La microscopia TIRF a disco rotante può essere uno strumento utile per studiare il ruolo delle proteine durante la formazione della rete citoscheletricha. Questa tecnica ha permesso l'imaging tridimensionale di approcci cellulari veloci che si verificano nella cellula e allo stesso tempo la localizzazione precisa della molecola di fluorescenza che viene posizionata sulla membrana plasmatica. Questo metodo può fornire informazioni su aree di ricerca come la microbiologia, la biologia cellulare e tutti quei rami in cui è importante studiare l'interazione tra la membrana plasmatica e l'ambiente cellulare.
Questo metodo può essere esteso a quegli esperimenti di imaging dal vivo in cui è importante localizzare le strutture nella membrana plasmatica e dove si desidera anche mantenere un'alta risoluzione del volume cellulare rimanente. Le cose cruciali che bisogna considerare sono la scelta della linea cellulare corretta per impostare l'illuminazione TIRF e gli altri parametri di imaging e per trovare il fuoco delle cellule trasfette. La dimostrazione visiva di questo protocollo aiuterebbe certamente ad evitare problemi con la gestione delle celle durante l'acquisizione dell'immagine.
Due giorni prima dell'esperimento, semina 3.000 cellule HELA o NIH 3T3 in due millilitri di mezzo di piena crescita in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi. Il giorno dopo, prepara i reagenti di trasfezione. In primo luogo, diluire un microgrammo di Livact RFP e un microgrammo di YFP Vinculin in un totale di 200 microlitri di mezzo siero ridotto.
Vortice brevemente il reagente di trasfezione. Quindi aggiungere quattro microlitri della miscela a 200 microlitri di DNA. Vortice di nuovo i reagenti e quindi incubare la miscela di trasfezione per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, aggiungere l'intero mix di trasfezione direttamente alle cellule. Mescolare i pozzi scuotendo il piatto e quindi riposizionare nell'incubatrice. Il giorno dell'esperimento, preparare il campione per l'imaging vivo rivestendo prima un piatto inferiore in vetro da 35 millimetri con una soluzione di fibronectina in PBS da 10 microgrammi per millilitro.
Lasciare la soluzione sulla superficie del vetro per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuoverla e lasciare asciugare l'aria del piatto. Successivamente, diluire una soluzione di perline multi fluorescenti di 0,1 micron di diametro a una densità di 1,8 miliardi di particelle per millilitro in acqua distillata. Aggiungere la soluzione alla superficie in vetro rivestita con fibronectina per 30-60 secondi.
Quindi rimuovere la soluzione e lasciare asciugare l'aria del piatto. Il prerivestimento dei piatti con perline fluorescenti è necessario solo per due motivi, in primo luogo se si desidera trovare il piano TIRF prima di seminare le celle o acquisire un'immagine di perline bicolore per la registrazione dell'immagine. Ora prepara un mezzo di crescita antiossidante aggiungendo soluzione di acido ascorbico molare 0,1 ad una concentrazione finale di 0,1 millimolare nel mezzo di crescita.
Prewarm il supporto posizionandolo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare le celle con due millilitri di PBS e aggiungere 250 microlitri di Trypsin EDTA ad ogni pozzo della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e attendere da due a tre minuti fino a quando le cellule non sono completamente staccate.
Rimostrare accuratamente le cellule in un millilitro di mezzo di crescita antiossidante prebellico e aggiungerle ad altri quattro millilitri del mezzo in un tubo di coltura cellulare da 15 millilitri. Posizionare la sospensione cellulare con un coperchio leggermente aperto in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius tamponato con anidride carbonica al 5%. Per iniziare, inizia il controllo ambientale del microscopio per ottenere condizioni di coltura cellulare stabili.
Quindi posizionare il piatto inferiore di vetro contenente un millilitro di mezzo di crescita antiossidante prebellico nel portacampioni del microscopio preriscaldato. Successivamente, nel software di imaging, impostare le impostazioni di acquisizione al microscopio. Impostare l'intervallo di tempo di acquisizione su 30 secondi e la durata su 60-90 minuti.
Inoltre, attiva la funzione di messa a fuoco automatica dell'autofocus basato su hardware per ogni punto di tempo impostando il valore su uno. Ora regola l'esposizione della fotocamera a 200 millisecondi, il livello di guadagno a 500 e la potenza del laser al 20% per ogni canale. Si consigliano alti livelli di guadagno, basso tempo di esposizione e bassa potenza laser per ridurre la fototossicità.
