Vorremmo ringraziare Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, e Sonia Garcia per preziosi consigli sul miglioramento della procedura di automazione patch-clamp. Ringraziamo Rajnish Ranjan per la consulenza e l&#39;assistenza con l&#39;implementazione software di valore. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal progetto Synapse UE e in parte dal Programma di Scienza Human Frontiers.

1. Preparazione del materiale <ol><li> Manipolatori di comando da un computer <ol><li> Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232). </li><li> Implementare i comandi per il posizionamento, l&#39;interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione. </li><li> Standardizzare il sistema di riferimento dei manipolatori modo che lo zero è la posizione più vicina possibile rispetto ai motori e movimento positivo è diretto lontano dai motori. </li><li> Posizionare il microscopio nella posizione centrale di 2 mm dal piano focale campione (coordinate [0, 0, 2000]). </li><li> Memorizzare, per ciascun manipolatore, le coordinate locali che consentono alla punta di una pipetta da osservare al centro del campo visivo del microscopio. Questo è il punto di riferimento iniziale per ciascun elettrodo. </li></ol></li><li> Visuaposizioni degli elettrodi. Lize è molto utile essere in grado di monitorare la posizione di ciascun elettrodo durante un esperimento. Una rappresentazione grafica è il modo più intuitivo di realizzare questo. A tal fine i sistemi di riferimento di ciascun elettrodo e quella del microscopio devono corrispondere. Un modo semplice per farlo è: <ol><li> Portare la punta di un elettrodo al centro del campo visivo. </li><li> Memorizzare la posizione su ciascun asse del manipolatore e ciascun asse del microscopio. </li><li> Eseguire con l&#39;asse x del manipolatore relativamente grande movimento (1 mm). </li><li> Individuare la punta ancora una volta muovendo solo il microscopio. </li><li> Calcolare la differenza nella posizione microscopio sin dall&#39;ultimo misurata. Queste sono le proiezioni del movimento dell&#39;asse elettrodo sugli assi microscopio. </li><li> Ripetere i passaggi 2,3-2,5 per gli assi Y e Z del manipolatore elettrodo. Ciò consente una matrice di proiezioni sul microscopio assi da determinare (&lt;strong&gt; Figura 2), detta anche matrice coseno: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Invertire questa matrice per permettere di calcolare i movimenti, in tre dimensioni, richieste dal manipolatore elettrodo per raggiungere una determinata posizione nel microscopio sistema di coordinate: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Utilizzo del punto di riferimento iniziale e la matrice coseno determinare la posizione di ciascun elettrodo di microscopio coordinate. </li><li> Visualizzare graficamente, basato sul microscopio coordinate, la posizione di ciascun elettrodo a intervalli regolari. Abbiamo scelto di utilizzare / C + + librerie di disegno C (GDI +) per disegnare le posizioni degli elettrodi ogni 40 msec. </li><li> Ripetere i punti 1.2.1 - 1.2.7 ogni volta angoli manipolatori vengono modificate o se sono necessari cambiamenti di posizione di alcuni millimetri, ad esempio, quando il tipo di elettrodo viene modificato. </li></ol></li><li> Abilitare la memorizzazione del positions di caratteristiche rilevanti nel tessuto, come le cellule oi punti di riferimento anatomici, in microscopio coordinate. </li><li> Acquisire video e sovrapporre le informazioni pertinenti. <ol><li> Meccanicamente allineare l&#39;asse x del moto del microscopio con l&#39;asse orizzontale della fotocamera microscopio. </li><li> Installare sul computer di un framegrabber con video dal vivo e la capacità di sovrapposizione e di un kit di sviluppo software (SDK). </li><li> Implementare funzionamento display video in tempo reale con l&#39;SDK. </li><li> Convertire il sistema di coordinate microscopio al sistema di riferimento telecamera la traduzione scala appropriato. </li><li> Disegnare le caratteristiche rilevanti in coordinate fotocamera e overlay sul video dal vivo l&#39;immagine risultante a intervalli regolari di circa 40 msec (Figura 3). </li></ol></li><li> Amplificatori di controllo. <ol><li> Utilizzare il software amplificatore per controllare le impostazioni dell&#39;amplificatore