ogni campione, i singoli punti dati possono essere esportati come una virgola di file separati. </li></ol> 2.lternative Protocollo - Spiking Campioni con Perline di calibrazione Nota: In generale, la procedura operativa standard può essere utilizzata quando si lavora con veicoli elettrici isolati. Quando si lavora con i veicoli elettrici non isolati in campioni biologici, o preparati isolati di EV contaminati con grandi aggregati proteici, operativo lo strumento può essere impegnativo. Queste sfide sono costituite principalmente da un elevato tasso di nanoporo blocco (improvviso calo della corrente di base), incapacità di recuperare le correnti di base entro il 3% della misura di calibrazione o differenze significative nei tassi di particelle tra campioni identici (Figura 3a). Per i campioni che mostrano queste difficoltà un protocollo alternativo per quantificare i veicoli elettrici è stato sviluppato 17. Questa metodologia si basa sull&#39;introduzione di grandi perle di polistirene taratura nel campione di interesse (Figura 3b). Una procedura dettagliata per questo protocollo alternativo è discusso di seguito. 2.1. CampionePreparazione Nota: Nella preparazione dei campioni utilizzando il metodo alternativo, si desidera stabilire un rapporto EV-a-tallone di circa 1 Inoltre, è essenziale includere un &#39;cordone calibrazione solo&#39; di esempio, per consentire accurata &#39;gating&#39; del perline di calibrazione e per determinare il numero di particelle di fondo (per esempio aggregati proteici) presenti nel buffer. <ol><li> Centrifuga 100 ml di surnatante di coltura cellulare per 7 minuti a 300 xg </li><li> Aggiungere 20 ml di surnatante a 20 ml di PBS e 10 ml di 75 volte diluito 335 nm perle di polistirene (magazzino 7e10 / ml). </li></ol> 2.2. Misurazione del campione <ol><li> Utilizzare la strategia descritta nella sezione 1.2 per determinare le impostazioni ottimali dello strumento. </li><li> Misurare il &#39;tallone di calibrazione solo&#39; campione in primo luogo. Assicurarsi che il rilevamento sfondo di piccole particelle non tallone è il più basso possibile (&lt;10% delle perline). </li><li> Misurare ogni individuo sample volta prima registrazione replica per distribuire fluttuazione condizioni nanopori equamente tra i diversi campioni. Misurare almeno 3 repliche di ogni campione. </li><li> Misurare ancora il &#39;tallone di calibrazione solo&#39; campione dopo aver terminato la registrazione di tutti i campioni. </li></ol> 2.3. Analisi dei dati Nota: Quando si utilizza il protocollo alternativo, uso esclusivo del software Izon Control Suite non è sufficiente per il calcolo della concentrazione. È richiesto software aggiuntivo foglio. Tabella 1 indica un esempio di calcolo concentrazione dei campioni rappresentati nella figura 3. <ol><li> Aprire il &#39;tallone di calibrazione solo&#39; campione e uno o più file di esempio. </li><li> Determinare quale blocco evento dimensione (in nA) può essere usato come un cut-off per la distinzione tra i veicoli elettrici e le perle di polistirene. Determinazione del valore di blocco (nA) corrispondente alla base sinistra della popolazione perle di polistirene ( <strong&gt; Figura 3b). Nota: garantire la parità di impostazione dei bin-dimensioni di tutte le misure (può essere regolata in &quot;ViewSettings&quot; a cui si accede facendo clic sul pulsante &quot;pop-up&quot; di seguito &quot;Blocco Trace individuale&quot;). </li><li> Recuperare i valori del numero totale di particelle per ogni campione facendo clic sulla scheda &quot;Analisi Particle Sommario&quot; del campione. </li><li> Filtrare i set di dati utilizzando il livello di cut-off