Quindi, impostare lo Z-stack per i canali del disco rotante su 10 micron con spaziatura di 0,4 micron, quindi impostare l'offset inferiore su zero in modo che il piano più basso sia la posizione di messa a fuoco dell'autofocus hardware e disattivare gli Z-stack per i canali TIRF. Infine, attivare le posizioni dello stadio della funzione multi-punto. Ciò consentirà di registrare fino a tre posizioni su un intervallo di 30 secondi.
Ora trova le perline fluorescenti con illuminazione epifluorescente, attiva un canale TIRF e imposta l'angolo di illuminazione su un valore che denota illuminazione TIRF. Quindi, attiva l'autofocus premendo il pulsante sul pannello del microscopio e regola la messa a fuoco con la ruota offset. Una volta a fuoco, acquisire un set di dati bicolore utilizzando TIRF 488 e TIRF 561 per la successiva registrazione delle immagini basata su perline.
Rimuovere le cellule dall'incubatore e mescolare la sospensione cellulare invertendo il tubo chiuso da due a tre volte. Quindi applicare un millilitro delle cellule sul piatto di imaging. Trova rapidamente doppie cellule trasfette con illuminazione epifluorescente a basso livello.
Una volta trovate, centrare le celle nell'anteprima della fotocamera dal vivo utilizzando l'illuminazione a campo luminoso e contrassegnare la posizione. Quindi trova altri uno o due punti di interesse, salvali nell'elenco delle posizioni e inizia l'acquisizione dei dati facendo clic sul pulsante di sequenza. All'inizio, le cellule possono facilmente staccarsi a causa del movimento dello stadio, quindi è meglio impostare da quattro a cinque posizioni e successivamente scartare una o due.
Al fine di generare un hyperstack senza registrazione nelle Fiji, prima scaricare e salvare il file fornito SD-TIRF_helper_jove. ijm nelle macro della sottocartella Fiji. Eseguire la macro facendo clic sul comando di menu a partire dai plug-in, quindi dalle macro e infine dall'esecuzione.
Se i canali di colore necessitano di una correzione di registrazione, selezionare l'opzione e creare un nuovo riferimento di registrazione basato su perline noto come file di riferimento. Successivamente, importare i dati con l'utilità di importazione dei bioformati e scegliere hyperstack come opzione di visualizzazione. Caricare il set di dati dell'immagine, selezionare la serie di dischi rotanti nel primo passaggio e la serie TIRF nel secondo passaggio.
A questo punto, fiji mostrerà i dati ordinati per canale e posizione del palco. Applicare la correzione di registrazione ai rispettivi canali caricando il file di riferimento predeterminato. Quindi selezionare la tabella di ricerca dei colori desiderata per ogni disco rotante e canale TIRF e unirli in un unico iperstack multidimensionale.
Durante l'elaborazione delle immagini TIRF, un certo numero di piani zed viene aggiunto al piano inferiore e questo numero corrisponde al numero di piani nei set di dati del disco rotante. Questo è molto importante per la rappresentazione visiva dell'iperstack finale. Utilizzando la configurazione descritta in questo video, sono state selezionate le celle che esprimono YFP e RFP e il loro processo di adesione è stato osservato durante un timelapse di 60 minuti.
Come previsto, le cellule erano di forma rotonda e solo debolmente aderenti all'inizio con sporgenze di membrana che rilevavano l'ambiente e rendevano il contatto con il substrato. Il contatto della matrice cellulare si rafforzò rapidamente dopo la formazione delle cosiddette adesioni nascenti. Nel corso del tempo, i complessi di adesione si sono allargati e maturati ad aderenze focali.
Queste strutture allungate erano prevalentemente evidenti alla periferia della cellula. Ciò è il risultato di forze che sono state esercitate da fibre di actomiosina che hanno indotto il rafforzamento delle aderenze della matrice cellulare e l'aggregazione delle fibre di actina. La cellula si è anche appiattita a causa della formazione della rete actin.
La velocità di acquisizione dipende dai seguenti parametri, dall'intervallo di tempo, dal tempo di esposizione, dal numero di piani zed e dal numero di posizioni. Quindi è molto importante ottimizzare questi parametri per alti tassi di acquisizione. L'implementazione della più recente tecnologia del disco rotante trasformerà la microscopia TIRF del disco rotante in una nuova tecnica di microscopia a super risoluzione che consentirà l'imaging ad alte velocità temporali.
La microscopia a disco rotante è una tecnica molto potente per lo studio dei processi che si verificano tra l'interno della cellula e la membrana cellulare. Ci è stato dimostrato che possiamo seguire la dinamica della vescicola acquisendo pile di immagini molto grandi in pochi secondi. La luce laser collimata è pericolosa per gli occhi.
Non guardare mai direttamente nel fascio e utilizzare le precauzioni di sicurezza dello strumento per evitare l'esposizione diretta alla luce.