dall&#39;interfaccia. </li></ol></li><li> Control oscilloscopi. <ol><li> Collegare gli oscilloscopi al PC tramite porte seriali. </li><li> Determinare la scala dell&#39;oscilloscopio, accoppiamento e risoluzione temporale per le varie fasi della procedura di patch-clamp in voltage-clamp (es elettrodo in bagno, formazione sigillo, configurazione whole-cell) e corrente-clamp. </li><li> Inviare i comandi di impostazione dell&#39;oscilloscopio appropriati ogni volta i comandi di amplificazione vengono emessi dall&#39;interfaccia. </li></ol></li><li> Controllo della pressione pipetta. <ol><li> Assemblare un sistema di controllo pressione secondo la figura 4. <ol><li> Utilizzare un alimentatore 12 V / 5 V per fornire ogni componente elettronico in modo appropriato. </li><li> Collegare l&#39;uscita di una pompa a membrana per il tampone di pressione positiva (un contenitore 100 ml). </li><li> Collegare l&#39;ingresso di una pompa a membrana per il tampone di pressione negativa (un contenitore 100 ml). </li><li> Collegare il tubo titolare pipetta di un sensore di pressione nella pressiori sistema di controllo e una valvola pneumatica che collega al vano pressione principale. </li><li> Collegare ciascuno dei buffer di pressione per una valvola collegata al vano pressione principale. </li><li> Collegare una valvola tra il vano di pressione principale e l&#39;atmosfera. </li><li> Collegare un sensore di pressione al compartimento pressione principale. </li><li> Collegare un sensore di pressione per ogni buffer. </li><li> Collegare il sistema di controllo della pressione per una scheda di acquisizione dati. </li><li> Collegare ogni sensore di pressione ad un ingresso analogico. </li><li> Collegare ogni valvola a un&#39;uscita digitale. </li></ol></li><li> Rimuovere offset da tutti i sensori attraverso le valvole tranne quelli che collegano le pompe a membrana e sottraendo la pressione misurata pressione atmosferica. </li><li> Implementare il controllo della pressione <ol><li> Definire nell&#39;interfaccia un controllo per attivare o disattivare il controllo pressione positiva per ogni pipetta. </li><li> Definire una pressione positiva minima per la pipettas di circa 70 mbar. </li><li> Periodicamente (ogni 0,5 sec) rileva ogni volta la pressione in pipette sotto controllo la pressione attiva scende sotto la soglia impostata. </li><li> Al superamento della soglia aprire il tampone di pressione positiva al vano pressione principale e il vano verso la pipetta in questione durante brevi periodi (20 msec) finché la pressione nelle pipette è sopra la soglia. Chiudere tutte le altre valvole. </li><li> De-attivare un ulteriore controllo pressione viene avviato l&#39;approccio finale verso una cella di interesse. </li></ol></li><li> Applicare una pressione negativa per la formazione di tenuta <ol><li> Chiudere tutte le valvole e aprire la valvola tampone di pressione negativa verso il vano di pressione principale e questo comparto verso la pipetta in questione per tutta la durata dello sperimentatore richiede mantenendo un pulsante premuto. </li></ol></li></ol></li><li> Centralizzare i comandi su un dispositivo di interfaccia umana. <ol><li> Collegare un wirele disponibile in commercioss gamepad al PC. </li><li> Implementare lettura dello stato joystick. Ad esempio, utilizzare le librerie DirectX per C / C + + per eseguire letture ogni 5 msec. </li><li> Confronta stato attuale con lo stato precedente di rilevare che sono stati premuti pulsanti, rilasciato o tenuto premuto dal passo ultima volta. </li><li> Assegnare le funzioni a ciascun pulsante del gamepad. Un esempio di questa mappatura è mostrata in Figura 5. </li></ol></li></ol> 2. Patch-clamp procedura <ol><li> Preparare le fette di cervello della regione di interesse. </li><li> Mettere una fetta cervello di interesse, con la regione di interesse nel centro del range di spostamento del microscopio. </li><li> Selezione delle cellule <ol><li> Identificare le cellule di interesse navigando con il microscopio. Memorizzare la posizione delle celle in base al sistema di coordinate microscopio con un destro del mouse sul display video dal vivo in cima alla cella di interesse. </li&gt; <li> L&#39;interfaccia grafica visualizza le celle selezionate nonché le micropipette per una visione globale e il software aggiungerà un indicatore sulla