definito al punto 2.3.2. selezionando l&#39;opzione &quot;Filtro di dati&quot; pop-up. Visualizza solo particelle più piccolo del cut-off. </li><li> Recuperare i valori del numero di EV per ogni campione dalla &quot;Analisi Particle Sommario&quot;. </li><li> Sottrarre la quantità di veicoli elettrici dalle particelle totali per determinare la quantità di perline di calibrazione. </li><li> Determinare il rapporto EV-a-tallone dividendo conte VE dal conte tallone calibrazione. </li><li> Determinare il rapporto medio di sfondo facendo la media dei coefficienti determinati per ciascun &amp;# 8220; bordare solo &quot;campione di calibrazione. Sottrarre il valore di ogni singolo campione. </li><li> Moltiplicare la ratio aggiustato EV-a-tallone dalla concentrazione di perline di calibrazione per determinare la concentrazione di veicoli elettrici per ogni campione. </li><li> Moltiplicare la concentrazione riscontrata nel passo 2.3.9 per il fattore di diluizione EV introdotto con l&#39;aggiunta di perline di calibrazione al campione EV. Nota: Nella configurazione di esempio esempio, la diluizione totale del campione in PBS e perline di calibrazione è 2,5 volte e quindi la concentrazione trovata nel punto 2.3.9 deve essere moltiplicato per 2,5 per determinare la concentrazione del campione EV crudo. </li><li> Calcola le statistiche, come le medie, deviazione standard ed errore standard della media per ogni gruppo di replicati. Nota: in alcuni casi sovrapporsi tra i veicoli elettrici e le perle di polistirene a spillo si osserva. Se è necessaria la correzione per la sottostima della concentrazione EV, campioni senza perle di polistirene a spillo dovrebbero essere misurati. Utilizzare lo stesso cutoff come determinato al punto 2.3.2 per determinare un rapporto di &quot;tallone-a-EV&quot;, per calcolare il rapporto di veicoli elettrici che rientrano nella gamma delle perle di polistirene a spillo. Questo rapporto tallone a EV deve essere aggiunto al rapporto EV-a-tallone determinata nella fase 2.3.8. </li></ol> 2.4. Optional: EV Size Distribution con il metodo alternativo. <ol><li> Aprire una registrazione del campione per due volte nella Suite software di controllo. </li><li> Impostare le opzioni del filtro di uno dei campioni ai soli particelle display più grande rispetto al cut-off sopra determinato. Questo visualizzerà solo le particelle di calibrazione. </li><li> Impostare il campione filtrato a &quot;file di calibrazione&quot; e immettere la dimensione modo di sferette di calibrazione. </li><li> Coppia il file di esempio e il &quot;file di calibrazione&quot; creato nel passaggio 2.4.3 come descritto in 1.4.2. Il file di esempio visualizzerà ora una distribuzione delle dimensioni di entrambi i veicoli elettrici e perline di calibrazione in base sferette di calibrazione a spillo. Nota: L&#39;opera di serieprotocollo ting sarà molto spesso sufficiente per la determinazione della taglia distribuzioni di veicoli elettrici. Talvolta tuttavia, componenti tampone esatte sono sconosciute (per esempio nel plasma o urina) che rende impossibile preparare un campione di sferette di calibrazione nello stesso tampone come gli EV di interesse. Un campione EV a spillo con particelle di calibrazione può essere utilizzato per EV size-stima in queste specifiche condizioni. </li></ol>

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Lo sviluppo del protocollo delineato e la stesura di questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente, in parte, dal cervello Fondazione olandese, Schumacher Kramer Foundation, e Bohnenn Fondo. La produzione di questo video-articolo è stato parzialmente sponsorted da Izon.

I protocolli descritti in questo manoscritto offrono metodologie per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione dei veicoli elettrici che utilizzano TrPs. I principali vantaggi della piattaforma TrPs sono la piccola dimensione del campione, la misurazione di breve durata relativa e l&#39;assenza di manipolazione del campione richiesto. Prerequisito per la misurazione accurata TrPs è quello di mantenere condizioni identiche tra le misurazioni di calibrazione e il campione. Questo comprende l&#39;utilizzo di buffer identici così come le impostazioni dello strumento identiche, come la dimensione nanoporo, la tensione e la pressione applicata. L&#39;originale VPM manca di un meccanismo per la regolazione precisa della pressione applicata, provocando piccole differenze di pressione applicata tra i campioni. Inoltre, l&#39;evaporazione del liquido adescamento della VPM può indurre lievi differenze di pressione durante la misurazione in diversi momenti e la VPM deve quindi spesso essere re-innescato. Queste limitazioni sono state potenzialmente risolti dalla introduzione del VPM2, cheha una scala basato sui click e si basa pressione dell&#39;aria. Il protocollo alternativo descritto in questo manoscritto è particolarmente adatto per la misura di EVs in campioni biologici purificati non 17. Noi crediamo che i componenti tampone, come zuccheri, lipidi, proteine ​​e altri detriti più grandi, può in alcuni casi influenzano le condizioni di misura troppo per il protocollo standard applicabile. L&#39;aggiunta di perline di calibrazione per il campione, piuttosto che il confronto di due misure distinte introduce &#39;di calibrazione in tempo reale&#39;. Questo metodo è particolarmente indicato quando si confrontano i campioni (ad esempio plasma sanguigno di diversi donatori) che hanno diverse e / o sconosciuti contenuti di sfondo fluidici. Sebbene esistano differenze tra i veicoli elettrici e le particelle di polistirene (ad esempio, densità delle particelle e la carica di superficie), modelli teorici e dati sperimentali sottolineare l&#39;usabilità di perle di polistirene per la quantificazione e la dimensione profilatura dei veicoli elettrici,sotto il presupposto che la pressione significativa viene applicata 15,19. Per ridurre al minimo l&#39;influenza di forze elettrocinetiche, si consiglia l&#39;utilizzo del relativamente più grande NP150 / NP200 nanopore e significativa pressione positiva. EV e perline di calibrazione si distinguono per dimensioni. Di conseguenza, il nanoporo deve essere aperto applicando tratto, ad un diametro dove si osserva individuazione dei veicoli elettrici e le particelle più grandi di calibrazione. Dal momento che l&#39;apertura del poro diminuisce la sensibilità verso particelle più piccole, solo SVE più grandi di una certa dimensione sono registrati (spesso EVs&gt; 120 nm utilizzando un cordone di calibrazione 335 nm). Il limite minimo di rilevazione per i veicoli elettrici può essere ridotto a circa 90 nm, utilizzando 203 nm perline di calibrazione su un nanoporo NP150. Tuttavia, questa configurazione potrebbe essere impraticabile quando i veicoli elettrici più grandi inducono frequente intasamento del nanoporo. La presenza di questi veicoli elettrici che ostacolano può forzare l&#39;utilizzo di una configurazione in cui una popolazione di PA, troppo piccolo per reach la soglia di rilevamento, non verrà rilevata. La difficoltà di operare del sistema aumenta quando si cerca di misurare le particelle di dimensioni inferiori a 100 nm di dimensione. In tali casi, il rilevamento può essere migliorata aumentando la concentrazione di sale dell&#39;elettrolito. Un aumento della concentrazione di ioni indurrà relativamente aumento delle grandezze del blocco per le piccole particelle (maggiore rapporto segnale-rumore). La vitalità di questa tecnica per le misurazioni di veicoli elettrici deve essere convalidato, però, come l&#39;aumento delle concentrazioni di sale possono influenzare il volume dei veicoli elettrici. In conclusione, la piattaforma TrPs può essere utilizzata per la quantificazione diretta e dimensioni caratterizzazione dei veicoli elettrici. Dal momento che non è necessario alcun isolamento o manipolazione EV (anticorpo etichettatura vincolante o fluorescente), la piattaforma è adatta per la quantificazione EV diretta nei fluidi biologici. Un protocollo alternativo è previsto che può essere utile per i campioni in cui i componenti tampone inducono significativo di intasamento dei porig eventi, rendendo l&#39;utilizzo affidabile del protocollo standard impraticabile.