posizione della cella che verrà sovrapposta alle immagini. Inoltre, l&#39;immagine della cella viene catturata per riferimento futuro nel file &#39;Cella #. Jpg&#39;. </li></ol></li><li> Attribuzione delle cellule di pipette <ol><li> Dopo aver selezionato le cellule di interesse, assegnare pipetta che registrerà ogni cella. L&#39;interfaccia grafica fornisce i controlli di assegnazione che devono essere impostati. Visualizza un&#39;anteprima della configurazione finale selezionando la casella &quot;Visualizza posizioni finali &#39;. </li><li> Selezionare ogni pipetta per i quali l&#39;anteprima posizione finale è desiderato o selezionare la casella di controllo &#39;Seleziona tutto&#39;. Disattivare la visualizzazione della posizione corrente per una migliore visualizzazione, se necessario. </li></ol></li><li> Preparare le Pipettes <ol><li> Riempire le pipette (6-8 mW di solito sono migliori se si utilizzano molte pipette) with soluzione intracellulare e caricarli nelle loro proprietari. Mettere le headstages nelle loro fissazioni, ma non farle scorrere in avanti per evitare di toccare la vasca da bagno con la punta della pipetta. </li><li> Abilitare il controllo della pressione positiva e selezionare tutte le pipette per assicurare che le punte rimarranno puliti. Far scorrere delicatamente ogni headstage a posto. </li></ol></li><li> Individuazione dei puntali delle pipette <ol><li> Posizionare il microscopio in una posizione centrale, con messa a fuoco 3 mm sopra la fetta premendo il tasto R2 mentre si tiene il tasto &#39;A&#39;. Utilizzare la posizione corrispondente per ogni manipolatore come memorizzato dal precedente esperimento premendo il tasto L2 tenendo premuto il pulsante A. Nota: A questo punto non ci dovrebbero essere né ombra distintivo di una pipetta in vista o un piccolo movimento lungo l&#39;asse della pipetta dovrebbe essere sufficiente osservare che nella maggioranza dei casi. Compensazione per le lievi differenze di forma pipetta deve essere effettuata manualmente. </li><li> Portare la punta della pipetta a fuoco. Posizionare la punta sul punto centrale rosso del display video senza spostare il microscopio (dovrebbe essere ancora in posizione [0, 0 2000]). </li><li> Informare il software che la pipetta è al centro del display premendo il tasto Z tenendo premuto il tasto C. Dopo ogni punta della pipetta si trova, inviare tale pipetta all&#39;indietro in modo che il successivo può essere posizionato premendo il tasto L1 tenendo premuto il pulsante A. </li></ol></li><li> Avvicinandosi le cellule <ol><li> Una volta che tutti i puntali delle pipette sono stati localizzati con precisione e ogni pipetta viene attribuito a una cella, posizionare automaticamente le pipette vicino alle loro rispettive celle. Basta fare clic destro nel centro del gruppo di celle e selezionare l&#39;opzione &#39;Cluster&#39; nel menu a comparsa. Nella finestra delle opzioni del cluster che apparirà, selezionare tutte le pipette che si desidera posizionare in questo periodo e clicca su &#39;Vai con tutte le pipette controllati&#39;. Ripetere questa operazione per ogni cluster di cellule di interesse. </li><li> Perform l&#39;approccio finale manualmente. La posizione delle pipette relativi alle cellule può essere specificato in modo diverso, ma di solito è semplicemente 200 micron dalla cella nell&#39;asse della pipetta e 200 micron superiore nella direzione verticale, che è sufficiente a mantenere la punta della pipetta fuori del tessuto . Attendere che il posizionamento delle pipette è finito e spostare il microscopio verso una pipetta premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto C. </li><li> Ricalibrare ogni posizione pipetta puntando il microscopio sulla punta in qualsiasi parte del display video e premendo il tasto B mentre si tiene il pulsante C. Una griglia quadrata dovrebbe brevemente indica la posizione individuata della pipetta. Se la posizione non è corretta, posizionare la punta sul punto centrale del display video e premere il pulsante Z tenendo premuto il tasto C. </li></ol></li><li> Stabilire la configurazione cell-attached <ol><li> Verificare che la cella di interesse per la pipetta corrente è correttomarcata. In caso contrario, spostare il microscopio per abbinare la cella di interesse con il puntino rosso centrale. Segna la