Le vescicole di origine cellulare sono molto abbondanti nei fluidi corporei 1. Queste cosiddette vescicole extracellulari (SVE) (50 - 1.000 nm dimensioni) sono formate da una fusione di corpi multi vescicolari con la membrana cellulare o per gemmazione diretta verso l&#39;esterno della membrana cellulare. Negli ultimi anni, l&#39;interesse scientifico nei veicoli elettrici è notevolmente aumentato, con conseguente in una pletora di pubblicazioni EV-focalizzato, in cui nuove funzioni e le caratteristiche dei veicoli elettrici sono descritte 1. EVs sono ora crede di essere coinvolti in una vasta gamma di processi fisiologici e patologici, quali la trasduzione del segnale, regolazione immunitaria, e la coagulazione del sangue 1-4. Nel cancro, veicoli elettrici sembrano giocare un ruolo nella formazione di nicchie premetastatic 5,6, il trasferimento di contenuti pro-cancerose 7,8 e la stimolazione dell&#39;angiogenesi 8. Oltre a questo, i veicoli elettrici sono esplorate come agenti di consegna di agenti terapeutici 9. Nonostante questi desvi-, quantificazione affidabile di veicoli elettrici rimane impegnativo. Tradizionalmente, vengono utilizzati metodi di quantificazione indiretti, che si basano sulla quantificazione del contenuto proteico totale o proteine ​​specifiche. Anche se usato in generale, queste tecniche non tengono conto delle differenze di proteine-per-EV, e non discriminano tra contaminare aggregati proteici e proteine ​​in veicoli elettrici. Inoltre, queste tecniche richiedono isolamento di PA, che in molti casi rende confronto delle concentrazioni EV in campioni biologici impossibile. Pertanto, gli sforzi sono intraprese per sviluppare nuovi metodi che permettono di misurazione più preciso e diretto EV 10. Questo rapporto descrive l&#39;uso di rilevamento dell&#39;impulso resistivo regolabile (TRP) per la quantificazione affidabile e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici. Attualmente, il qNano strumento (Figura 1a) è l&#39;unica piattaforma disponibile in commercio per TrPs. In TrPs, una membrana elastica non conduttiva punteggiato with un poro di dimensioni nanometriche è che separa due cellule del liquido. Una delle cellule del liquido è riempito con il campione di interesse, mentre l&#39;altra cella è riempita con elettrolita libero-particella. Applicando una tensione, si stabilisce un flusso / corrente elettrica ionica, che viene modificato in caso di trasferimento delle particelle attraverso il poro (Figura 1b). L&#39;entità di questo blocco corrente (&#39;impulso resistivo&#39;) è proporzionale al volume della particella 11 (figura 1c). La durata del blocco può essere utilizzato per valutare la zeta-potenziale di particelle, che si basa sulle caratteristiche delle particelle come la carica o la forma 12. Dimensioni profilatura di particelle sconosciute può essere eseguita confrontando gli impulsi resistivi causate dalle particelle sconosciute con gli impulsi resistivi causati da particelle di calibrazione con diametro noto. Oltre alla grandezza di un evento di blocco, il tasso di cui questi si verificano viene misurato. Questo tasso di conteggio relies sulla concentrazione di particelle. Poiché la concentrazione ed il tasso di blocchi sono linearmente proporzionale 13, utilizzando un unico campione di calibrazione con particelle di concentrazione nota e granulometria consente la misurazione della concentrazione di 14 e 11 distribuzione dimensionale di un campione sconosciuto. Il movimento delle particelle attraverso il nanoporo è determinata da forze elettro kinetic- (elettroforesi e elettro-osmotica) e fluidici 15. Utilizzando il modulo di pressione variabile (VPM) una differenza di pressione tra le cellule del liquido può essere indotta da una forza aggiuntiva. L&#39;applicazione di una pressione positiva aumenta il flusso di particelle, che possono essere di beneficio quando la concentrazione di particelle è bassa. Inoltre, la pressione può essere applicata per ridurre l&#39;effetto delle forze elettro-cinetico. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza nanopori con piccolo diametro dei pori relativa (NP100, NP150 e NP200 possibilmente) come spesso utilizzato per la rilevazione dei veicoli elettrici.Per questi nanopori, anche quando applicando una pressione significativa, le forze elettro-cinetica possono, a seconda della carica superficiale delle particelle, rimangono non trascurabile 16. Misurando la velocità delle particelle a molteplici pressioni, un elettro cineticamente corretto, e quindi più accurata, concentrazione EV può essere calcolato. Qui, sono previsti protocolli dettagliati per determinare la distribuzione dimensionale e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo di regolare funzionamento, un approccio alternativo è descritto in cui i campioni vengono diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione 17. Questa tecnica di calibrazione in tempo reale può essere utilizzata per superare alcune delle difficoltà tecniche incontrate quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici, quali urina, plasma e coltura cellulare surnatante, o quando la stabilità del nanoporo per un lungo periodo di tempo di misura non può essere assicurata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

Vescicole extracellulari (SVE), tra cui &#39;microvescicole&#39; e &#39;exosomes&#39;, sono molto abbondanti nei fluidi corporei. Negli ultimi anni si è assistito ad un enorme aumento di interesse per i veicoli elettrici. Veicoli elettrici hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante in vari processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro. Inoltre, i veicoli elettrici hanno un potenziale come agenti terapeutici, ad esempio come veicoli di consegna della droga o come la medicina rigenerativa. A causa delle loro piccole dimensioni (da 50 a 1000 nm) quantificazione accurata e dimensioni profilatura dei veicoli elettrici è tecnicamente impegnativo. Questo protocollo descrive come sintonizzabile tecnologia di rilevamento di impulsi resistivo (TRP), utilizzando il sistema qNano, può essere utilizzato per determinare la concentrazione e le dimensioni dei veicoli elettrici. Il metodo, che si basa sulla rilevazione dei veicoli elettrici su loro trasferimento attraverso un poro di dimensioni nano, è relativamente veloce, è sufficiente l&#39;uso di piccoli volumi di campione e non richiede la purificazione e la concentrazione di veicoli elettrici. Accanto al protocollo regolare funzionamento di un approccio alternativo è descritta utilizzando campioni diluiti con perle di polistirene di dimensioni note e concentrazione. Questo tempo reale tecnica di calibrazione può essere utilizzato per superare ostacoli tecnici rilevato quando si misura EVs direttamente nei fluidi biologici.