cella premendo il tasto Y mentre si tiene il pulsante C. Premere il tasto L2 tenendo premuto il tasto C per posizionare la pipetta 200 micron di distanza dal suo cellulare assegnata, il microscopio si sposterà automaticamente nella posizione corrispondente. </li><li> Regolare la posizione della pipetta in modo che corrisponda il punto rosso. Regolare l&#39;offset premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto X. pipetta </li><li> Attivare l&#39;impulso di test premendo il tasto L1 tenendo premuto il tasto X. lentamente avvicinare la pipetta alla sua cellula attribuito. </li><li> Osservando la formazione di una fossetta sulla superficie della membrana della cellula applicare un breve impulso di pressione negativa premendo il tasto Y tenendo premuto il pulsante Z per consentire la pressione applicata per raggiungere la cella. Un potenziale di circa-65mV possesso dovrebbe istituito a questo punto premendo il tasto L2 tenendo premuto il tasto X. </li></ol></li><li> Configurazione whole-cell<ol><li> Una volta che un Giga-sigillo è formato per ogni cella, iniziare la rottura delle membrane applicando pressione negativa. </li></ol></li><li> Eseguire le registrazioni <ol><li> Utilizzare il sistema di stimolazione / acquisizione di effettuare le registrazioni. Applicare impulsi o treni di impulsi in un&#39;unica singola cella alla volta e osservare risposte delle cellule rimanenti per mappare connettività tra le cellule registrati. </li></ol></li><li> Recedere pipette <ol><li> Una volta che le registrazioni sono finite, recedere pipette lentamente dal tessuto facendo clic destro sulla radio-pulsante Tabella. Selezionare &#39;recedere-&gt; Pipettes 500 micron&#39; di avere le pipette retrocedono a breve distanza lungo i loro assi. Osservare la deriva del potenziale delle cellule (compensazione i consigli applicando una certa pressione positiva può aiutare). </li><li> Per recedere pipette per tutto il tragitto, impostare la velocità di posizionamento di &#39;Fast&#39; e ripetere la stessa operazione, ma scegliere l&#39;opzione &#39;All&#39;. Rimuovere l&#39;usatopipette scorrendo le headstages e svitando le pipette da parte dei titolari. E &#39;utile per evitare torsioni titolari nelle loro prese poiché questo potrebbe notevolmente interferire con la posizione della punta della pipetta. </li></ol></li></ol>

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	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per...

La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell&#39;attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte altre applicazioni possono essere concepite per un tale sistema, si presta particolarmente bene allo studio della connettività sinaptica dato che il numero di possibili connessioni all&#39;interno di un gruppo di neuroni cresce proporzionalmente al quadrato del numero di neuroni in questione. Pertanto, mentre un sistema a tre elettrodi consente di testare l&#39;verificarsi di fino a sei connessioni e più spesso registrando una sola, registrazione dodici neuroni consente di testare la presenza di fino a 132 connessioni e frequentemente osservando oltre un dozzina (Figura 1). L&#39;osservazione di decine di connessioni contemporaneamente rende possibile analizzare l&#39;organizzazione delle piccole reti e dedurre le proprietà statistiche della struttura di rete che non può essere sondato altrimenti 1. Inoltre, la stimolazione precisa di numerose cellule permette anche la quantificazione del reclutamento di cellule postsinaptici 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell&#39;attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l&#39;approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in ​​mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.

Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6. La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-soma...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l&#39;automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni. 

Video: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Ricerca

Neuroscienze

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasi Vesicle Preparazione e tecnica per permettere Bloccare Registrazioni patch di membrane delle vescicole submitocondriali

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.