Per utilizzare lo strumento TrPs, un nanoporo non conduttivo deve essere collocato sui 4 bracci della macchina (Figura 1a) e una tensione (Figura 1b) deve essere applicata. Una volta stabilita una corrente elettrica di riferimento, impulsi resistivi causati da particelle che passano attraverso il poro verranno rilevate come illustrato nella Figura 1c. Veicoli elettrici sono stati purificati da sovranatante di coltura cellulare della linea cellulare di glioblastoma U87-MG / EGFRvIII da ultracentrifugazione. Un tasso stabile particella-plot si osserva quando si misurano i veicoli elettrici isolati (Figura 2a) su un nanoporo NP100. È richiesto Questo stabile di particelle tasso-plot per una misura della concentrazione EV affidabile. Dopo l&#39;accoppiamento la registrazione EV-campione ad una registrazione di 115 nm perline di calibrazione polistirolo, una distribuzione di dimensione (Figura 2b) e la concentrazione stima della EV-campione può essere ottenuto (dati non riportati). <p class= &quot;&quot;&gt; jove_content veicoli elettrici sono stati anche quantificati direttamente nel glioblastoma coltura cellulare surnatante. Quando si misura EVs in campioni biologici, nanopore intasamento si traduce spesso in interruzioni e / o le fluttuazioni dei tassi di Terreni di particelle (Figrue 3a). Ciò si traduce in stime di concentrazione EV imprecisi. Con chiodare il campione con perle di polistirene di concentrazione e di dimensioni note, un rapporto EV-a-tallone può essere determinata. Figura 3b illustra i risultati ottenuti dopo i picchi cella cultura surnatante con perle di polistirene di 335 nm di dimensione. Si osservano due popolazioni chiare. Le particelle che inducono un blocco di meno di 0,46 nA sono determinati veicoli elettrici, le particelle più grandi sono determinati perle di polistirene. Il rapporto di veicoli elettrici a perle di polistirene viene utilizzata per calcolare la concentrazione grezza di veicoli elettrici (Tabella 1). Figura 3c illustra la stima delle dimensioni delle due popolazioni in base alle perle di polistirene a spillo. La nuova impostazione nanopore usatoconsultati nella rilevazione dei veicoli elettrici&gt; 140 nm di dimensione. Questo può essere abbassata riducendo l&#39;apertura nanoporo, ma questo comporterà anche gli eventi più intasamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: Strumento qNano e modalità di funzionamento. (A) dello strumento fotografico. Un nanoporo è posizionato sullo strumento, separando una cella fluido inferiore da una cellula fluido superiore. Le cellule del liquido sono protette da interferenze elettriche dell&#39;ambiente dal tappo schermatura. (B) Illustrazione delinea rilevamento impulsi resistivo regolabile (TRP). Un nanoporo elastico non-conduttivo sta separando due cellule del liquido. Applicando una tensione di una corrente elettrica viene stabilita attraverso il poro forato nel nanoporo. Come vescicole extracellulari muovono attraverso il nanoporo, il flusso ionico viene alterata e rilevato come un impulso resistivo. Nel TrPs la dimensione del nanoporo apertura può essere sintonizzato (ridotta o aumentata) allungando nanoporo aumentando la distanza tra i bracci opposti dello strumento, o ridurre questa distanza. (C) Esempio illustrativo di impulsi resistivi. La grandezza di un singolo impulso resistivo è proporzionale al volume della particella:. Impulsi più grandi indicano le particelle più grandi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: particelle conta-plot e le dimensioni-distribuzione ottenuta dalla misurazione EV isolati da U87-MG / EGFRvIII colture cellulari surnatante (A) particelle conta-plot che indica il rilevamento complessivo di particelle costante.. Breve riduzione di particrilevazione le è stata osservata tra 80 e 100 secondi di registrazione. Dopo la pausa la registrazione e toccando il tappo di schermatura, la velocità delle particelle è stabilizzata dopo che la registrazione è stata ripresa. (B) La distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati è tracciata dopo la calibrazione del campione non noto (EV) a 115 nm perline di calibrazione polistirolo. (5 nm formato bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: TrPs quantificazione dei veicoli elettrici a celle cultura surnatante utilizzando il protocollo alternativo. (A) tipici appezzamenti di particelle a tasso ottenuti nella misurazione EV direttamente in un fluido biologico. Intasamento dei pori provoca brevi interruzioni e fluttuazioni del tasso di rilevamento delle particelle. Ognitrama rappresenta una misura replica dello stesso campione. grafici (B) Tre replicare size-distribuzione ottenuti dopo i picchi cella cultura surnatante con 335 nm perline di calibrazione polistirolo. Tutte le particelle che inducono un impulso resistivo inferiore a 0,46 nA sono selezionati come i veicoli elettrici. (C) Le perle di polistirene a spillo possono essere utilizzati per ottenere una dimensione-distribuzione del campione. (5 nm formato bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Misurazione </td><td> Calibrazione solo 1 # </td><td> Calibrazione solo 2 # </td><td> Surnatante # 1 </td><td> Surnatante 2 # </td><td> Surnatante # 3 </td></tr><tr><td> Corrente media (nA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Tasso di particelle </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> taglio utilizzata (nA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> Particelle totali </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Vescicole extracellulari </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Perline di calibrazione Spiked </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> EV / perline di calibrazione </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0,772 </td><td> 0,788 </td><td> 0,884 </td></tr><tr><td> Sample - sfondo </td><td></td><td></td><td> 0,765 </td><td> 0,781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Vescicole Extracelullar (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Campione 2.5x diluito </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EV concentrazione Raw (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Esempio di calcolo della concentrazione EV utilizzando il protocollo alternativo Un valore di cut-off è determinato a distinguere i veicoli elettrici da perline di taratura. Successivamente, il numero totale di veicoli elettrici e perline possono essere recuperate. Per ogni misura il rapporto EV-a-tallone viene calcolato. La quantità di particelle di fondo nella elettrolita (per esempio gli aggregati proteici) viene calcolato facendo la media il rapporto EV-a-tallone per le singole misure del &#39;perle di calibrazione solo&#39; del campione. Per ogni campione il rapporto di sfondo viene sottratto dal rapporto ottenuto. Questa regolabile ad rapporto viene moltiplicato per la concentrazione delle sferette di calibrazione nel campione (in questo esempio: 9.33e7 / ml). Per determinare la concentrazione grezza di veicoli elettrici, la concentrazione ottenuto viene moltiplicato per il fattore di diluizione totale veicoli elettrici (in questo esempio: 2.5).

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Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nei processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro o come potenziali agenti terapeutici nella consegna di droga o medicina rigenerativa. Questo protocollo presenta metodi per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione di isolati e non isolati vescicole extracellulari in diversi fluidi con settaggio di rilevamento di impulsi resistivo.

Quantificazione e Size-profiling dei extracellulare vescicole Utilizzando sintonizzabile resistivo Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  Vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nei processi fisiologici e patologici, tra cui la coagulazione, le risposte immunitarie, e il cancro o come potenziali agenti terapeutici nella consegna di droga o medicina rigenerativa. Questo protocollo presenta metodi per la quantificazione e la dimensione caratterizzazione di isolati e non isolati vescicole extracellulari in diversi fluidi con settaggio di rilevamento di impulsi resistivo. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Ricerca

Bioingegneria

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow microago-based sensore per Multiplexed transdermico elettrochimica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparazione di microambienti a matrice extracellulare tunable per valutare schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...